马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选及鉴定
第１章文献综述
近２０年来随着免疫抑制剂的广泛应用、器官移植、ＡＩＤＳ等所导致的免疫缺陷宿主不断增多，马尔尼菲青霉病的报道日渐增多，发病区域不断扩大“司。由于该病死亡率高，危害极大，已引起国内外真菌专家的重视，尤其是流行病学、早期诊断方法及致病机制研究，是目前专家共同探讨的热点问题。本章现就这些方面的研究现状做一综述。
１．１马尔尼菲青霉病的临床特征及感染现状
马尔尼菲青霉常引起ＡＩＤＳ患者及免疫力低下人群的严重感染。虽然患者临床病史和预后不同，但他们仍然有一些共同的临床表现。ＲａｎｊａｎａＫＨ０１等对马尔尼菲青霉病的临床表现进行统计，表明发热占４７％，体重减轻占１００％，四肢无力占８６％，贫血占８６％，皮肤损伤占８ｌ％。其它的一些少见的全身表现包括骨关节损害、脑脓肿、肾周脓肿等。马尔尼菲青霉病的皮肤损害呈多样性”１，表现为丘疹、坏死性丘疹或结节。一些患者的丘疹中样坏死呈脐状或成为传染性软疣样丘疹，还可以形成表皮脓疱或多发性皮下脓肿。然而这些临床表现并不是马尔尼菲青霉病所特有的，其它的艾滋病一些机会性感染也可以出现类似表现，单凭临床表现难以确诊，需要从其它诊断手段进行鉴别，争取早期诊断，早期治疗。
图１－１马尔尼菲青霉病的皮肤表现（引自：李希清等，中华皮肤科杂志．２００６，３９Ｉ４３６－４３８．）
菲青霉“”，这是广东省首例马尔尼菲青霉病。此后对该病的相关的报道逐年增多［ｆｆ－２１］２００４年席氏㈨等报道了发生于广东省的１５例马尔尼菲青霉病患者，１５例患者中有６例为ＡＩＤＳ（４０％），７例为其他免疫缺陷患者（４７％），２例为原发病例（１３％）。２００４年，宋氏。”在广州地区调查了９１例艾滋病人，２２例合并感染马尔尼菲青霉，其带菌率为２４．２％。目前我真菌中心调查了１４０余例爱滋病患者中真菌的感染情况，已发现合并马尔尼菲青霉感染的病例２０例（数据尚未发表），此现象提示广东已成为继中国广西之后的马尔尼菲青霉病重要流行区，且与艾滋病有重要相关性。
图１－－３马尔尼菲青霉病在世界及中国的主要流行区域
１．２马尔尼菲青霉的流行病学调查
目前所发现的马尔尼菲青霉的自然宿主是竹鼠以及竹鼠生活洞穴周围的土壤。研究表明，竹鼠的地域分布同马尔尼菲青霉菌感染发病的分布相关。竹鼠主要分布东南亚地区如泰国、老挝、缅甸、尼泊尔、越南、孟加拉国、印度、马来西亚、和中国的南部，这些地区均有马尔尼菲青霉感染的报告，尤其在ＨＩＶ感染率高的地区，马尔尼菲青霉的感染率也较高。有调查表明Ⅲ删我国广西境内的银星竹鼠（Ｒｈｉｚｏｍｙｓ．ｐｒｕｉｎｏｓｕｓ）普遍带有马尔尼菲青霉，据报道其带菌率可达９４％左右。内脏组织中以肺组织和脾组织阳性率最高均为５６．３％，非鼠类自然带
菌率为零，植物、泥土未分离出马尔尼菲青霉，动物感染试验中鼠类高度易感。我真菌研究中心也从广东边界地区的竹鼠内脏中分离到了马尔尼菲青霉，带菌率高达６０％以上（数据未发表）。泰国，越南，印度∞１渊㈨等地从小竹鼠（Ｃ．ｂａｄｉｕｓ）、银星竹鼠（Ｒ．ｐｒｕｉｎｏｓｕｓ）、中华竹鼠（Ｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）和大竹鼠（Ｒ．ｓｕｍａｔｒｅｎｓｉｓ）４种竹鼠体内分离出马尔尼菲青霉，其它鼠类的自然感染率为零。马尔尼菲青霉病患者居住区取得的土壤标本培养均为阴性，竹鼠洞穴周围取得的土壤标本中，只有一份从大竹鼠洞穴周围取得的标本培养阳性。但大多数马尔尼菲青霉病患者与竹鼠并无接触史，竹鼠将本菌直接传播给人的可能性极小。有研究者㈨。”推测土壤环境中可能会存在有马尔尼菲青霉，但至今未能空气、土壤、水源、其它鼠类中分离到马尔尼菲青霉。该菌如何从自然界传播给人类还是一个迷。
图１—４竹鼠及其洞穴
随着分子生物学技术的广泛应用，马尔尼菲青霉的分子流行病学也取得了极大的进展。１９９６年泰国ＶａｎｉｔｔａｎａｋｏｍＮ等。”运用限制性片段长度多态性分析技术（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＲＦＬＰ）将４６株马尔尼菲青霉的基因组ＤＮＡ分为两种ＤＮＡ型（ｔｙｐｅＩ和ｔｙｐｅＩＩ），其中大多数的病人和竹鼠分离株均为Ｉ型（７２．７％）。此后有多位学者利用脉冲场凝胶电泳法（ＰＦＧＥ），单一核苷引物（ＧＡｃＡ）和噬菌体Ｍ１３核心序列，随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）等多种方法对马尔尼菲青霉菌株进行了基因分型‘删，这对马尔尼菲青霉流行病学的研究上有一定意义，但分型与地域和病情的关系尚不清楚。２００４年Ｌａｓｋｅｒ队””等利用微卫星多态性（ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｅＭｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅＭａｒｋｅｒｓ，Ｐ删）分析法对马尔尼菲ＤＮＡ分型，３５株分离株共检测出２２个不同的等位基因，其基因型在传代培养中稳定，分离自中国的菌株和分离自泰国的菌株其等位基因组合频率有明显
的差异，提示马尔尼菲分型可能有一定的地域性。ＦｉｓｈｅｒＭＣ嘲等设计了多位点微卫星分型系统（ＭｕｌｔｉｌｏｃｕｓＭｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅＴｙｐｉｎｇ，ＭＬＭＴ），并建立了马尔尼菲青霉多位点微卫星分型数据库，为马尔尼菲青霉的分子流行病学研究提供了有利的工具。
Ｉ．３马尔尼菲青霉病的诊断
１．３．１传统诊断方法
诊断马尔尼菲青霉的临床感染可以通过直接镜检和真菌培养检查。临床标本可以选取骨髓抽吸液、外周血标本、淋巴结活检组织、皮屑、皮损分泌物、支气管灌洗液、脑脊液等。在爆发感染患者的外周血涂片中可以观察到病原体汹１。也可以在ＨＥ染色、ＰＡＳ染色、银染的组织病理切片中找到马尔尼菲青霉，病原体位于组织细胞或巨噬细胞内，为裂殖的分节孢子或球形、椭圆形的单个酵母细胞。在细胞外的病原体形态为具有ｌ到２个分隔的伸长的或腊肠形的细胞。真菌培养临床上则常根据常温培养产生可溶性玫瑰红色色素：分生孢子梗呈典型帚状枝；温度变化可诱导双相型转换来鉴定马尔尼菲青霉Ⅲ１。
图１—５马尔尼菲青霉的培养，镜下形态，直接镜检及组织病理图片
１．３．２分子生物学诊断
近年来随着分子生物学的发展，分子生物学技术在真菌学研究中得到了广泛而深入的应用，其中一个研究热点是核糖体ＤＮＡ序列。１９９５年Ｌｏｂｕｇｌｉｏｍ１等利