3.植物细胞培养(植物组织培养)

第三章植物细胞培养

植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。Haberlandt（1902）首次尝试分离和培养植物叶片单细胞。

细胞培养的意义

有利于进行细胞生理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。

进行细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微生物遗传技术用于高等植物以进行农作物的改良。

细胞培养的增殖速度快，适合大规模悬浮培养，生产一些特有的产物，如许多种植物的次生代谢产物，包括各种药材的有效成分等，用于医药业、酶工业及天然色素工业，这是植物产品工业化生产的新途径。

由于植物组织培养中细胞之间在遗传和生理生化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出一定的差异。这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病虫和抗逆性等方面。所以由单细胞培养获得的单细胞无性繁殖系，并对不同的细胞进行研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。

细胞培养就是从高等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进行培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。

第一节植物细胞培养

一. 单细胞培养

(一)单细胞分离

1.机械法

2.酶解法

3.从愈伤组织中分离

(二)单细胞的培养方法

1、平板培养（细胞的生长周期）

2、看护培养

3、微室培养 4. 条件化培养

二. 细胞悬浮培养

（一）悬浮培养的方法

1、分批培养（细胞的生长周期）

2、半连续培养

3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）

4、固定化培养

（二）培养细胞的同步化

1. 化学方法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）

2. 物理方法（分选、低温）

（三）培养基振荡

一、单细胞培养

（一）单细胞的分离

1.机械法: Ball(1965)首次由花生成熟叶片利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术。

⑴刀片刮: 取下叶片→叶片消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表皮(露出叶肉细胞) →用解剖刀刮下细胞→单细胞悬浮培养

⑵研磨离心法: 取下叶片→叶片消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶片+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离心(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养

研磨介质: 20μmol蔗糖+ 10μmol MgCl2 + 20μmol Tris-HCl (pH7.8)

机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发生质壁分离。

（缺点）（3）材料要求是薄壁细胞、组织排列松散。（4）产量低

2. 酶解法

利用果胶酶使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞的技术。

Takebe等(1968) 以烟草叶片为材料：

过程：叶片消毒→撕去下表皮→切成小方块(约4cm)→加酶液(2g叶片+20ml无菌酶液)→真空抽气→25℃振荡酶解2h (每30min换酶液1次,共4次)→①弃掉、②海绵簿壁细胞、③、④叶肉栅栏细胞

酶液组成：含0.5%果胶酶，0.8%甘露醇和1%硫酸葡聚糖钾（是原生质膜的稳定剂，以降低酶液中核糖核酸酶活力，保持质膜稳定性，提高游离细胞产量）

酶解法的特点：能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。

3.由培养的愈伤组织中分离单细胞

首先通过固体培养诱导外植体脱分化,把未分化和疏散的愈伤组织转移到装有液体培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上进行振荡培养，并得到游离细胞。

振荡的作用：

（1）对细胞团施加一定的缓和压力，使之破碎成小细胞团或单细胞。

（2）振荡可使细胞或细胞团在培养基中均匀分布。

（3）促进培养基和容器内气体交换，保证细胞正常的呼吸代谢。

(二)单细胞的培养方法

1.平板培养法（plate cultivation method）

是将悬浮培养的细胞接种到薄层培养基上进行培养的过程，是常用的单细胞培养法。

单细胞的获得：先将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤除去较大的细胞团，留下游离的单细胞和小细胞团，从而得到单细胞无性系。

细胞记数：过滤的悬浮培养材料先进行细胞计数，使悬浮培养液达到要求的细胞培养密度。烟草细胞培养的最适密度0.5-1.0×104/ml。

细胞培养：将0.6%～1%琼脂的培养基灭菌后，冷却到35℃，在恒温水浴中，将细胞悬浮液接种进去，充分混合后倒入培养皿中。当培养基凝固后，细胞均匀分布并固定在约1mm厚的培养基中,在25℃暗条件下培养，20d后再计数每只培养皿中出现细胞团的数目，并计算植板率。

每个平板上形成的细胞团数

植板率= x100%

每个平板上接种的细胞总数

过程：

单细胞的获得（过滤悬浮培养物）→细胞计数（血球计数板）

→调节密度（最终植板密度的2倍）

相同成分培养基（0.6～1%琼脂）制备（冷却至35℃）→等量混合→铺平皿（均匀分布在1mm厚，封口膜封口）→标记单细胞（为获得纯的无性系）→25 ℃暗培养20d →计数细胞团，计算植板率

应注意问题：

1）选择合适的培养基，以降低细胞起始密度；

2）选用分裂旺盛时间的细胞（此时分裂能力强，不用久处于静止期的细胞）

3）培养基的温度要严格控制（35 ℃，过低，操作困难，凝固快而使细胞分布不均匀；过高，对细胞产生伤害）

2. 看护培养法（nurse cultivation method）

用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。

Muir等（1954）设计：把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间有一片滤纸相隔。

特点：看护愈伤组织可给单细胞的生长与分裂提供培养基的营养成分，而且活跃生长的愈伤组织所分泌的代谢产物，为单细胞的分裂提供一些活性物质。

直接接种在培养基上不能分裂的离体单个细胞，在看护愈伤组织的影响下就可能发生分裂。

3.微室培养(Microchamber culture)

将单个细胞放到人工制造的一个小室中进行培养的一种方法。

此方法的优点：在培养过程中可以连续进行显微观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录。

4.条件培养基培养法（conditioned medium culture method）

在培养基中加入高密度的细胞进行培养，经过一定时间后, 这些细胞向培养基中分泌一些促进细胞生长的活性物质，使培养基条件化。使原来在合成培养基上不能分裂的细胞发生分裂。

二、细胞的悬浮培养

悬浮培养(suspension culture): 指将游离的植物单细胞或小细胞团,按一定的细胞密度,在受到不断搅动或摇动的液体培养基中进行培养的一种方式。

是在单细胞培养的基础上，得到优良的、遗传基础稳定的单细胞无性系扩大培养。

20世纪50年代以来,从试管的悬浮培养发展到大容量的发酵罐培养。从不连续培养发展到半连续和连续培养。

80年代以来，植物细胞培养作为生物技术的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的科技产业体系。

悬浮培养特点：

1）细胞可不断增殖，且细胞增殖的速度比愈伤组织快，可形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；

2）能提供大量比较均匀一致的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

悬浮培养一般采用愈伤组织作为起始细胞来源：

用于建立悬浮体系的愈伤组织至少应该具备的条件：

1、要有较好的松散性，使之在悬浮培养的起始阶段容易打散；

2、要具备较强的增殖和再生能力；

3、组成愈伤组织的细胞要有较高的均匀一致性。

为了获得符合条件的良好愈伤组织:

1、必须选择适宜的外植体材料。研究表明，胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。

2、培养基的附加成分对疏散型愈伤组织的诱导具有较大的影响，其中生长素的浓度最为重要。

3、愈伤组织培养阶段必须进行必要的选择和继代。

一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个基本条件：

1. 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下。

2. 均一性好，细胞形状、细胞团大小及其生理状态大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。

3. 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加1倍。

（一）悬浮培养的方法

分批培养、半连续培养、连续培养

1、分批培养（batch culture）

指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，建立单细胞培养物的培养方式。

除了气体和挥发性代谢产物可以与外界环境交换之外，其他条件密闭。当培养基中的主要成分耗尽时，细胞的分裂和生长停止。因此，为了使分批培养的细胞不断增殖，需要进行继代培养。

细胞数目的变化曲线：从培养开始起到细胞增长停止的整个生长周期中，细胞数目增加的变化大致呈“S”型曲线。

（延滞期、对数增长期、直线生长期、缓慢期、静止期）

①延滞期(lag phase)：细胞很少分裂，细胞数目增加少。

②对数生长期(logarithmic phase)：细胞分裂活跃，数目迅速增加。

③直线生长期(linear phase)：细胞增殖最快时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定, 细胞数目达到最高峰。

④缓慢期(retard phase)：培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，增长速度逐渐变慢。

⑤静止期(stationary phase)：生长趋于完全停止。

分批培养的优点：培养装置和操作简单，应用方便。

分批培养对于研究细胞的生长代谢并不是一种理想的培养方式，在分批培养中，由于细胞生长和代谢的方式、培养基成分的不断改变，没有一个稳定的生长期，相对于细胞的数目、代谢产物和酶的浓度也不能保持恒定。这些问题在某种程度上，可通过连续培养加以解决。

2.半连续培养——利用培养罐进行大量细胞培养的一种方式。

当培养罐内细胞数目增殖达到一定数量后，将1/2的细胞悬浮液倒于另一个培养罐中，分别添加新鲜培养基继续进行培养。

该培养方法能重复地获得大量均匀一致的培养细胞。

如：Greabe(1966)培养玉米胚乳细胞,细胞增长量3.6-4.5g.L-1.d-1。

3.连续培养：利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。

特点：

⑴不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，可以保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。

⑵可在培养期间使细胞长时间保持在对数生长期。

⑶适于大规模工厂化生产。

连续培养可分为：封闭型和开放型

1）封闭型连续培养

在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，排出液中的细胞经机械收集后又放回到培养系统中；培养容积不变，随培养时间延长，细胞不断增殖，细胞密度不断增加。旧培养液用虹吸法排出。

2）开放型连续培养

在培养过程中，注入的新鲜培养液的容积与流出的细胞培养物溶液容积相等，同时要求细胞密度保持恒定，即细胞增殖速度的稳定。

细胞密度保持恒定的两种控制方法：

①化学恒定式

a、以固定速度注入新鲜培养基，并将培养基内的某种营养成分（如氮、磷或葡萄糖）的浓度设定为细胞生长限制因子，以调控细胞的增殖速度。

b、控制培养液进入的速度，使细胞稀释速度正好和细胞增殖速度相同，保持培养液中细胞密度的恒定。

②浊度恒定式：

新鲜培养基为间断注入，受细胞密度增长所引起的培养液浑浊度变化的控制。

确立一定的细胞密度，当超过这个细胞密度时，自动加入新鲜培养基，并使旧培养液随细胞培养物一起排出。

比浊计或分光光度计来测定培养液中细胞的混浊度。

（二）培养细胞的同步化

指培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。

同步性的程度以同步百分数表示。可以由在某一瞬间处于细胞周期中某个时期的细胞所占的百分数表示；也可以在一个短暂具体的时间内，通过细胞周期中某一点的细胞的百分数表示。

实现悬浮培养细胞同步化的方法主要有两种。

1.饥饿法

断绝供应细胞进行正常细胞分裂所必须的一种营养成分或激素，让细胞停滞在G1期或G2期。经过一段时间的饥饿处理后，重新将这种限制因子加入培养基，静止细胞就会同时进入下一阶段的分裂。

2.抑制法

使用化学药物处理，如DNA合成抑制剂（5-氨基尿嘧啶、胸腺嘧啶脱氢核苷），阻止了DNA的合成，细胞周期只能停留到G1期，处理一段时间后，把这些抑制物除去，细胞进入同步分裂。

3.分选法：通过细胞体积大小分级将处于相同细胞周期的细胞进行分级，将同一周期的细胞继代培养于同一体系中，使相同体系中的细胞具有较好的一致性。

优点：操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理而带来的对细胞活力的影响。

缺点：分选的精细程度较差。

方法：常规分选细胞的方法：过滤+梯度离心

精细分选细胞的方法：流式细胞仪（Flow Cytometer )

4. 低温处理：4～6℃

（三）培养基的振荡

1.旋转式摇床：摇床载物台：瓶夹，摇床的速度：以转速30～150r/min为宜，冲程范围在2～3cm左右。

2.慢速转床：1-2r/min，Steward(1952)为胡萝卜细胞培养设置,培养瓶与主轴倾斜(12°），转床可安装日光灯。

3.自旋式培养架：转轴与水平面成45°角，可放置2个10L培养瓶，适宜进行大量的悬浮培养。旋转速度可根据培养物不同进行调节。

第二节细胞生长和活力的测定

一、悬浮培养中细胞生长的测定

（一）细胞计数

先用铬酸（5%～8%）或果胶酶（0.25%）对细胞和细胞团进行处理，增加细胞的分散性。

Street等计数槭树细胞的具体方法是，把1份培养物加入到2份8%三氯化铬溶液中，在70℃下加热2～15min，然后将混合物冷却，用力振荡10min后，用血球计数板进行细胞计数。

（二）细胞密实体积（PCV）及细胞总体积

细胞密实体积（PVC)：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。

将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个刻度离心管中，在2000g下离心5min，可以得到细胞沉积的体积，血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供细胞计数用. 这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3.

计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成,

（三）细胞鲜重和干重

悬浮培养物倒入已知重量的尼龙丝网上，用冲洗掉培养基，真空抽滤除掉细胞上多余的水分，称量-----细胞鲜重。

在60℃下干燥12h，再称量-----细胞的干重。

细胞的干重是以每毫升培养物或每106个细胞的重量表示。

（四）细胞有丝分裂的指数

在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。指数越高，表明细胞进行分裂的速度越快。迅速生长的细胞群体有丝分裂指数3%～5%。

孚尔根染色法测定有丝分裂指数：鉴定了染色体上DNA的存在，将愈伤组织用1mol/L HCl在60℃水解后染色，然后在载玻片上按常规方法镜检，随机检查500个细胞，统计其中处于有丝分裂各个时期的细胞数目，计算出分裂指数。

二、培养细胞活力的测定

1.四唑盐还原法（TTC法）

活细胞呼吸作用产生的还原力（NADH，NADPH），可TTC（2,3,5-氯化三苯基四唑）被还原成红色染料，通过显微镜观测被染色细胞的数目，计算出活细胞的百分率。或将还原的TTC红色染料用乙酸乙酯提取出来，用分光光度

计进行测定细胞的相对活力。

2.荧光素二乙酸法（FDA法）

丙酮制备0.5%的FDA贮备液，加入到细胞或原生质体悬浮液中，浓度为0.01%。保温5min后，用荧光显微镜检查细胞。活细胞中FDA被酯酶分解，产生有荧光的极性物质荧光素。积累在活细胞中，死细胞中不能积累。细胞活力以发绿色荧光的活细胞百分数表示。

3.伊凡蓝（Evens blue）染色法

伊凡蓝稀溶液(0.025%)对细胞进行处理，死细胞和活力受损伤的细胞能够吸收这种染料(兰色)，而完整的活细胞不能摄取或积累这种染料。因此，不染色的细胞均为活细胞。

细胞活力以未染色的活细胞数占总观察细胞数的百分数表示。

第三节细胞培养的应用

一、天然化合物的生产与转化

（一）植物次生代谢产物的生产

糖、蛋白、氨基酸、生物碱、抗生素、黄酮、糖苷、色素、皂苷、萜类、甾体类。

植物细胞培养物天然化合物产量低原因:

①形态生理原因,细胞培养缺少完整植株具有转化反应能力.

②我们对合成这些天然化合物所需要的营养条件及影响因素缺乏了解,如培养基成分\培养条件、细胞基因型等。（二）进行特定的生物转化反应

生物转化：利用生物系统水解、加氢、羧化、脂化、氧化还原一系列生理生化反应，将有机物产物分子转化为新的化合物或提高该物质的产量的过程。

1.提供植物细胞一种中间产物或底物,目的是生产一种自然界不存在的新化合物。植物细胞能使加入的基质发生生化反应，合成生物体内原来没有的新化合物。

2. 给细胞提供某种天然化合物的中间体或前体，目的是提高该种天然化合物在细胞中的产量。

（三）细胞的工厂化生产

工厂化生产途径的3个步骤：

1.高产细胞株的选择

将所分离纯化的细胞群，以一定密度接种进行平板培养,根据不同培养目的对其进行鉴定和测定，从中选择出高产、高品质的单细胞无性系。

2.“种子”培养

对高产的细胞株或细胞无性系进行扩大繁殖，目的是获得培养细胞来用做大量培养时的接种材料。

3.细胞的大规模培养

将选择的目的单细胞无性系，用发酵罐或生物反应器进行工厂化细胞培养以生产所需要的化合物。

二、突变体选择

1、直接选择法：适用于抗性变异的细胞选择。

具体方法是在培养基中加入某种对细胞有毒害的物质，当多数细胞死去之后，把少数能存活的细胞系分离出来。然后转入含同样毒素但浓度更高的培养基上，进一步检验这些细胞系的突变性质。

抗抗生素，抗除草剂，耐高盐浓度的细胞等。

2、间接选择法（负选法）：

例如，在抗氯酸盐细胞的选择中，分离出了硝酸还原酶（NR）缺失突变细胞系。高毒性亚氯酸盐将含有硝酸还原酶的细胞都杀死，存活下来的只有硝酸还原酶缺失的突变细胞。由于这些细胞没有这种酶，也没有亚氯酸盐生成，所以，在筛选抗氯酸盐的突变细胞中，结果获得了硝酸还原酶缺失型突变体。ClO3+NADH ClO3+NAD

三、诱导多倍体

第四节人工种子

一、人工种子概念及意义

1、人工种子（plant artificial seed）：

指在胚状体外面包裹一些有机化合物，作为保护胚状体及提供营养的“种皮”，形成与真种子类似的结构。

包括体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三部分。

√最外一层为有机的薄膜，保护水分免于丧失和防止外部的物理力量的冲击；——人工种皮

√中间为包埋材料及含有胚状体所需要的营养成分和某些植物生长调节剂；人工胚乳

√最里面是胚状体或芽。

广义：任何一种经人工种皮包裹或裸露的具有形成完整植株能力的繁殖体均可称为人工种子。

2、分类：

Redenbaugh(1984)将人工种子分四类：

①裸露或休眠繁殖体，不加外层包裹成株率也比较高，可直接种植。微鳞茎、微球茎及鸭茅草胚状体。

②由一层聚氧乙烯“种皮”包裹，胚吸收水分后，能够发芽。胡萝卜胚状体。

③水凝胶包裹的胚状体、不定芽等繁殖体，常常加入多种养分或激素而促进发芽。苜蓿体细胞胚。

④液胶包埋，将含水的繁殖体由液胶包埋起来。甘薯体细胞胚。

3、人工种子的优点

①使自然条件下不易结实或种子昂贵的某些材料能快速繁殖和保存。

②繁殖速度快,1L发酵罐，20天时间可以生产1千万个人工种子。

③为基因工程技术应用于生产提供桥梁。

④在人工种子种皮制作中，加入各种营养成分或生长调节剂，调节植物生长，提高植物抗逆性。

⑤固定杂种优势，使F1代杂种多代利用。

⑥便于运输与贮藏(相对于试管苗)

二、人工种子制备技术

典型的人工种子的制备的程序主要包括: 体细胞胚（或其它繁殖体）的生产、成熟与干燥、人工种子的包埋等。（一）体细胞胚（或其它繁殖体）的生产

繁殖体是人工种子的主体。早期的研究认为，体细胞胚是人工种子制备的最佳繁殖体，因为它具有完整的种子结构，且繁殖速度快。

作为人工种子核心部分的体细胞胚，必须达到一定的标准：要有较高的同步化程度和活力，且可规模化生产；形态正常，具有完整的胚结构；与母体植物的基因型基本相同，特别是在重要经济性状上无变异（遗传稳定性好）；具有较好的成熟性，能耐受一定程度的脱水。

（二）成熟与干燥

成熟培养基有三个特点:

①在培养基中减少或除去激素。由于激素减少，早期发育的幼胚停止生长，从而使胚状体的同步性提高；

②加入ABA及提高蔗糖浓度。加入ABA有助于营养成分积累，胚中的脂肪、淀粉及蛋白质含量增加，诱导其进入休眠，与合子胚发育情况类似，如在培养基中加入8～12μmol/L的ABA，可显著提高针叶树胚状体的成熟；

③加入PEG。加PEG可使胚中水分减少，不会发生质壁分离，类似天然种子成熟过程的自然脱水现象，提高人工种子抗逆能力。

苜蓿体胚在成熟培养基上，含水量可降低到8-15%。萌发成株率在70%以上，而不加PEG，成株率为0。

微型变态器官繁殖体也需要适当干燥和休眠处理，如果不是离体培养材料还要进行表面消毒处理，以防止包埋后的污染。

芽繁殖体不能进行脱水处理，只需选择生长健壮、组织充实的芽用于包埋。

（三）人工种子的包埋

人工种子的包埋包括人工胚乳和人工种皮的包裹。

包埋介质要求：

1、保护及安全性：既要能对繁殖体起保护作用，又要对繁殖体没有毒害，同时还要具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全性。

2、营养作用：包埋介质中最好能够混合一定的营养成分，提供类似于胚乳的营养物质以供繁殖体发芽的需要。

3、抗菌抗病作用：由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物的感染危害，因此，介质中还应含有适当的杀菌剂等。

根据这些要求，人工胚乳至少应该包括基本培养基成分、碳源、生长调节物质及其它一些物质（如杀菌剂、防腐剂、除草剂、农药、抗生素、有益菌等）。

包埋材料（凝胶）：琼脂、琼脂糖、藻酸盐、淀粉、动物胶、阿拉伯树胶、果胶、蛋白胶等。

常见的人工种子的包裹方法有：

1. 离子交换法

络合凝胶点滴法：将胚状体与2%海藻酸钠混合液，滴入适量的+2价或+3价金属盐溶液，如硝酸钙(100mmol/L)或氯化钙（1%），钙离子与钠离子发生离子交换反应，点滴在30min内完全能形成胶珠。

2. 干燥法

用2.5%聚氧乙烯(Polgoxethylene)作为包裹介质，干燥固化。

3. 冷却法

0.25% Gelrite胶包埋，冷却固化。

最后，可用加二氧化硅等物质，即可阻止水分蒸发，又可避免种子粘连。

人工种子制备技术

(一）胚状体的诱导（胡萝卜）

外植体表面消毒，在无菌条件下发芽成无菌苗。

诱导胚性愈伤组织，切割下胚轴或子叶，接种与2,4-D 0.5-1.5mg/L MS培养基上,脱分化诱导产生胚性愈伤组织.继代振荡培养,将细胞悬浮培养在MS0培养基上,诱导产生胚状体。尽可能使胚状体发育成熟,同步化程度高.

（二）成熟与干燥

有些植物胚状体需要在成熟培养基上,进一步成熟干燥.培养基有三个特点:除去生长分化激素;附加适宜脱落酸

（ABA）,加入聚乙二醇（PEG）。

苜蓿体胚在成熟培养基上，含水量可降低到8-15%。萌发成株率在70%以上，而不加ABA，成株率为0。

（三）人工种子的包埋

胶囊膜（人工种皮）

藻酸盐、明胶、琼脂糖包埋材料，具有胶凝性好、使用方便、无毒性、价格低廉优点。但保水性差、易粘连、机械强度差等。为了减少水分丢失，避免胶囊粘连，研究者对胶囊膜材料（外种皮）进行实验。

理想的人工种皮要求：

①应该具有一定的封闭性，以保证人工胚乳的各种成分不易流失；

②应该具有良好的透气性，以保证繁殖体维持生理活性的需要；

③要有一定的坚硬度，以加强人工种子的贮藏性能和适于机械化操作；

④无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽；

⑤配制简单易行，成本低廉等。

常用人工种皮：

采用Elvax4260（乙烯、乙烯基乙酸、丙烯酸共聚物）作为外种皮，形成一层疏水外皮，可以使人工种子润滑易流动，并降低水分蒸发。但价格昂贵，操作复杂，包裹效果不尽人意。

二氧化硅化合物包裹材料：如疏水的Tullanox和微亲水的Cab-O-Sil，(微粉硅胶,胶态氧化硅），二者均可以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在上述材料中滚动即可完成包被过程，操作简单易行，大量生产还可以机械化操作。

最近还报道一种硅酮种衣，它不仅可以抗真菌，而且可渗入水蒸气和氧气，这些材料均还处于试验之中。

人工种子制作流程

1.消毒：天然种子或幼嫩外植体进行表面消毒。

2.无菌苗制备：在无菌条件下培养获得无菌苗（一般外植体除外）。

3.诱导分化：下胚轴或子中等外植体，在适宜的培养基上诱导产生胚状体或不定芽。

4.包埋：挑选一定生长时期的胚状体（或不定芽）悬浮于海藻酸钠溶液中。

5.固化：滴珠法制作人工种子，固化剂为氯化钙水溶液。

6.洗涤：无菌水冲洗人工种子。

7.萌发：在无菌条件下萌发长成植株。

8.生长：小植株移入盆中栽培生长。

三、人工种子的贮藏与萌发

人工种子放在低温（4℃）下贮存有一定效果，但时间稍长，其萌发率明显降低。通过对人工种子进行脱落酸、蔗糖，低温及干燥处理，可增加贮藏时间。

细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

小结

第一节植物细胞培养

单细胞培养(分离方法,培养方法)

悬浮培养[分批(细胞生长周期),半连续培养,连续培养(封闭型,开放型)]

第二节细胞生长和活力的测定

生长的测定(细胞计数,密实体积,鲜/干重,有丝分裂指数,植板率,比生长速率,加倍时间等)

细胞活力测定(TTC法,FDA法,Evens blue法等)

第三节细胞培养的应用

天然产物的生产与转化,突变体的诱导与筛选,多倍体诱变等

第四节人工种子

结构,种类,制备,贮藏与萌发等

植物组织培养的基本步骤

植物组织培养的基本步骤 成熟细胞离体——（脱分化）——分生细胞——（分裂）——愈伤组织——（再分化）——形态建成————完整植株。 培养基的主要成分 【水分】 【无机盐】1.大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S（由相关的无机盐提供） 2.微量元素：Fe，B，Cu，Mn，Mn，Zn，Co 【有机营养成分】1.糖类 2.维生素 3.氨基酸 4.肌醇 5.天然有机物【植物生长调节剂】1.生长素 2.细胞分裂素 3.其他生长调节剂 【凝固剂】琼脂 【其他物质】1.活性炭 2.抗生素 3.抗氧化物质 4.硝酸银 培养基和组织培养用具的灭菌方式 【培养基，无菌水】高压蒸汽灭菌，0.105MPa灭菌15~30分钟 【移栽基质】曝晒，甲醛熏蒸或高压蒸汽灭菌0.14MMPa灭菌1~2h 【接种室，缓冲室】紫外线灯照射30min，或气雾消毒剂 【超净工作台】紫外线灯30min，之后打开风机过滤除菌 【外植体】不同的化学消毒剂浸泡消毒 【接种工具】70%乙醇浸泡或擦拭，之后用火焰灼烧灭菌 【培养室】3%来苏尔喷雾，或甲醛，气雾消毒熏蒸 【皮肤】先用肥皂洗手，接种前用70%乙醇擦拭 【瓶口，管口】70%乙醇擦拭，用火焰封口

【培养瓶表面】70%乙醇擦拭 【台面，桌面】70%乙醇擦拭或喷雾消毒 植物外植体的灭菌方式 【茎尖，茎段，叶片】1. 用70%乙醇浸泡30秒，再用无菌水冲洗1次。 2.用2%次氯酸钠浸泡15min或0.1%升汞浸泡5~10min。 3.若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴吐温。 4.消毒时要不断震荡，使植物材料与消毒剂充分接触。 5.最后用无菌水冲洗3~5次。 【果实】1.用乙醇迅速漂洗一下，再用无菌水冲。 2.用2%次氯酸钠浸泡10min，用无菌水冲洗2~3次。 【种子】用10%次氯酸钠浸泡20~30min，或0.1%升汞消毒5~10min，然后再用无菌水冲洗3~5次。 【花蕾】1.用70%乙醇浸泡10~15秒，无菌水冲洗一次。 2.在漂白粉中浸泡10min，用无菌水冲洗2~3次。 【根及地下部器官】用0.1%升汞浸泡5~10min 或用次氯酸钠浸泡10~15min，再用无菌水冲洗3~5次。 【消毒后的外植体应及时按照无菌操作技术接种在适宜的培养基上】

植物组织培养复习资料.doc

1.植物组织培养按培养对象分为______ 、 _______ 、________ 、 ________ 、________ 等几种类型。 2.一个己停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成耒分化的愈伤组织的现象称为 n tv 3.不同的灭菌剂其灭菌的机理一般不一样，次氯酸钙和次氯酸钠都是利用分解产生 _________ 来杀菌的；升汞是靠 ________ 来达到灭菌日的。 4.去除植物病毒的主耍方法是 _____ 和_______ 两种方法，当把二者结合起來脱毒效 果最好 5.在通过微茎尖培养脱毒时，外植体的大小应以成苗率和脱毒率综合确定，一般以 __________ mm、带 ________ 个叶原基为好。 6.White培养基________ 浓度低，适合生根培养。 7.一个已停止分裂的成熟细胞转变为_________ 状态，并形成_________ 的现象称为“ 脱分化”。 8.BA/NAA的高低决定了外植体的发育方向，比值低时促进 ________ 的生长，这时 _________ 占主导地位；比值高促进_________ 的生长，这时 _________ 占主导地位。 9.进行植物组织培养最基本的前提条件是 _____ 。 1、植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。 2、组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、空调机、夭平、显微镜、蒸饱水发生器等。 3、糖在植物组织培养中是不可缺少的，它不但作为离体组织赖以生长的碳源，而且还能维持培养菇渗透压 4、培养基灭菌一般在-108 kPa的压力下,锅内温度达121 °C ,维持20-30 min o 5、在离体叶培养中，6?BA和KT利于芽的形成:24D利于愈伤纟FI织的形成 6、在离体叶组织脱分化和再分化培养屮，茎和芽的分化主要有4个途径：方?接产生不泄芽、由愈伤组织产工不定芽、胚状体形成、形成球状体或小鳞茎等途径。 7、目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径是茎尖培养脱毒。 8、花药培养前的预处理:低温冷藏是最常用的方法。 1、植物组织培养的发展分为三个阶段：萌芽阶段、奠基阶段和快速发展和丿、'、/「用阶段。 2、培养基最常用的碳源是蔗糖,使用浓度在1%?5%常用 _3_%o 3、培养基的种类按其态相不同分为固体培养基与液体培养基，其火菌方法一般采用壷热消毒灭菌方法。 4、 pll的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pll大于6.0时，，培养基将会 ___________ ,低于5.0时，琼脂不能很好地凝同。 5、一般情况下，生长索/细胞分裂素的比值高，有利于根的形成和愈伤组织的形成:比值低有利于芽的形成。

植物组培培养基的成分

植物组培培养基的成分 培养基是人工配制的，满足不同材料生长，繁殖或积累代谢产物的营养物质。在离体培养条件下，不同种类植物对营养的要求不同，甚至同一种植物不同部位的组织以及不同培养阶段对营养要求也不相同。筛选合适的培养基是植物组织培养极其重要的内容，是决定成败的关键因素之一。 大多数植物组织培养基的主要成分是无机营养物质（大量营养元素和微量营养元素）、碳源、有机添加物、植物生长调节剂和凝胶剂。一些组织可以生长在简单的培养基上，这些培养基只含无机盐和可利用的碳源（蔗糖），但大多数组织必须在培养基中添加维生素、氨基酸和生长物质，而且经常还将一些复合的营养物质加入到培养基中，这种由“化学定义”的化合物组成的培养基称为“合成”培养基。 人们已设计了许多培养基用于特殊组织和器官的培养。 怀特培养基是最早的植物组织培养基之一，最初作为根培养的培养基。为了诱导培养组织器官发生和再生植株，广泛使用含有大量无机盐成分的MS（Murashige和Skoog，1962）和LS(Linsmaier 和Skoog，1965)培养基。原本为细胞悬液或愈伤组织培养而设计的B5培养基，经过改良后，被证实有利于原生质体培养。同时，B5培养基也被用于诱导原生质体再生植株。尽管Nitshch(1969)为花药培养设计的培养基仍然使用频繁，但另一个称为N6的培养基，专门用于禾谷类花药培养和其他组织培养。类似的，N6培养基越来越多地

用于大豆、红三叶草和其他豆科植物的培养。该培养基营养成分促进胚性细胞和原生质体再生细胞快速生长。使用这些培养基成功的原因很可能是营养元素的比例和浓度基本上满足不同培养体系中细胞或组织生长和分化的最适需要。 植物组织培养基中无机和有机成分的浓度用质量浓度（mg/L 或ppm，但现在习惯用mg/L）或物质的量浓度(mol/L)表示。按照国际植物生理学协会的推荐，应该用mol/L表示大量营养元素和有机营养成分浓度，用μmol/L表示微量营养元素、激素、维生素和有机成分浓度。用物质的量浓度的优点是，每一种化合物每一摩尔的分子数是常数，所以按照特定培养基配方配制培养基时，无论无机盐化合物的水分子数为多少，原物质的量浓度都可以使用。但是，用质量浓度来表示浓度的话，就不能不考虑无机盐化合物的水分子数目了。 1、水分 水分是植物体的主要组成部分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，在植物生命活动过程中不可缺少。配制培养基母液时要用蒸馏水或纯水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程中发霉变质。研究培养基配方时尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。而在大规模工厂化生产时，为了降低生产成本，常用自来水代替蒸馏水。如自来水中含有大量的钙、镁、氯和其他离子，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。

植物组织培养复习重点

组培复习材料 一、名词解释 1、培养基：是离体植物（外植体）赖以生长、分化的基础，是根据植物的需求，人工配制的含有各种营养成分的营养液。 2、液体培养：把细胞或生物体的一部分，置于液体培养基中使其发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培养的一种方法。 3、种子培养：是成熟种子和发育不全的未成熟种子的无菌培养。 4、叶培养：从母体植株上将叶组织（包括叶原基在内）切下，放在无菌的人工条件下使其生长发育形成植株的技术。 5、热处理脱毒：在一定范围内，用高温处理可部分或完全钝化植物组织中的某些病毒而不伤害或很少伤害植物本身的脱毒方法。 6、花药培养：是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成杯状体，然后再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。 7、连续培养：是利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。（培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉等体积用过的培养基，或者抽取悬浮培养物，使培养物的营养物质得到不断补充，从而保持其恒定体积的培养。—— 8、分批培养：指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，建立单细胞培养物的培养方式。（细胞生长在固定体积的培养基中，当主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即停止。） 二、简答题 1、MS培养基特点。 答：MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，具有高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐用量大，还有一定数量的铵盐，其养分的数量和比例合适，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，加速愈伤组织和培养物的生长，当培养物就不转移时仍可维持其生存。目前应用最广泛。 2、植物组培生产特点。 答：①和传统的生产方式相比，具有不占耕地、生产不受季节限制而且能够整年连续进行、不受灾害性天气和病虫害影响的特点； ②具有人为可控性，可采用更适合于植物生长的“培养基”代替土壤提供养分和生长调节物质；

植物组织培养实验基本步骤。。

植物组织培养实验基本步骤 一、母液的配置 1、MS大量元素母液的配制 将大量元素配制成10倍的母液，使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3 、KNO3 、KH2PO4 、 MgSO4·7H2O 、CaCl2·2H2O ，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 2、MS微量元素母液的配制 将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4· 4H2O 、ZnSO4·7H2O 、 H3BO3 、KI 、CuSO4·5H2O 、CoCl2·6H2O ，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 3、MS铁盐母液配制 将铁盐配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：称

FeSO4·7H2O 和Na2·EDTA ，把FeSO4·7H2O和Na2·EDTA·2H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2·EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。 4、MS有机化合物母液的配制 将有机化合物配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇、维生素B1 、烟酸、甘氨酸、维生素B6 、蔗糖，用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后，转入500ml 细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 二、植物激素的配置 常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、6－苄氨基嘌呤（6－BA）、赤霉素（GA3）、 1、生长素类： （1）、生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织

植物组织培养知识点总结

植物组织培养知识点总结第一、二章 1植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 2实验室各分室名称、主要设备、主要功能 3无菌操作技术流程 4表面消毒剂种类及作用效果 5培养基成分及各成分的作用 6植物组织培养三大难题 7那些成分要抽滤灭菌 第三、四章 8植物细胞全能性原理 9名词解释：愈伤组织、脱分化、体细胞胚、人工种子 10体细胞胚的特点 11愈伤组织形成发育的三个时期，两种类型，良好愈伤组织的特点 12植物离体微繁，一般过程，各阶段注意事项 13褐变，影响褐变的因素，克服褐变的措施；玻璃化，无糖培养技术第五、六、七章 14植物脱毒方法、原理 15脱毒率包括两种方面含义 16人工诱导单倍体的三种途径 17花药培养得到的再生植株倍性如何，为什么 18花药培养的应用，花药培养力，一般培养过程。 19离体幼胚培养，胚发育有几种类型各有何特点 20离体授粉离体受精 21简述胚乳培养的意义

第八、九章 22原生质体概念，两种分离方法，纯化方法。 23酶法分离植物原生质体的酶液组成及作用 24简述植物原生质体培养基的特点 25原生质体融合，融合的主要方法 26体细胞杂交过程 27融合产物的种类及特点 28植物细胞无性系变异，特点 29提高植物细胞无性系变异频率的方法 30细胞突变体的类型及对应的筛选方法 植物组织培养知识点总结 第一、二章 1植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 概念：是一种将植物的器官、组织或细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术。 分类：（1）按外植体来源和特性分：植株培养胚胎培养器官培养组织或愈伤组织培养细胞或原生质体培养；（2）按培养方法分：固体培养液体培养固体液体两相培养 应用：（1）克服远缘杂交中杂种不育性，种子无活力或配发育不全的植物获得后代，一年多代育种（2）培育三倍体（3）单倍体育种（4）提高突变频率，筛选变异类型（5）经过细胞融合得到体细胞杂种（6）种质资源保存 2实验室各分室名称、主要设备、主要功能 化学实验室（准备室）

植物组织培养实验设计及.doc

植物组织培养实验设计及 常用设备的使用与维护 一．实验目的 1.熟悉植物组织培养实验室的组成及设备 2.掌握植物组织培养实验室的设计要求 3.熟悉植物组织培养所需的仪器设备 二．实验原理 植物组织培养是通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。要达到无菌操作和无菌培养，就需要人为创造无菌的环境，使用无菌的器皿及器械，同时还需要人工控制的温度,光照，湿度等培养条件。无菌环境和培养条件的创造需要一定的设施及设备。 三．实验步骤 1.实验室的设计要求 功能齐全、布局合理、环境清洁、易于灭菌 2.实验室的组成及功能 实验室的组成： 洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、观察记录室、储藏室、移苗室 实验室的功能： 洗涤室用于玻璃器皿、实验用具的清洗、干燥、培养材料清洗、预处理也可在本室完成。室内应建造大型水槽和一个或几个浸泡

池，水槽最好上一内衬白瓷片的水泥槽，为防止碰坏玻璃器皿，下面可铺一活动的橡胶板。备有晾瓶架，用于放置刷净的培养器皿，配备有一定数量的周转盘或小推车，用于运输培养器皿。地面要注意防滑，排水通畅，墙壁要有耐湿、防潮功能。 药品室用于存放各种药品试剂。室内要求干燥、通风，避免光照，配有药品柜、冰箱等设备。化学试剂物品分类存放于柜中，有毒物质如升汞需要专人密封保存。原药可室温下存放，配好的母液，宜置于4℃冰箱中保存。药品室紧邻称量室较好，便于工作。 称量室进行化学药品的称量。要求干燥、密闭，无直射光照，避免腐蚀性药品和水气直接接触。有固定的水磨石平台，安放普通天平、精密天平和分析天平，要有电源插座，最好设计在阴面的房间，这样对怕光药品的保存和称量有利，称量室紧邻培养基配制室较好，以方便配制母液和培养基。房间较少时，可以与药品室合二为一。 培养基配制室主要进行母液的配制，培养基的配制、分装、包扎和灭菌前的暂时存放。在条件允许下，面积宜大不宜小，室内应有大型实验台。配有电炉、锅子、量具、培养基分装器具、吸管、培养容器、水浴锅和酸度计等。如规模较小，可与洗涤室、灭菌室合并在一起。

细胞工程 第三章 植物组织与细胞培养

第 3 章植物组织与细胞培养 3.1植物组织培养与细胞培养的区别 习惯上： 由于体外培养技术最初是从培养组织发展起来的，所以在习惯上，动物学和医学上又往往用组织培养这一术语泛指细胞、组织和器官在适当的培养条件下离体生长的技术。 单细胞培养与组织和器官培养在技术上具有较大的区别 严格意义上： 组织培养是指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长形成组织。 细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 植物组织培养（Plant tissue culture）：是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花未成熟的果实、种子）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎、原生质等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、或者长成完整的植株的技术。 离体培养（culture in vitro) 试管培养（test tube culture) 常用术语 外植体(explant)：植物组织培养中用来进行离体培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 愈伤组织(callus)：是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定的疏松的排列的薄壁细胞。继代培养或传代培养：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，营养物枯竭，水分散失，并已积累一些代谢产物，此时需要将其转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。褐变（褐化）：是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生的醌类物质，这类物质是棕褐色，对外植体产生毒害作用，严重时导致死亡。 玻璃化(vitrification)：表现为试管苗叶、嫩梢是水晶透明或半透明，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层、蜡质、没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。 不定芽（adventitious buds)：从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽。 不定根（adventitious roots)：从现存的根以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的根。 3.2 发展历史 植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展和完善起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 植物细胞发展工程发展历史就是植物组织培养技术的历史。 发展过程大致划分为三个阶段

植物组织培养期末复习资料

植物组织培养期末复习资料 一、名词解释 1.植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基， 对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养、微型培养、试管培养。 2.愈伤组织：是指外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的 细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。 3.细胞全能性：指植物的每一个具有完整细胞核的活细胞，具有该植株的全部 遗传信息，在一定条件下发育成完整植株的潜在能力。 4.胚状体：指在植物组织培养过程中，由细胞诱导分化形成的胚状结构，其功 能类似于合子胚，可进一步再生成一个完整植株。 5.器官离体培养：是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养 的技术。 6.胚胎培养：指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完 整植株的技术。 7.花药培养：是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养， 以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。 8.花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。 9.细胞培养：是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞（或小细胞团）进 行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。 10.原生质体培养：在人工控制条件下，将原生质体进行培养，使其形成完整植 株的技术 11.原生质体融合：也称体细胞杂交，指通过物理化学方法使原生质体融合，经 培养获得具有双亲全部或部分遗传物质的后代的方法 12.植板率：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个 能长出细胞团） 13.脱分化〔dedifferentiation〕:指在离体培养条件下，已分化的细胞、组织 和器官在人工诱导条件下，失去原来的结构和功能而恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。（掌握） 14.再分化（redifferentiation):指在离体培养条件下，经脱分化的组织或细胞 在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。 （掌握） 15.初代培养：指外植体来源于母本植株的最初培养 16.继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反复多次的 移植培养称为继代培养。 17.胚状体发生（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经 胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。 18.污染：植物组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现 象 19.玻璃化：试管植物的玻璃化是指试管苗外观形态呈半透明、水渍状的生长异 常现象，一旦形成玻璃苗，植株的增值系数即明显下降，既不能再用于后续的生根或继代增殖培养，移栽也难以成活。

植物组织培养MS培养基配方

植物组织培养MS培养基配方 （一）母液配制与保存 配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。 基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍） 1大量元素 配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。 表1大量元素母液（配1L20倍的母液） 序号成分配方浓度/（mg.L-1）称取量/mg 配1mL培养基吸取 量/mL 1 硝酸铵NH4NO3 1650 33000 50 2 硝酸钾KNO 3 1900 38000 3 磷酸二氢钾KH2PO 4 170 3400 4 七水合硫酸镁MgSO4.7H2O 370 7400 5 氯化钙无水CaCl2 440 6644 2微量元素母液 在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。 表2微量元素母液(配制1L100倍母液) 成分配方浓度/(mg.L-1) 称取量/mg 配制1L培养基吸取 量/mL 碘化钾KI 0．83 83 10 硫酸锰MnSO4.H2O 22．3 2230 硼酸H3BO3 6．2 620 硫酸锌ZnSO4.7H2O 8．6 860 钼酸钠Na2MoO4.2H2O 0．25 25 硫酸铜CuSO4.5H2O 0．025 2．5 氯化钴CoCl2.6H2O 0．025 2．5 3铁盐母液 由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。 配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存。

植物组织培养复习题

植物组织培养复习题 植物组织培养复习题（习题） 一、名词解释 愈伤组织：在培养基上由培养物产生的无序生长且没有一定结构的薄壁细胞团。 外植体：在组织培养中，由植物体上取下来进行离体培养的那部分组织或器官 脱分化：由高度分化的植物器官，组织或细胞经过离体培养，产生愈伤组织的过程。 半连续培养：利用培养罐进行大量细胞培养的一种方式。 无性系变异：由任何形式的细胞培养所产生的植株所表现出来的差异。 胚状体：在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。 看护培养：用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织培养细胞的一种方法。 无融合生殖：由配囊中卵细胞以外的其他细胞发育成的单倍体植株。 种质：亲代通过生殖细胞活体细胞直接传递给子代并决定固有生物性状的遗传物质。 悬浮培养：将游离的植物单细胞或小细胞团，按一定的细胞密度在受到不断拉动或摇动的液体培养基中进行培养的一种方式。 早熟萌发：在培养后迅速萌发为幼苗，不继续进行胚状生长，超过正常发育阶段。 选择压：在2个相对性状之间，一个性状被选择而生存下来的优势。 细胞全能性：任何有完整细胞核的植物细胞具有全部的遗传信息，在一定条件下，均具有分化，发育成完整植株的潜在能力。 条件培养基：在培养集中加入高密度的细胞进行培养，经过一段时间后，这些细胞向培养基中分泌一些促进细胞生长的活性物质，使培养基条件化，使原来在合成培养基上不能分裂的细胞发生分裂。 离体授粉：将未授粉的胚珠，子房或柱头从母体上分离下来，进行无菌培养，并通过一定的方式授给菌花粉，使其在试管内实现受精的技术。 同步化培养：培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。

植物组织培养的培养基

植物组织培养的培养基中，需要添加糖类作为碳源物质，因此糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一。高中生物教材中明确指出，植物组织培养的培养基中添加的糖类是蔗糖。那么为什么不添加葡萄糖呢？很多资料上解释为蔗糖较葡萄糖便宜，易被植物细胞吸收。其实并非如此。之所以以蔗糖作为碳源，主要有三个方面的原因： （1）同样作为碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。 （2）植物组织培养过程中，要时刻注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。 （3）诱导作用。在培养基成分中，增加生长素的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。当生长素水平恒定时，2％蔗糖使分化出的全部是木质部，4％蔗糖使分化出的几乎全部是韧皮部，3％蔗糖则可以分化出两者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。因此，在植物组培中要选用蔗糖而不选用葡萄糖。 通过细胞膜内外的液体的浓度差来调节 当细胞膜内的浓度小于细胞膜外的时候蔗糖救能进入细胞中了 植物细胞培养中最常用的培养基的碳源是蔗糖，已知葡萄糖和果糖也能使某些植物生长得很好。植物细胞可以分解蔗糖，蔗糖是由一分子果糖和一分子葡萄糖组成的，蔗糖是可以直接进入细胞的，蔗糖跨质膜从质外体进入细胞是由载体介导并需要消耗能量的质子-蔗糖共运输机制进行的，另外，植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。葡萄糖更不稳定，培养基需添加葡萄糖一般都在灭菌后再兑换。实在要添加葡萄糖那么灭菌温度一般控制在108~110左右，120度灭出来的就有一定程度的碳化了。所以用蔗糖更简单 动物细胞只能吸收葡萄糖，二糖蔗糖是无法吸收的。 以蔗糖为植物培养基碳源有两个原因: 1.抑制杂菌生长.细菌等不能直接以蔗糖为碳源,故可起抑制其生长的作用 2.蔗糖被植物细胞利用机理目还无定论.主要有以下两个学说(1)植物细胞先以次级主动运输的方式在细胞内外形成质子梯度,然后蔗糖就会利用这个梯度被吸收进细胞. (2).植物的细胞壁中含有能分解蔗糖的相关酶,蔗糖先在细胞膜外被分解为单糖,然后这些单糖再以主动运输的方式进入细胞,从而被细胞利用.

第五章 植物组织培养技术实验方案

第五章植物组织培养技术 一、植物组织培养中的基本概念 (1) 植物组织培养技术: 在无菌培养的条件下，将离体的植物器官（根，茎，叶，花，果实等）、组织（形成层，花药组织等）、细胞（体细胞，生殖细胞等）以及原生质体等培养在人工配制的培养基上，并给予适当的培养条件，使其长成完整植株的过程。 (2) 理论依据： 植物细胞的全能性，即指植物机体的每个细胞都含有该物种全套的基因组，具有发育成完整个体的潜力。 (3) 外植体： 从活体植株上切下的，用于组织培养的细胞、组织和器官。一般包括茎尖、根、茎、叶、花、种子等器官以及他们形成的体细胞胚等材料。 (4) 分化： 在个体发育过程中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程称为细胞分化。 (5) 脱分化： 已经高度分化的植物器官、组织或细胞，在切割损伤和培养物内外因素的共同作用下，逐渐丧失原来的分化结构和功能，最后形成无组织的细胞团或愈伤组织的过程。 (6) 愈伤组织： 在人工培养基上由外植体脱分化形成的一团无序生长的薄壁细胞。（具有细胞分裂能力）。 (7) 再分化： 已经脱分化的细胞在一定条件下，又可经过愈伤组织或胚状体，再分化出根和芽，形成完整植株，这一过程叫作再分化。 (8) 不定芽： 在高等植物正常的个体发育中，芽一般是只从茎尖或叶腋等的一定位置生出。所以这种象顶芽、腋芽、副芽等均在一定部位生出的芽，称为定芽。与此相反，凡从叶、根、或茎节间等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。 (9) 胚状体： 在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。 二、植物组织培养过程（菊花为例） 1、培养基的配制: 方法：培养基干粉配制法 称取培养基干粉42g加水加热煮沸溶解后定溶至1L，按照需要的浓度分别加入激素。 （其中生根用的植物激素NAA为0.2mg/1000ml） 用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调节pH至5.8。将配好的培养基迅速分装至150ml组培瓶中，拧上盖子，放入灭菌锅121℃，灭菌20min。 2、菊花接种与培养：

细胞工程知识点填空(附答案)

专题2 细胞工程 （一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）： 全能性表达的难易程度： 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体 （2）用途：。（3）地位：是培育、培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程： （2）诱导融合的方法：物理法包括等。化学法一般是用 作为诱导剂。（3）意义： （二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后放在适宜的中，让这些细胞。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用 处理分散成→制成→转入培养瓶中进行培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就，称为。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面时，细胞就会，这种现象称为。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①：培养液应进行处理。通常还要在培养液中添加一 定量的，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防 止。 ②：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入 等天然成分。 ③：适宜温度：哺乳动物多是；pH：。 ④：95%＋5%。O2是所必需的，CO2的主要作用 是。 （5）动物细胞培养技术的应用： 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为核移植（比较容易）和核移植（比较难）。

（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞； 卵(母)细胞。 （3）体细胞核移植的大致过程是：（下图） （4）体细胞核移植技术的应用： ①② ③④ ⑤ （5）体细胞核移植技术存在的问题： 克隆动物存在着问题、表现出缺陷等。 3.动物细胞融合 （1）动物细胞融合也称，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来细胞遗传信息的单核细胞，称为。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有等。 （3）动物细胞融合的意义：克服了，成为研究 的重要手段。 （4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较： 比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法 植物体细 胞杂交 细胞膜的流动性去除细胞壁后诱 导原生质体融合 离心、电刺激、 振动，聚乙二醇 等试剂诱导 克服了远缘杂交 的不亲和性，获得 杂种植株 动物细胞 融合 细胞膜的流动性使细胞分散后诱 导细胞融合 除应用植物细胞 杂交手段外，再加 灭活的病毒诱导 制备单克隆抗体 的技术之一 4.单克隆抗体 （1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种。从血清中分离出的抗体 。 （2）单克隆抗体的制备过程： 注入小鼠 细胞融合 分离 抗原注入小鼠体内 B淋巴细胞骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞培养 选择培养细胞 培养基 体内培养体外培养 从腹水提取从培养液提取 单克隆抗体 核移植 胚胎移植

植物组织培养知识点总结

植物组织培养知识点总结第一、二章 1 植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 2 实验室各分室名称、主要设备、主要功能 3 无菌操作技术流程 4 表面消毒剂种类及作用效果 5 培养基成分及各成分的作用 6 植物组织培养三大难题 7 那些成分要抽滤灭菌 第三、四章 8 植物细胞全能性原理 9 名词解释：愈伤组织、脱分化、体细胞胚、人工种子 10 体细胞胚的特点 11 愈伤组织形成发育的三个时期，两种类型，良好愈伤组织的特点 12 植物离体微繁，一般过程，各阶段注意事项 13 褐变，影响褐变的因素，克服褐变的措施；玻璃化，无糖培养技术 第五、六、七章 14 植物脱毒方法、原理 15 脱毒率包括两种方面含义 16人工诱导单倍体的三种途径 17花药培养得到的再生植株倍性如何，为什么 18 花药培养的应用，花药培养力，一般培养过程。 19 离体幼胚培养，胚发育有几种类型？各有何特点？ 20 离体授粉离体受精 21 简述胚乳培养的意义 第八、九章 22 原生质体概念，两种分离方法，纯化方法。 23 酶法分离植物原生质体的酶液组成及作用 24 简述植物原生质体培养基的特点 25 原生质体融合，融合的主要方法 26 体细胞杂交过程 27 融合产物的种类及特点 28 植物细胞无性系变异，特点 29 提高植物细胞无性系变异频率的方法 30 细胞突变体的类型及对应的筛选方法 植物组织培养知识点总结

第一、二章 1 植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 概念：是一种将植物的器官、组织或细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术。 分类：（1）按外植体来源和特性分：植株培养胚胎培养器官培养组织或愈伤组织培养细胞或原生质体培养；（2）按培养方法分：固体培养液体培养固体液体两相培养 应用：（1）克服远缘杂交中杂种不育性，种子无活力或配发育不全的植物获得后代，一年多代育种（2）培育三倍体（3）单倍体育种（4）提高突变频率，筛选变异类型（5）经过细胞融合得到体细胞杂种（6）种质资源保存 2 实验室各分室名称、主要设备、主要功能 化学实验室（准备室） 无菌操作室（接种室） 培养室 高压灭菌室 细胞学实验室 3 无菌操作技术流程 4 表面消毒剂种类及作用效果 漂白粉饱和溶液 10-30m 效果很好 氯化汞 0.1-0.2% 3-12m 效果最好 酒精 70-75% 10-30s 效果好 5 培养基成分及各成分的作用 水提供水分，营造环境 无机盐大量微量提供细胞生长所需元素 有机化合物碳源：提供能源、维持渗透压；维生素参与代谢；氨基酸，促进芽根胚状体生长和分化 植物生长调节物质调节细胞生长 天然复合物 其他成分活性炭吸附；抗生素防止内生菌污染 6 植物组织培养三大难题 污染褐变玻璃化 7 那些成分要抽滤灭菌 热不稳定成分如：IAA ABA ZT GA3 第三、四章 8 植物细胞全能性原理 植物的每一个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 9 名词解释：愈伤组织、脱分化、体细胞胚、人工种子 愈伤组织：原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可

实验一 植物组织培养基母液配制的若干关键环节

实验一、植物组织培养基母液配制的若干关键环节目的与要求： 熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法. 植物组织培养（plant tissue culture）是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程.植物组织培养具有取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制等特点.因而被广泛应用于各种植物的快速繁殖之中. 为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。 以MS培养基为例，其母液的配制包括大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸、植物生长调节物质和有机附加物等种类.(见表1) 表1 MS培养基母液的配制 成分规定用量 /mg.L-1 扩大倍 数 称取量/ mg 母液定溶 体积/ml 配1LMS培 养基吸取量 /ml 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O 微量元数 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 20 20 20 20 20 1000 1000 38000 33000 7400 3400 8800 22300 8600 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 50 50 50 50 50 1 1

植物组织培养技术实验

《植物组织培养技术》课程 实验实训教学大纲 (2004级食用菌与蔬菜专业适用) 生物工程与农业经济系 濮阳职业技术学院 2005年9月

说明 本大纲是根据2004级三年制食用菌与蔬菜专业教学计划而制订的。一、课程性质和任务 植物组织培养技术实验实训课程是食用菌与蔬菜专业专业的主要专业基础课程之一。 植物组织培养是在无菌条件下，利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞和原生质体进行培养的技术，是现代生物技术的核心技术之一。在植物的优良品种快速繁殖，脱毒苗木生产、缩短育种进程、种质资源保存等方面具有其它技术无法比拟的优势。 植物组培实验实训课程的教学任务在于使学生掌握组织培养的基本操 作技能和技巧，为进一步开展组培实训及从事组织培养工作奠定基础。 为适应高职高专教育改革的要求、突出高职高专教育的特点，适应本地农村产业结构调整的需要，本大纲以2003年的教学大纲为蓝本，在教学内容上进行了调整。 2、本课程教学的基本内容： 本课程是一门理论性、技术性和实践性强的的课程，通过本课程的学习，要求学生掌握植物组织培养基础知识、基本理论和基本技术。重点是植物的快速繁殖技术和组培苗工厂化生产技术。并紧紧围绕培养高等应用型技术人才，以强化技术应用能力培养为主线，着眼于培养学生应职岗位综合能力和创新精神，提高学生实践动手能力、科学实验能力、技术推广与市场开拓能力和组培苗工厂化生产经营与组织管理能力。 3、内容安排与学时分配 本大纲将教学内容分为实验教学、实训教学两个模块。实验教学结合理论讲授，在第三学期开设，共22学时。实训教学在第三、四学期开设，每学期为期一周。具体教学内容和学时分配见下表：

高中生物技术与生物工程第二章细胞工程第2节植物组织培养学案

第二节植物组织培养 1．理解植物细胞全能性的含义。 2．简述植物组织培养的过程。(重点) 3．说出植物组织培养技术的应用。(难点) 1．植物细胞的全能性 (1)含义 植物体的每一个活细胞都具有形成完整植物体的遗传潜能。 (2)物质基础 植物体的全部体细胞都具有发育为完整个体所必需的全套遗传物质。 (3)现实表现 ①在植物体内，细胞分化成为不同的组织和器官。 ②原因：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 (4)体现全能性的必需条件 ①脱离原来组织器官的束缚，成为游离状态。 ②一定的营养条件和植物激素的诱导。 2．植物组织培养技术 (1)植物组织培养的概念 ①培养对象：外植体(即离体的植物器官、组织或细胞)。 ②条件：a.无菌，b.含有营养物质的培养基，c.适宜的光照、温度、湿度等环境条件。 ③结果：形成完整植株。 ④核心：诱导脱分化和再分化。 (2)原理 植物细胞的全能性。 (3)过程

探讨1：植物的种子能发育成完整的植株，是否体现了细胞的全能性？为什么？ 提示：没有，因为种子中的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，发育成完整植株的过程，相当于植物的长大。 探讨2：美国科学家将分离得到的成熟胡萝卜根的韧皮部细胞进行培养，由单个细胞发 育成了完整植株，培养过程如下图所示。 此实验说明了什么问题？ 提示：分化的植物细胞仍具有全能性。 探讨3：在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的 瓶内外植体正常生长，有的瓶内外植体死亡，你认为外植体死亡的原因可能有哪些？ 提示：接种时培养基灭菌不彻底；接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体；培养过程中 保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质和激素的比例。 [思维升华] 1．植物细胞全能性表达所需条件

植物组织培养复习提纲

(1) 什么是植物组织培养? 植物组织培养是在无菌条件下，将植物体的任何一部分，如植物器官、组织、细胞以及原生质体等，培养在人工配制的培养基上，并给予合适的培养条件（包括营养、激素、温度、光照、湿度），使之发育成完整植株的过程。 （广义）又叫离体培养：指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 （狭义）组织培养：指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 (2) 什么是"外植体"? 从植物体上分离下来的用于离体培养的材料称为外植体。 (3) 按照外植体的不同，植物组织培养可以分成几类? 可以分成5类 1、植株培养 2、器官培养（胚，花药，子房，根、茎和叶） 3、组织培养（各种组织、愈伤组织） 4、原生质体培养 5、细胞培养（愈伤组织分离或花粉单细胞或很小的细胞团) (4) 植物组织培养有哪些特点? ①培养条件可以人为控制 ②生长周期短，繁殖率高 ③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 (5) 你认为植物组织培养技术在当前的农业生产上有什么价值?为什么? （一）快速繁殖种苗 用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。 （二）无病毒苗的培养 植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。 （三）在育种上的应用 植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工作在新的条件下更有效的进行 （四）人工种子 人工种子，是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗颗粒体。 （五）工厂化育苗 是指以植物组织培养为基础，将外植体接种在人工配制的培养基上，通过控制环