泽普油田石油降解菌株的初步研究-
编号
学士学位论文
泽普油田石油降解菌株的初步研
究
学生姓名：崔楠
学号：20070306006
系部：生命与环境科学系
专业：环境科学
年级：2007
指导教师：易霞
完成日期：2011 年 5 月 3 日
中文摘要
基于稀释平板涂布法、生理生化实验和溶血实验，本研究从泽普油田土壤中分离和初步鉴定了1株石油降解细菌。同时，本研究通过紫外光谱和HPLC对原油发酵培养的石油降解菌株进行了降解能力的分析。结果表明，分离到的石油降解菌株对原油有一定的降解能力。因此，本研究将对泽普油田，乃至新疆其他油田残留石油的生物去除提供理论依据，同时也将推动该地区基础和有用微生物的研究和开发。
关键词：泽普油田；石油降解菌株；紫外光谱；HPLC
The Primary Study of Petroleum-degrading Isolates
of Zepu Oil Field
Abstract
Based on the method of diluting and plating, physiological and biochemical experiment and hemolysis test, it screened and identified an oil-degrading isolate from soil in Zepu oil-field. Meanwhile, it studied the capacity of oil-degrading using fermenting medium by the isolate by ultraviolet spectrum and high-performance liquid chromatography. It showed that the isolate could degrade crude oil. So, it would provide the theoretical basis for biological removal for Zepu oil-field and other ones. And it also would promote the fundermental study and the study and exploration of the useful microorganism.
Key words: Zepu oil-field; Petroleum-degrading isolate; Ultraviolet spectrum; High-performance liquid chromatography.
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目 录
中文摘要 (1)
ABSTRACT (1)
引言 (2)
2 材料和方法 (4)
2.1 材料 (4)
2.1.1样品来源 (4)
2.1.2 培养基 (4)
2.1.3实验仪器 (4)
2.2 方法 (5)
2.2.1 采样 (5)
2.2.2 分离方法 (5)
2.2.3 微生物的培养 (6)
2.2.4 石油降解菌株的形态学观察 (6)
2.2.5溶血实验 (6)
2.2.6 排油圈法 (6)
2.2.7 原油黏度的测定 (6)
2.2.8 原油降解产物的紫外光谱分析 (8)
2.2.9 原油降解产物的HPLC 分析 (8)
3 结果与讨论 (9)
3.1 石油降解菌株分离的鉴定 (9)
3.2 溶血实验 (9)
3.3 排油圈检测 (9)
3.4 原油黏度测定 (9)
3.5降解产物的紫外光谱检测 (10)
3.6 降解产物的HPLC 检测 (12)
4 展望 (15)
参考文献 (15)
附录 (17)
致谢 (18)
2 引言
随着经济和社会的迅速发展，石油及其制品广泛地应用于国民经济的各个领域和人类的日常生活中，油类在开采、储存、运输、加工和应用过程中的泄漏和排放对环境的污染也日趋严重。石油进入水体会对水环境造成严重污染。目前在石油污染的治理中，采取的技术有物理、化学和生物方法。用物理方法很难去除表面油膜和水中溶解的油。而化学法实际是向水体中加入化学试剂，存在二次污染。微生物方法可去除表面油膜和水中溶解的油，且费用相对于物理法和化学法低，被公认为是安全、有效、成本低廉的方法，具有广阔的前景。随着现代石油工业的发展，石油的环境污染问题越来越突出，微生物修复技术被公认为是治理石油污染的较好方法，研究发现获得高效、广谱、稳定、适应性强的石油降解菌株以及配套治理工艺是利用该技术进行石油污染的较好方法。
生物降解国外开展的比较早。最早的是1964年美国海洋微生物学家Zobell ，利用浓度为1.0g/100cm 3原油和润滑油进行海洋细菌降解石油烃速率研究，结果显示在添加氮和磷营养盐条件下降解速率为 4.00×10-13-3.18×10-11mg/(cell·h )[1]。此后，国外的研究工作者大量开展了除油微生物种类多样性的研究。许多能降解石油烃的细菌、放线菌株、真菌被分离和鉴定出来。在石油烃的代谢机理方面，1978年，Ratledg 就土壤中微生物对烷烃的利用以及烃的代谢作用等方面作了综述[2]。1979年，Aurich 总结了烷烃细菌代谢作用的生物化学过程[3]
。1981年，Rehm 和Reiff 广泛总结了土壤中各种烷烃代谢作用的产物[4]。近年来该领域的研究工作主要集中于修复技术的开发和影响因素优化方面。1992年，Hogg 等在新西兰成功地就用生物通风技术对含有有机污染物的土壤进行了修复，土壤中石油的浓度减少了92%[5]。1997年，Sugiura 等研究了菌株Acinetobacter sp.T4，8mS 在不同温度下对四种原油降解的影响，20℃时对阿拉伯轻油、Dubai 原油、Shengai 原油、Maya 原油的降解率分别为20-34%，14-27%，14-25%，12-19%[6]。
我国对石油污染的微生物降解研究较晚。但随着我国石油工业的发展，受石油污染的土地面积不断扩大，污染程度也日趋严重。为此我国的科研工作者也开展了大量的研究工作。2001年何良菊等利用从辽河油田分离出石油烃降解
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菌，采用生物泥浆法，研究了土壤中石油烃污染物生物降解过程中营养物质供给的平衡关系及其影响降解的机理[7]。2005年，武汉大学郑金秀等从石油化工厂附近的污染土壤中分离到三株石油降解菌w 1、w 2和w 3；并将w 1和w 2进行紫外诱变得到诱变菌，对诱变前后的菌株进行石油降解实验，结果表明，诱变前的菌株在原油浓度为4000mg/L 培养液中培养10d ，原油的降解率分别为74.34％和77.58％。而诱变菌株10d 降解率达到了79.9%和87.3%。同时，诱变菌株还大大提高了菌株对高浓度石油的耐受能力[8]。2006年。天津科技大学田胜艳等，从天津临港工业区潮间带筛选分离出17株石油烃降解菌对柴油和芳香族化合物具有降解作用[9]。自然界中就存在着多种石油降解微生物。目前，已报道诸如rhodococcus rhodochrous, pseudomonas, alicaligenes, rhodococcus erythropolis, acinetobacter, devouroil 等能够降解原油的菌种，Vecchioli GI 报道了通过添加土著微生物增强石油降解的能力。
石油的开采和海上运输业的发展，使石油泄漏事故逐年增多，受污染的海域范围不断扩展。自1969年发生第一次超级油船失事以来，世界上已有超过40处大的海洋泄漏，据估计每年都有千万公吨以上的石油污染世界海洋，对生物和生态环境造成了很大危害。
石油污染日益严重，石油类物质进入土壤后，改变了土壤的有机质的组成和结构，从而影响了土壤微生物的生长和生长繁殖，引起土壤微生物群落、微生物区系的变化，大量的石油不仅堵塞土壤结构孔隙，对微生物有抑制作用，阻碍了土壤微生物活性。石油进入水体，不仅污染水体，而且通过食物链会危害到人类的健康。石油污染问题引起了人们越来越多的关注，对之进行治理也成为了最迫切的事情。在治理中产生的生物降解方法的研究虽仍有很大争论,但也已取得了一些成果，而且有种趋势是天然微生物的生物降解作用已成为消除环境中石油烃类污染的主要机制。
泽普石油化工厂工程是“七五”期间国家重点扶贫工程，是新疆维吾尔自治区二级企业，是一座现代化程度很高的石油化工中型联合企业。主要产品有原油、天然气年产5亿m 3，化肥年生产能力50万t ，原油年加工能力2005年将达到50t 。但是，泽普油田在很大程度上存在石油对大气和土壤的污染。
目前，对新疆泽普油田微生物和石油降解菌株的研究尚属空白。本研究基于稀释平板涂布法、生理生化实验、溶血试验，本研究对泽普油田土样中的原油
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降解微生物进行分离和初步鉴定。同时，本研究还通过紫外光谱法和HPLC 对原油发酵培养的原油降解菌株进行了降解能力的分析。结果表明，该样品中分离到了原油降解菌株。紫外光谱法和HPLC 的实验结果也进一步表明，分离的原油降解菌株对原油有一定的降解能力。因此，本研究将对泽普油田，乃至新疆其他石油的生物去除提供理论依据，同时也将推动该地区基础和有用微生物的研究和开发。
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1样品来源
泽普油田的土样
2.1.2 培养基
富集培养基（g/l ）：NaCl 0.5，(NH 4)2SO 4 0.1， MgSO 4 0.025，NaNO 3 0.2， KH 2PO 4 1.0，石油 5.0，pH7.0。
血琼脂平板培养基[10]（g/l ）：酵母膏3，蛋白胨10，NaCl 10，Na 2HPO 4 5，甘露醇10，结晶紫0.001，琼脂粉15，蒸馏水1l 。加热30min （不必高压），待冷至45℃左右时加入新鲜鸡血（5%-10%），混合均匀，调pH 8.0，倾注平皿。 石油发酵培养基（g/l ）：原油0.5，NH 4NO 3 3.0, KH 2PO 4 0.5, K 2HPO 4 0.5,微量元素2ml 。
微量元素液（g/l ）：NaCl 1.0，FeSO 4·7H 2O 1.0，CaCl 2 1.0，CuSO 4 1.0，MnSO 4 1.0，MgSO 4 1.0。
2.1.3实验仪器
恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司和昆山一恒仪器有限公司）、LDZX –30KB 立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、BCD-216SDHaier 冰箱（青岛海尔股份有限公司）、THZ –98AB 恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司和昆山一恒仪器有限公司）、T66–O 型远红外辐射干燥箱（上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司）、GXZ 智能型光照培养箱（宁波江南仪器厂）、NDJ –1型旋转粘度计（上海昌吉地质仪器有限公司）、TG16–WS 台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、LRH-250A 生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）、UA –VIS 检测器、岛津高效液相色谱仪、光学显微镜。
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2.2 方法
2.2.1 采样
选定采取土样的地点后，铲去表土层（1-2cm ），取3-4cm 层土壤20g ，装入无菌瓶中，封好瓶口，并记录采样地点，环境特征和详细日期。取样后，及时分离菌种，若不能及时分离，将土样保存在低温、干燥的条件下，尽可能减少菌相变化[11]。
土壤采样时，一般每个混合样品约需1kg 左右，如果样品取得过多，可用四分法将多余的土壤弃去。四分法[12]的做法是：将采集的土壤样品放在干净的塑料薄膜上弄碎，混合均匀并铺成四方形，划分对角线，分成四份，保留对角的两份，其余两份弃去，如果保留的土样数量仍很多，可再用四分法处理，直至对角的两份达到所需数量为止（该样品的处理要进行无菌操作）。
2.2.2 分离方法
制备土壤悬液：称取5g 土壤，在火焰旁放入装有45ml 无菌水的锥形瓶中，振荡10min ，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成稀释度为10-1土壤悬液[11] ，5000r/s ，离心1min 。
制备土壤稀释液：另取6支装有9ml 无菌水试管，用记号笔编号10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，放在试管架上。将制好的10-1土壤悬液静置0.5min ，取1支无菌移液管，从移液管包装纸上半段（近吸管口）撕口，将包装纸分成上下两段，去上段包装纸，左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞（棉塞夹在手上，不得放在桌面上），去下端包装纸，将移液管吸液端伸进锥形瓶内，吸取1ml 土壤悬液。右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，持编号10-2的无菌水试管，在火焰旁拔出棉塞（试管盖），将移液管伸进无菌水试管内，放入土壤悬液，使之充分混匀，制成10-2土壤稀释液。取出移液管，插回棉塞。接着换一支无菌移液管，按照前面的方法从编号为10-2的试管中吸取1ml 稀释液，加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后制成10-3土壤稀释液。继续上述操作，依次制成10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液[11]。
涂布平板：以无菌移液管加入0.2ml 制好的土壤稀释液，取无菌三角玻棒，把上述稀释液在平板表面涂抹均匀。在涂抹时不要弄破平板，以免影响菌落的生长[11]。
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2.2.3 微生物的培养
涂布后的平板于37℃恒温培养1h 后，倒置平板继续培养于37℃恒温箱中，培养3-5d 。
2.2.4 石油降解菌株的形态学观察
通过革兰氏染色观察是有降解菌株的形态特征，具体方法如下：取一块洁净的载玻片，用记号笔在载玻片的左右侧，注上菌号，并在载玻片两端各滴一滴蒸馏水。接种环在火焰上灼烧灭菌，采用无菌操作。接种环使用后，必须立即用火焰灼烧灭菌。再用经火焰的接种环取2号菌菌苔涂片。按照简单染色法的操作程序进行干燥固定。初染：将涂片至于平台上，在两个涂面上滴加结晶紫染色剂，染色1min ，然后倾去染色液，用自来水细流冲洗，至洗出液中无紫色。煤染：先用新配的碘液冲去涂片面上的残余水，或用吸水纸吸干图片上的残余水，再用碘液覆盖涂面煤染1min ，然后水洗。脱色：除去残余水后，滴加95%酒精进行脱色，至载玻片上流出的酒精液中紫色接近消失为止（约30s ），并立即用自来水细流冲洗，终止酒精的作用。复染：滴加番红染色液，染色3-5min ，水洗后用吸水纸吸干。镜检：用低倍镜找到标本后，再用油镜观察染色后的菌体，并绘图说明染色结果[11]。
2.2.5溶血实验
将实验菌接种于血琼脂平板中，要求每一支菌对应一个平板，接种方法为划线法。然后置37℃恒温箱中培养1-2d 后，观察结果，若透明圈不明显者可放置10-22℃下，18h 左右后再观察[10]。
2.2.6 排油圈法
取一干净的培养皿,加蒸馏水,水面上加2滴原油形成油膜,在油膜中心加摇瓶发酵液,中心油膜被挤向四周形成一圆圈,圆圈直径与表面活性剂含量和活性成正比[13]。说明此液中含有的菌种已排油，有降解菌产生。
2.2.7 原油黏度的测定
粘度计测定原油的的黏度。选用相同的转子和转速分别测定原油和石油发酵培养液，根据得出的偏转角度和系数求得黏度η(mPa?s )。即：η=K?α（ k -系数，a -偏转角度读数）。其具体操作方法如下：准备被测液体（原油，石油发酵培养基），置于直径不小于70mm 的烧杯中，准确地控制被测液体温度。将保护架装在仪器上（向右旋入装上，向左旋出卸下）。将选配好的转子旋入连接轴
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（向左旋入装上，向右旋出卸下）。旋转升降旋钮，使仪器缓慢地下降，转子逐渐浸入被测液体中，直至转子液面标志和液面平为止，再精调水平。接通电源，按下指针调控杆，开启电机，转动变速旋钮，使其在选配好的转速档上，放松指针控制杆，待指针稳定时可读数，一般需要30s 。当转速在“6”或“12”档运转时，指针稳定后可直接读数；当转速在“30”或“60”档时，待指针稳定后按下指针控制杆，指针转至显示窗内，关闭电源进行读数。当指针所指的数值过高或过低时，可变换转子和转速，务使读数约在30～90格之间为佳。对于量程、系数及转子、转速的选择，可以先大约估计被测液体的黏度范围，然后根据量程表选择适当的转子和转速；当估计不出被测液体的大致黏度时，应假定为较高的黏度，试用由小到大的转子和由慢到快的转速。原则是高黏度的液体选用小转子（转子号高），慢速度；低粘度的液体选用大转子（转子号低），快转速。系数：测定时指针在刻度盘上指示的读数必须乘上系数表上的特定系数才为测得的黏度（mPa?s ）。黏度，即：η=K?α（η=粘度，K =系数，α=指针所指读数）。频率误差的修正：当使用电源频率不准时，可按下列公式修正：实际粘度=指示粘度×名义频率/实际频率。测量量程表如表1。
表1 粘度计测量两成表
Table 1 The tables of viscometer measurement
60 30 12 6 1
100 200 500 1000 2
500 1000 2500 5000 3
2000 4000 10000 20000 4
10000 20000 50000 100000
因此，通过系数表(mPa?s )（见表2）即可以求得待检测样品的黏度（η）。
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表2 粘度系数参照表(mPa?s )
Table 2 The reference list of viscosity coefficient
60 30 12 6 1
1 2 5 10 2
5 10 25 50 3
20 40 100 200 4 100 200 500 1000 备注：表1表2中的6、12、30和60均为转速。
2.2.8 原油降解产物的紫外光谱分析
用紫外光照射有机分子，分子吸收紫外光后，从电子能级基态跃迁到激发态，得到紫外吸收光谱。可根据得到的紫外吸收光谱图对原油降解产物进行分析。将含有石油和不含石油的石油发酵培养基倒入比色皿中，用紫外光谱仪进行分析，得到紫外光谱图。
2.2.9 原油降解产物的HPLC 分析
高效液相色谱法（HPLC ）是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。它是在经典液相色谱基础上，引入气相色谱理论，在技术上采用高压输液泵、梯度洗脱技术、新型高效填充剂以及各种高灵敏度检测器，与经典液相色谱法相比较，具有分析速度快、分离效率高、灵敏度高和操作自动化等优点。由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱机时，可在柱后直接检测流出液成分，高效液相色谱法完成分离的时间只需几分钟到几十分钟。比经典色谱法快数百倍。现代先进的高效液相色谱配有计算机，不仅能自动处理数据，绘图和打印结果，而且能够对仪器的全部操作包括流动相选择，流量、柱温、检测器波长的选择，进行梯度洗脱方式等进行程序控制，实现了仪器的全自动化。 高效液相色谱仪操作步骤：过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20min 。打开HPLC 工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。进入HPLC 控制界面主菜单，点击manual ，进入手动菜单。有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual 菜单下，先点击purge ，再点击start ，冲洗时速度不要超过10 ml/min 。调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，
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一般不要超过2000。点击injure ，选用合适的流速，点击on ，走基线，观察基线的情况。设计走样方法。点击file ，选取select users and methods ，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method 。选取需要的配件，包括进样阀、泵和检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol 。一个完整的走样方法需要包括：a .进样前的稳流，一般2-5min ；b .基线归零；c .进样阀的loading-inject 转换；d .走样时间，随不同的样品而不同；进样和进样后操作。选定走样方法，点击start 。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun ，可记录数据和做标记等。本次实验的全部样品有石油发酵培养基、正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物；关机时，先关计算机，再关液相色谱，填写登记本。（本次实验中流动相为60%甲醇，40%娃哈哈矿泉水，流速为0.8ml/min ）。
3 结果与讨论
3.1 石油降解菌株分离的鉴定
通过稀释平板涂布法，本研究分离到一株降解石油的细菌，其菌落形态小，表面湿润，容易挑取，G +，长杆状。
3.2 溶血实验
溶血实验结果表明，本研究分离的石油降解菌株能够使鸡血的血细胞溶解。
3.3 排油圈检测
排油圈实验结果表明，在直径为12cm 的培养皿上，排油圆圈直径约为5cm 。因此，排油圈的存在可以说明，石油发酵培养基中含有的石油降解菌株。
3.4 原油黏度测定
当同为3号转子时，原油在转速为6、12、30和60时，其读数分别为1.7、2.0、2.1和2.1，其相对应的原油的黏度（mPa?s ）为340、200、84和42。而含有原油的石油发酵培养液在转速为12、30和60时，其读数分别为0.3、0.7和1.0，其相对应的原油的黏度（mPa?s ）为30、28和20。结果表明，在同一转子的前提下，含有原油的石油发酵培养基在转速小的时候体现不出黏度系数，
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随着转速的加大，黏度系数在减小。在相同转速和转子的条件下，接种有降解石油菌株的石油发酵培养液比原油的粘度小。因此，含有原油的石油发酵培养基中存在降解菌株。而且，降解菌株对原油具有一定的降解能力，所以含有原油的石油发酵培养基的黏度系数比同一转速的原油要低。含有原油和不含原油的石油发酵培养液在转速为6、12、30和60时，其读数不同（见表3）。
表3 原油黏度的测定
Table 3 The detection of viscosity of crude oil
60 30 12 6 原油
2.1 2.1 2.0 1.7 含有原油的石油发酵培养液
1.0 0.7 0.3 - 3.5降解产物的紫外光谱检测
通过紫外光谱检测，本研究对含有原油和不含原油的石油发酵培养液的紫外光谱的检测。
结果表明，含有原油的发酵培养基在λ=280nm 处出现峰值（见图1）。
图1含原油的石油发酵培养基的紫外光谱检测
Fig.1 ultraviolet spectrum detection of the fermentation medium of petroleum of the
crude oil
11
不含原油的石油发酵培养基在λ=287nm 处也出现了峰值（见图2）。
图2 不含原油的石油发酵培养基的紫外光谱检测
Fig.2 ultraviolet spectrum detection of the fermentation medium of petroleum of
does not contain the crude oil
图3 含有原油和不含原油的石油发酵培养液的紫外光谱检测
Fig.3 The control group of ultraviolet spectrum detection of the fermentation
medium of petroleum
因此，参考该实验的对照组（图3），紫外光谱实验结果表明，含有原油和白骨含原油发酵培养液存在降解菌株的降解行为，因为石油发酵培养基只有经
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过降解菌株一定程度的降解，方可检测到不饱和信号。
3.6 降解产物的HPLC 检测
通过HPLC ，本研究选择以正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷为对照组，用石油降解发酵培养液对石油降解菌株进行了降解能力的初步测定，以期验证该石油发酵培养液中是否含有这对照组中的物质。检测结果表明，石油发酵培养液在4–5min 中出峰，其响应面为4.099和4.474，而正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷在3–4min 内出峰，其响应面分别为3.652、3.660、
3.644
、3.653和3.654。因此，初步推断，该石油发酵培养液的降解产物不含正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷（图4-9）。
图4 石油发酵培养基HPLC 检测
Fig.4 HPLC detection of the fermentation medium of petroleum
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图5正丁醇的HPLC 检测
Fig.5 HPLC detection of butanol
图6二甲苯的HPLC 检测
Fig.6 HPLC detection of xylene
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图7异戊醇的HPLC 检测
Fig.7 HPLC detection of isoamyl alcohol
图8 三氯甲烷的HPLC 检测
Fig.8 HPLC detection of chloroform
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图9环己烷的HPLC 检测
Fig.9 HPLC detection of cyclohexane
4 展望
本研究对泽普油田的原油进行了紫外光谱和HPLC 等方面的研究，并从原油中分离出了石油降解菌株，结果表明，分离到的石油降解菌株对原油有一定的降解能力。因此，本研究将对泽普油田乃至新疆其他油田残留石油的生物去除提供理论依据，同时也将推动该地区基础和有用微生物的研究和开发。
对于本研究的后续工作，将从以下几个方面开展：首先，本研究将进一步对泽普油田土样中分离到的石油降解菌株进行分子水平（16S rRNA 序列分析）的鉴定。其次，将选择更广泛的标准品进行石油降解产物的降解能力定性和定量分析。最终，针对泽普油田土壤的石油污染现状和降解菌株的降解能力的实际出发，研制合适的生物制剂尽可能合理地对石油污染土壤进行生物修复。
参考文献
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16
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附录
HPLC ：High-performance liquid chromatography （高效液相色谱法）
18 致谢
首先，我要真诚地感谢母校对我四年的培养和教育。
其次，我要感谢易霞老师在毕业论文实验和毕业论文撰写过程中给我的耐心指导和精心教育。同时，我还要感谢在学习和生活中帮助过我的所有老师和同学。
最后，谨以此论文献给我的父母，感谢他们对我理解和支持。
石油污染土壤的微生物修复原理
石油污染土壤的微生物修复 一、降解石油烃类化合物的微生物种类 自然界中能够降解石油烃类污染物的微生物种类有数百种，70多属，主要是细菌、真菌和藻类三大类型的生物。 表1 石油烃降解微生物种属 细菌真菌藻类 无色杆菌属枝顶孢属双眉藻属 不动杆菌属曲霉属鱼腥藻属 芽孢杆菌属金色担子菌数小球藻属 色杆菌属假丝酵母属衣藻属 诺卡氏菌属镰刀霉属念珠藻属 放线菌属青霉菌属紫球藻属 ……… 按照分子生物学和遗传学分类，可将降解石油污染物的微生物分为土著微生物和基因工程菌两大类。 二、产生表面活性剂的微生物 生物表面活性剂是微生物在一定培养条件下产生的一类集亲水基和疏水基于一体、具有表面活性的代谢产物。 分类典型产物 中性脂类甘油单脂、聚多元醇、其他蜡脂 磷脂/脂肪酸磷脂酰乙醇胺 糖脂糖酯、糖醇酯、糖苷 含氨基酸脂类脂氨基酸、脂多肽、脂蛋白 聚合型脂多糖、脂-糖-蛋白复合物 特殊型全胞、膜载体、Fimbriae 生物表面活性剂优点：1较低的表面张力和界面张力；2无毒或低毒，对环境友好；3可生物降解；4极端环境（温度、pH、盐浓度）下具有很好的专一性和选择性；5不致敏、可消化、可作为化妆品和食品的添加剂；6结构多样，可用于特殊领域 三、微生物降解石油的机制
1.微生物吸收疏水性有机物的机理 图1 微生物吸收疏水性有机污染物的4种摄取途径微生物吸收疏水性有机物的模式有4种：1微生物吸收其附近溶解于水相中的烃类；2细胞直接与石油烃接触。这种作用可以通过改变菌毛或细胞表面的疏水性部分的改造进行调控，提高对有机物的吸附；3通过细胞直接与分散在水相中的石油烃的微米或亚微米液滴接触来吸收；4强化吸收模式，即由于细胞产生的表面活性剂或乳化剂使烃的水溶性增强，微生物表面的疏水性更强，使细胞与烃接触。 丝状真菌主要通过菌丝的吸收作用摄取石油烃。 2.微生物细胞膜转运烃机理 微生物对有机化合物的降解作用是由细胞酶引起，整个过程可分为3个步骤。首先化合物在微生物细胞膜表面吸附（动态平衡过程）；其次吸附在细胞膜表面的化合物进入细胞内；最后化合物进入细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应（快速过程）。 参与第1个步骤还有表面活性剂。 石油进入细胞方式：非特异性接触，被动运输方式。 3.微生物降解石油的机制 石油类物质+微生物+O 2+营养物质→CO 2 +H 2 O+副产物+微生物细胞生物量 微生物利用石油烃类作为碳源和能源，经过一系列氧化、还原、分解、合成等生化作用，将石油污染物最终矿化为无害的无机物的过程。 途径：烷烃→醇→醛→脂肪酸→β氧化乙酸盐→CO 2+H 2 O+生物量 四、典型石油烃的降解途径
土壤石油污染物生物通风修复的研究进展
土壤石油污染物生物通风修复的研究进展 隋红1，茹旭2，黄国强1，李鑫钢1 1：天津大学化工学院，天津300072；2：锦州石化设计院，辽宁锦州121001 摘要：生物通风是一种去污效果好、操作费用低的土壤原位修复技术。文章概述了生物通风系统的结构、设计目的、适用范围和优缺点，详细论述了生物通风的国内外研究现状，包括现场应用、影响因素和强化技术及理论研究，并展望了生物通风在我国的应用前景。 关键词：土壤；石油污染；原位修复；土壤气相抽提；生物通风；生物降解 中图分类号：X53 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2003）02-0216-04 土壤是人类赖以生存的基础资源。土壤中最严重的污染是石油类污染。由于输油管道、储油罐泄露，落地油、含油污水排放等原因，大量石油类污染物进入土层，不仅破坏了土壤本身的生态系统，而且对地下水资源构成威胁。至90年代中期，美国就有1/3的地下储油罐被确认存在不同程度的渗漏，使地下水受到污染。我国目前大部分油田区地下水也因受到污染而达不到饮用标准，对人类健康造成潜在的致命危害。国外最近20年加强了土壤修复计划，通常解决的办法有异位（ex situ）修复和原位（in situ）修复两种形式，异位修复在多方面存在明显不足，已基本被原位修复所取代。美国于90年代投入大量资金以鼓励一些新兴的革命性土壤原位修复技术，土壤气相抽提法（soil vapor extraction，SVE）应用而生，随后其衍生技术____生物通风（bioventing，BV），结合了土壤通风的物理过程和增强的生物降解过程，而成为一种应用广泛的革新性原位修复技术[1]。 1 生物通风概述 SVE技术是一种通过强制新鲜空气流经污染区域，将挥发性有机污染物从土壤中解吸至空气流并引至地面上处理的原位土壤修复技术，该技术被认为是一个“革命性”的修复技术[2]。BV是在SVE 基础上发展起来的，实际上是一种生物增强式SVE 技术。因利用外界驱动力向地下输送气流，使得受污染土壤中的有机物挥发速率和生物降解速率都有可能增加，注射井和抽提井可去除气相污染物，也可以向污染区提供氧源增加微生物活性，当其首要目标是增强氧气的传送和使用效率来促进生物降解时，通常称之为生物通风[3]。 BV技术的出现直接源于SVE的发展，使用了与SVE相同的基本设施：鼓风机、真空泵、抽提井、注入井和供营养渗透至地下的管道等。其中井所在位置的结构依现场而定，并与空气是被注入还是从土壤中抽出有关。BV技术还可与修复地下水的空气搅拌（air sparging，AS）或生物曝气（biosparging, BAS）技术相结合[4]，将空气注入含水层来提供氧支持生物降解，并且将污染物从地下水传送到渗流区，在渗流区污染物便可用BV或SVE法处理。SVE 和BV虽然系统组分相同，但系统的适用情况、结构和设计目的有很大不同：SVE将注射井和抽提井放在被污染区域的中心，而在BV系统中，注射井和抽提井放在被污染区域的边缘往往更有效。SVE 的目的是在修复污染物时使空气抽提速率达到最大，利用挥发性去除污染物；而BV的目的是优化氧气的传送和氧的使用效率，创造好氧条件来促进原位生物降解。因此，BV使用相对较低的空气速率，以使气体在土壤中的停留时间增长，促进微生物降解有机污染物[5]。 生物通风应用范围较宽，Michael[6]已经通过实验研究证明了，生物通风不仅能成功用于轻组分有机物，如汽油和柴油，还能用于重组分有机物，如燃料油等，另外也可用于其它的挥发或半挥发组分。生物通风的另一个显著优点是，与SVE比较它的操作费用更低[7]。在SVE操作中抽出的废气不能直接放入空气中，需要后续处理工艺（一般是活性碳吸附和催化燃烧），这有时甚至要占整个费用的50%左右，生物通风省去了此步骤，因此操作成本下降。生物通风与其它土壤修复技术比较，其主要缺点是操作时间长，受到土著微生物种类的限制[8]。 2 生物通风国内外研究进展 2.1 现场应用
石油降解菌的分离
从环境样品中分离筛选石油 降解菌的方案
引言 随着经济技术的迅速发展，石油日渐成为我过的主要能源，且需求量日益增大。研究表明，石油生产和运输环节会对土壤造成严重污染，且污染面积不断扩大。目前，我国石油行业每年产生的含油污泥多大八十万吨。由于石油的粘度大、粘滞性强，会再短时间内形成小范围的高浓度污染，长期的石油污染还会影响土壤的通透性，减少土壤肥力，阻碍植物生长。同时，石油中所含的多环芳香烃具有“三致”效应，一些挥发组分能引起人体麻醉、窒息和化学性肺炎等疾病。因此，石油污染对土壤生态系统的平衡和人体健康都有很大的危害。 目前，针对石油污染治理的方法主要包括：物理方法、化学方法以及生物修复法，但物理方法修复费用较高，耗材较多：化学方法会使用大量化学淋洗剂，很容易造成二次污染。相较而言，微生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染等特点而被视为一项最具有应用前景的修复技术。而且随着分子生物学的发展，无论是DNA文库的建立，还是多态性分析方法的进步，都为污染物的生物修复提供了全新的技术支持。既然生物修复法有诸多优点，那么就应该充分发挥其特性。本文则是着眼于环境样品，分离筛选其中的石油降解菌，以扩大培养进行更大规模的石油降解。 摘要 在长期被石油污染的土壤中，微生物可逐渐改变自身的代谢条件以适应环境。即以石油烃为碳源进行生长、繁殖，同时将石油烃降解。因此在这种土壤中存在着可降解石油烃的微生物，但石油烃降解菌的筛选、分离是生物法处理石油污染的关键。从这个角度考虑，以长期石油污染的土壤中微生物为菌源，从中筛选、分离出高效的石油烃降解菌。要降解哪里的石油就用哪里的土壤培养石油降解菌。目前，国内对极端条件下石油降解微生物研究较少，尤其是对低温、耐盐的石油降解菌，中国北方的大部分湿地，盐碱程度比较高，成年气温较低。无论是来源于海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。本文针对大连开发区因石油泄露而被污染的白石湾，就地选取材料进行石油降解菌的筛选以及分离研究。
石油降解微生物的研究现状
石油降解微生物的研究现状 陈宇翔生物工程学号：11208523802538 摘要：本文简单介绍了石油降解微生物的概念，并叙述了石油降解微生物的降解机理和影响微生物降解的条件。举例说明了生物降解石油烃的研究现状和对未来研究方向的展望。 Abstract: this paper briefly introduces the concept of microorganism oil, and describes the degradation of microorganism oil mechanism and influencing microbial degradation of conditions. For example the biodegradation petroleum hydrocarbons, the research present situation and prospect of the future study trends. 关键词：石油烃降解微生物石油污染高效性研究现状展望Keywords: petroleum hydrocarbon microorganism oil pollution efficiency research-status prospect 引言： 石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，随之而来的石油烃污染已经对人类生存的土壤及水体环境造成了严重的危害，微生物降解是一种处理石油烃污染的理想方法。在石油及石油产品的开发利用中，不可避免的会对人类生存环境造成污染，防范、治理石油污染成为环境保护的重要任务之一。目前用于石油污染治理的方法主要有：物理修复法，化学修复法和生物修复法。与传统的物理化学方法比较，生物修复法具有经济花费少、对环境影响小、遗留问题少、最大限度地降低污染物的浓度、修复时间较短、就地修复、操作方便等特点[1]，是国内外科研工作者关注的热点领域，在石油污染的治理中具有广阔的应用前景。 本文从介绍石油降解微生物开始人手，认真分析了石油降解微生物的种类、菌种特征、降解机理，分析了目前用于处理石油污染的微生物的技术特点，现阶段研究现在和具体应用，并对未来的研究方向做出了大胆的设想和展望。
生物降解石油的高分子量(＞C35)正烷烃
简 报第47卷 第14期 2002年7月 https://www.wendangku.net/doc/a017247724.html, 1103 千米桥地区上第三系严重生物降解石油的 高分子量 ( 朱 丹 卢 鸿 ( 中国科学院广州地球化学研究所, 广州510640; é°×é(Ng1)中钻探获得重稠油, 含蜡量1.62%, 在气相色谱图 和气相色谱-质谱总离子流图上, 该重稠油的链烷烃丧失殆尽, 表明其已遭受严重的生物降解作用. 但是, 在m /z 85质量色谱图上, 仍可检测出残余的痕量n C 13~n C 36正烷烃; 而且高温气相色谱分析还可检出由于未受生物降解影响而连续发育的n C 35~n C 73高分子量正烷烃系列, 呈正态分布, 主峰碳数在n C 43,奇偶优势明显, CPI 37~55与OEP 41~45值分别可达1.17和1.20. 对于这些高分子量正烷烃的研究, 不仅证实前人有关其抗生物降解性的认识, 并且为千米桥地区严重生物降解油的研究提供有关生源输入 终点 检测的碳数范围, 提供了对原油与石蜡中C 40~C 100 高分子量蜡馏分的检测新手段[6,7]. Hsieh 等人[8]指出,一些严重生物降解油中, 用全油气相色谱分析检测不出高分子量烃类, 而在从全油分离出来的蜡馏分中, 高分子量烃类则变得明显可见. 但是, 在Hsieh 等人[8]发表的严重生物降解油高温气相色谱图中, 所检测的高分子量烃类主要是烷基环己烷, 未见n C 40以上正烷烃. 而且, 对于生物降解油高分子量正烷烃的研究迄今尚缺乏详细的报道. 本文运用高温气相色谱技术, 对渤海湾盆地千米桥地区板14-1井上第三系馆陶组 井断层夹持而形成一个北东向的奥陶系古潜 山断块构造带. 在奥陶系古潜山的剥蚀面上直接覆盖着顶薄翼厚的中生界和第三系砂 , 和Ng1)和下第三系东 营组(Ed) 砂岩层中共发现3个浅油层, 中途测试3层合计原油产量高达208.2 m 3/d. 板14-1井馆陶组 高粘度(317.1 mPa ?s) ) (34.9%)为特征, 原油属于典型的重稠油. 2 实验方法 2.1 样品的预处理 取两份原油样品, 一份油样按常规分析流程进行柱色谱分离, 分析原油族组成, 保留饱和烃与芳烃 万方数据
高效石油降解菌的筛选
海洋中高效石油降解菌的筛选 楼浩 04016158
摘要 本研究利用原油为唯一碳源，采用富集培养分离的方法从象山港的表层海水和底泥混合物中筛选到两株石油降解菌株F3和F4。通过检测，两种菌株在油浓度为2000mg·L-1、温度为28℃的条件下培养七天后，降解率分别达到了48.1%和51.3%，与目前已筛选出的海洋石油降解菌相比较，F3、F4均属于降解率较高的菌株。本研究还对营养盐、原油浓度等影响F3、F4菌株生长和降解率的相关因素进行了初步探讨。结果表明：①氮、磷营养盐在较大程度上限制了F3、F4菌株对原油的降解率，是主要的限制因子。在氮磷浓度≥1.0m g·L-1时，F3菌株才能达到最大的降解效率48.1%，在氮磷浓度≥1.5m g·L-1时，F4菌株才能达到最大的降解效率57.3%。②F4菌株的降解率随原油浓度的降低而增加。在原油浓度为400mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率分别达到57.6%和61.5%，而在油浓度为4000 mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率仅为27.5%、11.2%，相比之下F3菌株对原油浓度的耐受能力更强。 关键词：石油降解菌；筛选；原油降解率；氮磷营养盐；原油浓度
ABSTRACT The use of oil as the sole carbon source, using enrichment culture method from the surface water and sediment which in the Xiangshan Port isolated two strains of oil degradation, Named as F3 and F4. To detect these two strains in the oil concentration was 2000mg/L, the temperature is 28℃ training seven days ,The degradation rate respectively reached 48.1% and 51.3%, compared with that which has been selected marine oil degrading bacteria, F3, F4 belong to the higher efficiency degradation of crude oil strain. The issue also conducted a preliminary test about nutrients, oil concentration and so on which Impact F3, F4 strain growth and the degradation efficiency. The results showed that: ①nitrogen and phosphorus nutrient limitation to a greater extent on the F3, F4 strains degradation efficiency , is the main limiting factor. In the concentration of nitrogen and phosphorus ≥ 1.0mg/L, F3 strain to achieve normal degradation efficiency 48.1%, the concentr ation of nitrogen and phosphorus in ≥ 1.5 mg/L, F4 strains to reach the degradation efficiency is 57.3%. ② the degradation of the F4 strain increasing when the concentration of oil reduced. in the concentration of 400 mg/L, The degradation rate of F3, F4 strains respectively reached 57.6% and 61.5%, the concentration of oil in the 4000mg/L, The degradation rate F3, F4 strains of was only 27.5%, 11.2%, but compared with F4, F3 strains better adapted to the higher concentration of oil. Key Words: Petroleum Degrading strains; Screening;Degradation of oil;nutrients of nitrogen and phosphorus; Oil concentration
微生物石油降解
微生物石油降解综述 Abstract: Oil as a important energy has been one of the countries all over the world widely used, because in the exploitation of oil, storage, transportation, processing and petrochemical products in the process of production, and the sudden discharge of oil leakage accident cause large oil into the environment pollution. Oil pollution harm main performance in the column of \"soil ecosystem tao and the function of the damage, the serious influence the permeability of soil and water permeability, lead to soil harden. Fertility dropped; In the water surface formation oil film, cause the oxygen in the water fell sharply. Cause massive death of aquatic organisms, destroying the aquatic ecological environment and fishery resources; Still can into the underground water system, direct pollution underground water sources, the influence of water and irrigation residents; Some of the oil teratogenic carcinogenic substance but also by biological function of enrichment of the food chain and immediate harm to human health. 摘要：石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，由于在石油的开采、储存、运输、加工和石化产品生产等过程中的漏油以及突发性泄油事故致使大量的石油进入环境造成污染。石油污染的危害主要表现在列土壤生态系统的结掏和功能的破坏，严重影响土壤的透气性和渗水性，导致土壤板结。肥力下降；在水体表面形成油膜，致使水中溶氧量急剧下降．造成水生生物的大量死亡，破坏水生生态环境和渔业资源；还可进入地下水系，直接污染地下水源，影响居民用水和农田灌溉；石油中的一些致畸致癌物质还可通过食物链的生物富集作用而直接危害人类健康。 随着人们对环境问题的日益关注，石油烃类的微生物降斛研究工作也不断得以深入。近十年米这一领域义有许多研究和相关报道，本文对相关工作进行了综述。 1国内外研究现状 1.1.石油烃类化合物被微生物氧化成为低分子化合物或完全分解为二氧化碳和水的作用。 1.2石油入海后发生一系列物理、化学和生物的变化，其中微生物对石油烃的降解起重要作用。微生物降解烃类是19世纪末发现的。20世纪50年代前，以美国C.E.佐贝尔为代表，对海洋微生物降解石油烃进行了广泛的研究。50年代初气相色谱问世，放射性同位素示踪法的普遍应用，对研究石油烃的微生物降解机制起了积极的作用。60年代以来，由于海上石油污染日趋严重，促使不少沿海国家，如美国、加拿大、日本、英国和苏联等国，积极开展了有关海洋微生物降解石油烃的研究工作。70年代中期，美国学者还用基因工程的技术培育了“超级微生物”，以期能有效地降解石油烃。 中国自1975年起，先后对青岛胶州湾、渤海、厦门港、黄海和东海石油降解微生物的数量、分布、种类组成和影响降解因素等进行了调查研究。 1.1烃类微生物概述 能够降解（氧化）石油烃，或以石油烃为其碳源的微生物称为烃类微生物。
环境水中石油类污染物的含量反应说明
环境水中石油类污染物的含量反应说明 摘要：环境水中石油类污染物的含量是反映水质的指标之一，本文采用三波长定量测试水中油含量，样品测试方便，数据准确。 环境中水中的石油类来自工业废水和生活污水的污染。油类物质在水面形成油膜，影响了空气和水的气体交换;分散于水中以及吸附于颗粒上或以乳化状态存在于水中的油，被微生物分解时，将消耗水中溶氧，容易使水质恶化。 矿物油是由烷烃、环烷烃及芳香烃组成的混合物红外碳硫分析仪。本文参照“GB/T16488-1996《水质石油类和动植物油的测定红外光度法》”选择三波长红外光谱法测定地表水，测定结果准确，避免使用“标准油”。 原理： 水中油类物质是由烷烃、环烷烃及芳香烃组成的混合物，可用四氯化碳萃取，测定总萃取物。然后将萃取液用硅酸镁吸附其中动植物油等极性物质后，测定石油类含量。石油类和动植物油的红外谱图在2930cm-1、2960cm-1或3030cm-1处有吸收，可根据上述三个波数位置的吸光度值计算其含量。 实验条件： 仪器及附件： FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪 1cm 石英比色皿 试剂： 四氯化碳(CCl4):环保用，天津基准试剂有限公司; 正十六烷[CH3(CH2)14CH3] 分析纯：成都市科龙化工试剂厂; 姥鲛烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)分析纯：北京百灵威科技有限公司; 甲苯(C6H5CH3)分析纯：天津市江天化工技术有限公司; 无水硫酸钠(Na2SO4)分析纯：北京化工厂; 氯化钠(NaCl)分析纯：天津化学试剂有限公司; 盐酸(HCl)分析纯：天津化学试剂一厂。 样品前处理： 将水样全部转移至分液漏斗中，用20ml四氯化碳洗涤采样瓶，洗涤液并入分液漏斗中，调PH≤2，加入20g氯化钠，充分震荡2min充分静置，将萃取液流经铺有10mm无水硫酸钠的玻璃砂芯漏斗，用容量瓶收集滤液。取20ml四氯化碳再次萃取、用适量四氯化碳洗涤玻璃砂芯漏斗，将萃取液、洗涤液一并放入容量瓶中。用四氯化碳标至刻线、摇匀。 测定结果： 1、校正系数的测定： 以四氯化碳为溶剂，红外碳硫分析仪分别配置浓度为100mg/L正十六烷、100mg/L姥鲛烷、400mg/L甲苯溶液，用四氯化碳作参比溶液，采用10mm×10mm比色皿，分别测量三种溶液在2930cm-1、2960 cm-1和3030cm-1处的吸光度A2930、A2960、A3030。这三种溶液在上述波数处的吸光度满足公式： C=X·A2930 Y·A2960 Z (A3030- A2930/F)， 式中： C-萃取溶剂中化合物的含量，mg/L; A2930、A2960、A3030-各对应波数下测得的吸光度值; X、Y、Z-与各C-H键吸光度对应的校正系数; F-脂肪烃对芳香烃的校正因子，即正十六烷在2930 cm-1和3030 cm-1处的吸光度之比; 对于正十六烷(H)和姥鲛烷(P)，由于其芳香烃含量为零，即A3030- A2930/F =0，则
石油降解研究
石油污染物生物降解的机理研究 李会爽1，周磊2，柳青2，张端2，张景来2 (1第二炮兵工程设计研究院六室北京100011，2中国人民大学环境学院北京100872) 摘要：通过测定石油生物降解过程中的产物，分析探寻假单胞菌属的Pseudomonas sp. Strain SY2对石油的降解机理，为解决海洋石油污染问题提供理论依据。本文利用色质谱分析手段，通过测定假单胞菌属的Pseudomonas sp. Strain SY2对石油和正十四烷降解产物，对菌株SY2的降解机理进行分析研究。实验（分析）结果表明：菌株SY2对石油中的正烷烃有较好的降解效果，其中正十四烷、正十五烷和正十六烷的降解率较高，分别为：73.4%、49.3%、48.9%；根据正十四烷降解产物推测：菌株SY2对正十四烷的降解有单末端氧化、双末端氧化、次末端氧化和直接脱氢等多种途径，产生酯类、烯烃类、烷烃类及羧酸类等物质，与文献报道的烷烃降解途径相符合。 关键词：石油污染，生物降解，降解途径 Study on Theory of Biodegradation of Oil Contamination LI Hui-shuang, ZHOU Lei, LIU Qing, ZHANG Duan, ZHANG Jing-lai (1Sixth Chamber of Second Artillery Engineering Design Institute, Beijing 100011, China, 2 Environment School of Renmin University of China, Beijing 100872, China) Abstract:, In order to find the theories of biodegradation about crude oil and tetradecane by Pseudomonas sp. Strain SY2 and provides a theoretical basis for the solution of oil contamination, the research analyses the structure of the substances from biodegradation of crude oil.In this paper, through analyzing structure of the substances from biodegradation of crude oil and tetradecane by Pseudomonas sp. Strain SY2, which detecting by GC/MS, the author studied the theories of biodegradation. The results indicate that the ability of SY2 for degrading n-alkanes is best; in which the degradation rate of pentadecane 49.3%, hexadecane 48.9% and tetradecane 73.4% are highest. According to the substances from process of tetradecane biodegradation, the author inferred that tetradecane biodegraded to esters, olefins, alkanes and carboxylic acids by a variety of biodegradation pathways, such as monoterminal oxidation, diterminal oxidation, dehydrogenation and so on, which tallies with alkane degeneration way repoted by the documents. Key Words：Oil contamination, Biodegradation, Biodegradationpathway
石油污染土壤修复技术(总3页)
石油污染土壤修复技术 (总3页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1 -CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除
【前言】随着经济的发展，人类对能源的需求也在不断扩大，石油是最重要的能源之一，被成为“工业的血液”。近些年来各国都加快了对油气资源的开发利用，从沙漠到海洋、从无人区到人口稠密区，越来越多的油气井出现在世界各地。随之土壤污染问题日益突出，石油对土壤的污染危害大，潜伏期厂，涉及面广，有研究者将其比喻为“化学定时炸弹”，已经成为不容忽视的环境问题。 石油主要是由烃类化合物组成的一种复杂化合物，其组成复杂，含有致畸、致癌、致突变的物质(如卤代烃、苯系物、苯胺类、菲、苯并[a]芘等）。土壤作为人类、动植物和微生物赖以生存的重要环境基础，是自然界物质和能量参与转化、迁移和积累等循环过程的重要场所，土壤安全事关人类食品安全。石油一旦进人土壤，将对人类健康和生态环境造成严重危害。根据已公布的环境保护部和国土资源部发布的《全国土壤污染状况调查公告》显示，我国土壤总超标率高达16.1%。其中，有机类污染物，尤其是石油污染物已成为导致土壤安全问题的重要因素之一。据报道在我国，勘探和开发的油气田有4 0 0多个，覆盖面积达 3. 2 X 105 km2，其中约4. 8 X 106 hm2 的土壤受到不同程度的污染。为我国部分油田周边石油污染状况，其周边土壤中的总石油烃（ TPH ) 质量分数已经远远超过临界值500 mg/kg，对人居安全和生态环境造成了严重的威胁。由此可见，石油污染土壤形势严峻，修复工作迫在眉睫。 土壤石油污染：是指原油和石油产品在开采、运输、储存以及使用过程中，进入到土壤环境，其数量和速度超多土壤自净作用的速度，打破了它在土壤环境中的自然动态平衡，使其累积过程占据优势，导致土壤环境正常功能的失调和土壤质量的下降，并通过食物链，最终影响到人类健康的现象。 石油进入土壤的途径： ?石油的泄露和溢油：陆地采油大量的生产设施如油井、集输站、转输站和联合站等，原油会 被直接或间接的倾泻与这些设施附件的地面；产品的开采和运输业会使石油类物质进入土壤环境中；另外发生井喷或泄露，也会污染周围土壤环境。 ?含油固、液体废气无的随意处置：油气的开采和运输过程会产生大量含油、天然气的开采过 程中会产生大量含油废水、有害的废泥浆以及其他的一些污染物，如果处理不好就会污染周边土壤、河流甚至地下水。 ?含油污水的灌溉和农用药剂的使用：一些工业企业产生的含油废水如果不加以回收处理，直 接排入河流、湖泊或海湾,会污染水体,该水体用于农业灌溉，则会导致土壤污染，另外某些农用药剂也会污染土壤。 ?汽车尾气的排放：汽车尾气排放导致交通干线两侧土壤的有机物污染，另外大气沉降也会导 致土壤污染。 石油污染土壤修复技术 石油污染土壤的物理修复方法：
石油化工水污染物排放标准
石油化工水污染物排放标准 UDC 628.191:665.5.661 GB 4281-84 （1984年5月18日中华人民共和国城乡建设环境保护部发布1985年3月1日实施）标准为贯彻《中华人民共和国环境保护法（试行）》，防治石油化工废水对环境的污染，特制订本标准。 本标准适用于全国石油化工企业。 1标准的分级 石油化工水污染物排放标准分为二级： 第一级：是指新建、改建、扩建的石油化工企业或大型石油化工企业，自本标准实施之日起立即执行的标准。 第二级：是指所有现有具备污水生化处理设施的中、小型石油化工企业，自本标准实施之日起立即执行的标准。 注：大、中、小企业按“化学工业部基本建设基层统计报表制度”中关于“化学工业部基本建设大、中、小型建设项目的划分标准的规定”划分。 2标准值 石油化工工厂和工厂污水处理厂排放口水污染物最高容许排放浓度应符合下表规定。 表石油化工水污染物最高容许排放浓度（mg/L）
3其他规定 3.1 自本标准实施之日起，从外国引进的石油化工建设项目，废水中污染物排放应达到国外同样项目的排放标准，并不得低于国内新建厂水平。 3.2 没建污水生化处理设施的中、小型石油化工企业，达不到第二级标准者，近期标准暂按BOD<300mg/l,COD<500mg/l执行。其他项目按二级标准执行。 3.3 污水排入区域型综合污水处理厂的石油化工企业，排放的污水应符合污水处理厂进水要求。 3.4 当地方执行本标准不适用于当地环境特点时，应按国家有关规定制订地方污染物排放标准。 4标准的监测 4.1 企业的环保部门，应建立分析检测机构，负责对本企业污染物的排放进行分析检测，除五日生化需氧量，至少每月检测一次外，其余规定的污染物至少每天取样检测一次。 4.2 制订本标准所依据的分析方法是《石油化工厂废水水质统一分析方法》。 附加说明： 本标准由原国务院环境保护小组提出。 本标准由化学工业部北京化工研究院负责起草。 本标准委托化学工业部负责解释。
石油烃类的微生物降解研究
石油烃类的微生物降解研究 石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，随之而来的石油烃污染已经对人类生存的土壤及水体环境造成了严重的危害，微生物降解是一种处理石油烃污染的理想方法。综述了降解菌种类和不同烃类的微生物代谢途径，分析了包括温度、营养物、氧和pH值等环境因素对石油烃降解的影响，为进一步的研究应用提供参考依据。 随着工业和经济的发展，人类对能源的需求日渐增多，促进了石油工业的飞速发展；在石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，不可避免地会有石油烃类的溢出和排放，造成土壤及水体的石油污染。据统计全球每年倾注到海洋的石油总量在200~1000万t之间。辽宁省环境中心监测站的化验结果显示，在辽河油田的重度污染区内，土壤中的含油量已达到10 000 mg／kg以上，是临界值(200 mg／kg)的50多倍，严重影响了油田附近的生态环境。 石油烃类物质引起的环境污染越来越引起人们的关注。利用物理、化学方法处理石油烃可以得到较受到了限制翻。生物处理方法是近年来发展起来的，具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广等优点，是迄今为止处理石油烃污染比较好的一种方法。 1.降解石油烃类的微生物种类 国外在20世纪40年代就开展了细菌降解石油烃的研究，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期。研究表明，在土壤和水体环境中存在着大量能够降解石油烃的微生物，主要是细菌和真菌；细菌在海洋生态系统的石油烃类降解中占主导地位，而真菌则是淡水和陆地生态系统中更为重要的修复因子。石油烃降解菌和藻类见表1。
大量研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，利用烃类化合物的微生 物数量急剧增长，尤其是含降解质粒的微生物。Atlas报道在正常环境下降解菌一般只占微生物群落的1％，而当环境受到石油污染时，降解菌比例可提高到10％。含质粒细菌在石油烃污染环境中出现的频率和数量LL-t~污染环境高，说明质粒在石油烃的降解中可能起着重要作用。降解质粒的存在为降解工程 菌的构建提供了可能。 2.石油烃类的微生物代谢途径 2.1 直链烷烃 通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢 酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；氧 化途径有单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化[7]。在转化为相应的脂肪酸后，一种转化形式为直接经历随后的／3一氧化序列，即形成羧基并脱落2个 碳原子；另一种转化形式为脂肪酸先经历60一羟基化形成∞一羟基脂肪酸， 然后在非专一羟基酶的参与下被氧化为二羧基酸，最后再经历一氧化序列
石油类污染物在土壤和地下水中的污染模拟
2、土壤污染模拟 土壤是一个多相的疏松的多孔介质，固相中有大量的有机和无机胶体。石油是一种天然的粘油状液体，主要成分为烃类化合物( 占8 0% 一9 0% )。烃类化合物是非极性有机物，其偶极矩< 1，介电常数< 3，在土壤中有一定的吸附作用。地表的石油可以在重力作用下入渗，也可能随地面水或雨水沿着土壤毛细管孔隙向下渗透污染土壤，甚至进一步向下淋滤污染地下水。石油类污染物质在土壤入渗过程中，由于土壤中存在着大量的有机和无机的胶体，使得进入土壤中的污染物不断地被吸附。吸附能力与土壤的质地、石油的性质有密切联系。通常，石油烃类在土壤介质吸附程度以分配系数Kd来表示。 K d=C s C e 式中: Cs为平衡时固相中的浓度( mg/kg)；Ce为平衡时液相中的浓度(mg/l) 根据土壤中溶质运移模型和石油类污染物质在土壤中的迁移转化过程，考虑吸附作用而忽略石油的挥发，建立石油类污染物质在土壤中迁移转化二维综合模型。它包括水运动方程和石油运动方程。 土壤中水运动方程: C?e? et = e ex K x e? ex + e ez K x e? ez + eK z ez 7 土壤中石油类运动方程: θR d ec = e D xx ec + e D zz ec ? eq x c ? eq z c + eθ ?λθR d c8 式中：C( h)为比水容量（cm-1）；K x、K z分别为横向纵向水力传导系数（cm/d）；Dxx、Dzz分别为横向纵向弥散系数（cm2/d）；Rd为滞留因子；c为液相中石油的浓度(mg/l) ；qx、qz分别为x和z方向的达西流速（cm/d）；θ为含水量(% )；λ为降解系数（d-1）；h为土壤中压力水头(cm )。 初始条件和边界条件 根据监测的结果和落地油的分布特征，预测石油类在土壤中迁移过程及石油是否会对地下水造成污染，选择预测范围为：长80 m，深6m剖面区域。并对部分问题可进行简化处理, 作一些基本假设。假设土壤水最初不含石油，即未受到污染，但土壤中存在一定的本底值，经取样测定取平均值为40.3mg/kg。在土壤的预测范围内，土壤被认为是均质的。
石油的降解
一、前言 海洋占地球表面积的71%，而随着人类开发地球资源的加剧，海洋受到了严重的污染，其中最突出的就是石油污染。石油污染大致有两种类型：突发性输入和慢性长期输入。突发性输入包括油轮事故和海上石油开采的泄露、。慢性长期输入就比如港口和船舶含油污水排放，天然的海底渗漏等等，海洋石油污染看似遥远，其实与我们的生活息息相关。千万不能小看它造成的生态危害！首先，石油覆盖在海面上，阻断了氧气和二氧化碳的气体交换，严重导致水体缺氧。第二，石油的不透光性会阻碍阳光射入海洋，加上溶解氧减少，阻碍了海洋下植物的光合作用，间接刺激了赤潮的发生。第三，石油中所含的稠环芳香烃对生物体有剧毒，经过生物富集和食物链传递最终传递到人体内，对人有很强的致癌作用。等等。目前的治理技术主要有物理方法。化学方法。生物方法，其中用生物降解的方法优点是迅速，无残毒，低成本，受到广泛关注。现在就由我们小组为大家大致讲解下微生物降解石油的机理、菌种的筛选和相关的影响因素问题。 二、菌的筛选 除了人类活动外，自然界本身也存在着各种形式的石油烃类化合物的扩散，因此能降解高分子量烃类化合物的菌有很多种，目前已知200多种，但绝大多数的降解速率都很低，且石油是一种成分十分复杂的混合物，由上千种有机化合物组成，而一种菌往往只能降解一种特定类型的化合物，所以我们除了要对高效降解菌的筛选鉴定外，还要考虑菌种的组合，用菌群去降解石油，这里就有一个麻烦的问题，菌种之间怎样的组合才是最优的组合，要知道菌与菌之间纯在者各种相互作用，这是一个小的生态系统，因此还需要研究菌落种群的动态变化，这是一个比较复杂的问题。 到目前这个阶段，尽管未知的降解菌仍然很多，但是对微生物降解石油的具体生化途径都基本清楚，建立了相应的基因库，实际上对于新筛选菌株，可以利用已知的降解基因，在基因库中寻找最接近的基因，从而进一步确认新菌株的功能基因。这里除了我们在课本上学到的，可以用富集培养基的方法筛选想要的菌种之外，还有一种更高效方法：利用PCR技术进行筛选，根据已有的基因库中的功能基因，设计相应的引物，对提取到的如石油样品中的DNA 进行扩增，筛选其中是否可能需要的菌株。更重要的是可以用这种方法考察修复环境中菌落多样性，这里只要用PCR扩增，观察基因的多样行即可，这时设计引物要尽可能多地获得不同菌种的有关基因，需要整合许多已知基因设计适用于不同菌种的引物。 其实除了用菌群的方法外，还有通过基因工程的方式构造超级细菌。细菌用来分解石油所用的酶主要存在于质粒上，因此只要将相应的质粒导入到一个细菌中，就可以让它分解所有的石油，事实上早在早在20世纪70年代，就有科学家在同一菌株中植入降解乙烷、辛烷和癸烷，降解二甲苯，降解萘和分解樟脑的4种假单胞茵的不同质粒，由此得到的工程菌具有超常规的能力，能够同时降解脂肪烃、芳烃、萜和多环芳烃，且降解石油的速度快、效率高，在几个小时内能降解完海上溢油中2／3的烃类，而自然菌种则需要用一年多的时间，但质粒容易丢失或转移，遗传稳定性差。 在菌降解石油的过程中还受到许多其他因素的影响，有下一位同学来讲。 三、降解石油机制 石油是一种难溶性物质，会在海洋表面漂浮形成油层，这种状态的石油很难被微生物获取利
水面石油污染物的光催化降解
第20卷第3期催 化 学 报1999年5月Vol.20No.3Chinese Journal of Catalysis May1999 水面石油污染物的光催化降解3 赵文宽覃榆森方佑龄董庆华 (武汉大学化学学院,武汉430072) 提 要 制备了漂浮负载型TiO2光催化剂,并用XRD,BET,TEM和SEM等方法进行了表征. 研究了这类催化剂对水面石油污染物的光催化降解,实验结果表明,掺杂Fe3+的TiO2光催化剂具 有高的光催化活性,经高压汞灯照射8h,水面原油降解75%. 关键词 光催化降解,原油污染物,煤灰漂珠,二氧化钛 分类号 O643/X7 据报道,全世界每年因河流和海上事故进入河流和海洋的石油污染物总量在1000万吨以上,对水体及海洋环境造成了严重的污染.因此治理水体的石油污染已成为世界各国共同关心的问题. 现在人们已注意到半导体TiO2的光催化反应能有效地降解水中的有机污染物,它已成为一种有重要应用前景的污水处理方法[1,2].在已报道的TiO2光催化降解水中有害污染物的研究中,大多数采用的是TiO2微粒分散悬浮体系,但是,由于石油类有机污染物不溶于水而漂浮在水面,TiO2的密度(锐钛矿型为3184g/cm3)远大于水,会沉于水底,因此若采用这种悬浮体系将导致TiO2不能发挥光催化剂的作用.为了使TiO2能漂浮在水面与石油类污染物充分接触进行光催化反应,需要将它负载在一种密度远小于水、能使TiO2良好附着且不被TiO2光催化氧化的载体上,制备成能漂浮在水面的负载型TiO2光催化剂.Berry等[3]报道了用环氧树脂将TiO2粉末粘附在木屑上,Heller等[4]用硅偶联剂将TiO2粉末偶联在空心玻璃球上.本文以火力发电厂粉煤灰的漂珠为载体,用钛醇盐水解(及掺杂)制备TiO2纳米粉体,经烧结将TiO2纳米粉体负载于载体上,从而得到了一种新的漂浮负载型TiO2光催化剂.实验表明,该催化剂能漂浮于水面,与水体表面的石油污染物充分接触,达到有效地光催化降解水面石油污染物质的目的. 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 漂珠(北京市石景山电力公司提供,经本实验室分离处理):粒径40～250μm,体积密度0136g/cm3,真实密度0178g/cm3.空心玻璃球SL G(美国PQ公司):粒径10～300μm,体积密度014g/cm3,真实密度0.75g/cm3.原油(马来西亚TAPIS产,武汉石油化工厂提供)经100℃蒸馏,除去低沸点组分.P225TiO2(德国Degussa公司):平均粒径21 nm,锐钛矿型80/金红石型20,比表面积50m2/g.甲基三甲氧基硅烷(武汉大学化工厂).光源为GGZ2125W高压汞灯(上海亚明灯泡厂). 用日本Rigaku D/max2rB型X射线衍射仪(Cu Kα)测定粉体的物相,并通过Sherrer公式计算TiO2纳米粉体的晶粒尺寸;用日本J EOL J EM2100Ⅻ型透射电子显微镜观察粉体的形貌;用美国Micromeritics GEM EN I2360型比表面积分析仪,B ET法测定粉体的比表面积; 收稿日期:1998210212.第一作者:赵文宽,女,1943年生,副教授. 联系人:赵文宽.Tel:(027)87684703. 3国家自然科学基金(批准号29577282)资助项目.