bcl-2、bax、caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系
ｂｃｌ一２、ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ一３在细胞凋亡中的作用及其关系
董雅洁高维娟１（承德医学院病理生理学教研室，河北承德０６７０００）
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［关键词］ｂｃｌ－２；ｂａｘ；ｃａｓｐａｓｅ．３；细胞凋亡
［中图分类号］Ｒ３４［文献标识码］Ａ［文章编号］１００５－９２０２（２０１２）２１－４８２８－０３；ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－９２０２．２０１２．２１．１２３
细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，受多种基因精确调控的主动的、程序化的死亡过程，是机体重要的自稳调节机制…。近年来通过大量实验研究表明，线粒体通路在细胞存亡机制中起着至关重要的作用，而在众多的凋亡调控基因中，ｂｅｌ－２蛋白家族和胱天蛋白酶（ｃａｓｐａｓｅ）家族目前最受关注，其中ｂｃｌ－２基因和ｂａｘ基因是目前已知的在凋亡调控过程中功能相互对立的一对最重要的调控基因，ｃａｓｐａｓｅ一３是凋亡过程中最关键的凋亡执行蛋白酶，三者在细胞凋亡过程中的关系已成为凋亡研究中的热点问题，本文将就此做一综述。
１ｂｃｌ－２蛋白与细胞凋亡
１．１ｂｅｌ－２蛋白家族的分类、结构与功能ｂｃｌ－２是Ｂ细胞淋巴瘤／白血病．２（Ｂ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ２，ｂｃｌ一２）的缩写，与秀丽隐杆线虫的生存基因Ｃｅｄ－９有高度同源性，是细胞凋亡信号转导途径中关键的凋亡调节因子。目前已发现有２０余种ｂｃｌ一２蛋白家族成员，这一多基因家族均由决定蛋白亚细胞定位的羧基端疏水性跨膜结构域（ＴＭ）和数量不等的ｂｅｌ－２同源结构域所构成。根据其功能和结构的不同可将ｂｃｌ－２基因家族分为三类：第一类是ｂｅｌ－２亚家族，包括：ｂｃｌ－２、ｂｃｌ—ｘｌ、ｂｃｌ—ｗ、Ｍｃｌ－ｌ、ｂｎ—ｌ／Ａ１和ｂｃｌ—Ｇ等，它们一般均同时含有ＢＨｌ～ＢＨ４四个同源结构域，其中ＢＨ４是抗凋亡蛋白所特有的结构域，决定着抑制细胞凋亡功能的存在口１；第二类是Ｂａｘ亚家族，包括：ｂａｘ、ｂａｋ等，其结构中一般都含有ＢＨｌ、ＢＨ２和ＢＨ３三个结构域，可促进细胞的凋亡；第三类是促细胞凋亡蛋白中的特殊成员ＢＨ３亚家族，包括ｂａｄ、ｂｉｄ、ｂｉｍ、ｂｉｋ、Ｐｕｍａ和Ｎｏｘａ等，此亚家族最显著的特点是仅含有一个ＢＨ３结构域，ＢＨ３结构域被认为是细胞凋亡所必需的致死性结构域，起促凋亡活性的发挥至关重要¨］。１．１．１ｂｅｌ－２的结构及功能抗凋亡基因代表成员ｂｃｌ一２是第一个被确认的能对抗细胞凋亡的基因，与Ｃｅｄ－９基因同源性为２３％，由２３９个氨基酸残基所构成，定位于１８号染色体２１区，含３个外显子和２个内含子，可编码２６ｋＤ的ｂｅｌ－２０￡和２２ｋＤ的ｂｃｌ－２Ｂ两种蛋白，其中ｂｅｌ－２０ｃ是抑制凋亡作用发挥的主要蛋白，为线粒体膜的整合蛋白ＨＪ。三维结构研究显示，ｂｅｌ－２是由
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．８１０７２９２３）
１河北化工医药职业技术学院
通讯作者：高维娟（１９６６一），女，医学博士，教授，硕士生导师，主要从事脑血管病发病机制研究。
第一作者：董雅洁（１９８０一），女，医学硕士，讲师，主要从事脑血管病发病机制研究。位于中心的两个长疏水性０／．一螺旋（０【５和嘶）包绕着外周五个亲水性两性Ｏｒ．一螺旋构成的七螺旋拓扑结构。在其肽链的ｃ末端具有由１９个疏水性氨基酸片段组成的跨膜结构区域，可通过该疏水区锚定于线粒体外膜、外核膜及部分内质网膜表面，是阻止凋亡早期征象发生的重要区域¨。。
１．１．２ｂａｘ的结构及功能ｂａｘ作为促凋亡代表成员位于１９ｑ１３．３一ｑ１３．４区，由６个外显子和５个内含子组成，能够编码０【、Ｄ、扎８、￡和拍种ｂａｘ蛋白亚型。多项实验证明，ｂａｘ基因编码的具有生物学活性的ｂａＸ仪由１９２个氨基酸组成，分子量为２１ｋＤ，是ｂａｘ基因在细胞中发挥促凋亡作用的主要表达形式。蛋白质序列分析显示，ｂａｘｏ［蛋白其２１％的氨基酸与ｂｃｌ－２具有同源性，且集中在ｃ端的保守区。
１．２ｂｃｌ－２蛋白家族在细胞凋亡中的调控机制
１．２．１ｂｃｌ一２在细胞凋亡中的调控机制定位于线粒体外膜上的ｂｃｌ?２至少在三个水平上发挥凋亡抑制作用：（１）通过抑制谷胱甘肽的外泄、降低／对抗线粒体巯基的氧化还原状态以控制其膜电位从而抑制细胞凋亡的发生；（２）通过介导线粒体外膜通透转运孔（胛）孔道复合体的开放，抑制细胞色素Ｃ（ｃｙｔ．Ｃ）和凋亡诱导因子ＡＩＦ等促凋亡蛋白的释放阻止凋亡的进程；（３）通过与胱冬肽酶的间接作用，将凋亡蛋白酶激活因子Ａｐａｆ－１定位至线粒体膜，通过对其结构的调控阻断凋亡蛋白酶的激活，组织ｃｒｙ—ｅ作用的发挥，使细胞免于死亡【６Ｊ。
定位于内质网膜上的ｂｃｌ－２抗细胞凋亡作用的发挥主要与胞内的ｃａ２＋浓度高低有关¨１。在凋亡的早期，内质网中的Ｃａ２＋持续释放，导致胞质中的Ｃａ２＋浓度持续增高可充当凋亡的启动信号引发细胞凋亡哺’。Ｌｉｎｇ等一’发现，高表达的ｂｃｌ一２可明显抑制Ｋ＋引起的ｃａ２＋浓度升高，且这种抑制作用在加入ｂｃｌ一２抑制剂后消失。应用转基因方法发现，ｂｃｌ－２高表达可抑制ｃａ２＋从内质网向胞质中的跨膜流动，使ｃａ２＋依赖性核酸内切酶活性降低，胞质中ｃａ“浓度处于稳定水平，从而抑制细胞凋亡。
１．２．２ｂａｘ在细胞凋亡中的调控机制ｂａｘ蛋白多以非活性单体形式分布于胞质中，只有在接收到凋亡信号刺激被激活后，发生分子构想改变，移位并插入线粒体外膜后形成ｂａｘ大孔道，破坏线粒体膜的完整性，并于ｂｃｌ一２等抑制凋亡的蛋白对抗，阻止其抗凋亡作用的发挥¨…。
１．２．３ｂｃｌ－２、ｂａｘ蛋白间的相互作用关系高分辨三维结构研究显示，ｂｃｌ－２、ｂａｘ蛋白中的ＢＨｌ和ＢＨ２两个同源结构域可形成一疏水凹槽，分别与其Ｎ端的仪．螺旋（ｂｃｌ一２为ＢＩ－１３、ＢＨ４螺
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旋，ｂａｘ仅有ＢＨ３螺旋片段）通过静电和疏水作用结合形成同源二聚体；而易位至线粒体外膜上的促凋亡蛋白ｂａｘ表面暴露的ＢＨ３螺旋可与抗凋亡的ｂｃｌ－２蛋白表面的疏水凹槽结合，形成异源二聚体ｕ“。特定的蛋白二聚体对细胞凋亡进程产生不同的影响，这是ｂｃｌ－２蛋白家族在细胞死亡信号转导调控过程中所特有的重要特征，是凋亡“主开关”作用发挥的重要结构域。研究发现，通常情况下ｂｃｌ－２和ｂａｘ两种蛋白的表达量相对稳定，而当ｂａｘ在细胞内超表达时，ｂａｘ／ｂａｘ同源二聚体的数量明显增多，细胞对死亡信号的反应性增强，启动凋亡；而当ｂｃｌ－２高表达时，则ｂａｘ／ｂａｘ二聚体大量解离，生成更为稳定的ｂｃｌ－２／ｂａｘ异源二聚体，对抗其诱导凋亡的作用，使细胞存活期延长¨“。因此，多项研究¨３’“ｏ认为细胞内这两种对立蛋白间的比率关系是决定细胞存亡的关键。
２ｃａｓｐａｓｅ蛋白与细胞凋亡
２．１ｃａｓｐａｓｅ蛋白家族的分类、结构与功能ｃａｓｐａｓｅ是一类存在于胞质中的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，与线虫的自杀基因ＣＥＤ一３同源，在细胞凋亡的过程中起着极其关键性作用¨５１。迄今在哺乳动物中已发现该蛋白家族有１４个性质不同的成员，按发现的顺序依次命名为ｃａｓｐａｓｅ一１至ｃａｓｐａｓｅ－１４，其中至少有８个与细胞凋亡有关¨…。
根据在细胞凋亡过程中的结构和功能可将ｃａｓｐａｓｅ蛋白酶分为三大类：第一类是炎症有关亚类，包括ｃａｓｐａｓｅ—ｌ、４、５、１３、１４及小鼠ｃａｓｐａｓｅ一１１、１２，主要参与促炎因子的成熟，在细胞凋亡进程中起辅助作用；第二类是凋亡启动亚类：包括ｃａｓｐａｓｅ－２、８、９、１０，这一亚类蛋白酶位于级联反应上游，在结构上一般都具有较长的原结构域，能参与启动下游的ｃａｓｐａｓｅ蛋白酶Ⅲ’；第三类是凋亡效应亚类：包括ｃａｓｐａｓｅ－３、６、７，位于级联反应下游，一般分子相对较小，缺少蛋白质结合结构域，执行剪切细胞结构蛋白的作用，直接使细胞发生凋亡¨…。
ｃａｓｐａｓｅ家族成员具有以下共同特点：①每个成员在催化位点上均含有一个特异性的五肽序列ＱＡＣＸＧ；②在胞浆内均以相对分子量为３０—５０ｋＤ的无活性的酶原形式存在，一个Ｎ端前域（ｐｒｏｄｏｍａｉｎ）及一个由大小两个亚基构成的ｃ端酶作用域；③酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；④对在底物Ｎ一末端裂解位点上的天门冬氨酸具有高度的特异性；⑤经蛋白水解激活后大小亚基解离重组形成异四聚体活性形式。⑥ｃａｓｐａｓｅ可自我活化并能相互激活，凋亡过程一旦触发，即以联级放大的方式进行；⑦正常情况下细胞内ｃａｓｐａｓｅ总是与其抑制剂共存，以免ｃａｓｐａｓｅ酶原被意外激活而对正常细胞造成损伤。２．２ｃａｓｐａｓｅ．３在细胞凋亡中的作用机制凋亡发生是一个由ｃａｓｐａｓｅ家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，即ｃａｓｐａｓｅｓ在凋亡诱导信号的作用下，启动型ｃａｓｐａｓｅｓ先通过结合特异辅因子而激活，发挥水解蛋白的作用，从而激活下游效应型ｃａｓｐａｓｅｓ，一旦效应ｃａｓｐａｓｅ被激活，便大范围的水解细胞内的靶物质，从而降解细胞内蛋白，最终使细胞不可逆的走向死亡¨…。ｃａｓｐａｓｅ一３是ＩＣＥ（白细胞介素１一Ｂ转化酶）家族成员之一，又称为半胱氨酸蛋白酶３２（ＣＰＰ３２），与Ｃｅｄ一３同源性最高，是主要的效应ｃａｓｐａｓｅ，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，在细胞
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凋亡过程中占据核心地位，被称为“死亡执行蛋白酶”‘川。其主要受粒酶Ｂ、ｃａｓｐａｓｅ．１、ｃａｓｐａｓｅ一２、ｃａｓｐａｓｅ一１０、ＣＰＰ３２激活蛋白酶（ＣＡＰ）以及自身等所活化，活化后的ｃａｓｐａｓｅ－３酶解切割ＤＮＡ．ＰＫ（ＤＮＡ依赖的蛋白激酶）和ＰＡＲＰ（聚腺苷二磷酸核糖多聚酶）等，从而影响ＤＮＡ复制、转录和损伤修复‘２“。
３ｂｃｌ－２、ｂａｘ和ｃａｓｐａｓｅ－３在细胞凋亡中的相互关系
细胞凋亡的发生和发展可以概括为凋亡诱导、调控执行和效应三个阶段，现已证明至少有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径三条通路参与凋亡的发生【２”。其中线粒体依赖途径是主要的传导途径，ＪＮＫ通路是主要信号转导通路，ｃｙｔ—Ｃ是线粒体电子电子传递链上的一个重要组成部分，其从线粒体释放是凋亡启动的关键步骤旧Ｊ。ｃａｓｐａｓｅ．３作为ｃａｓｐａｓｅ级联反应下游最关键的凋亡执行者，其激活在很大程度上依赖于ｃｙｔ－Ｃ的释放，而ｂｃｌ－２家族中的ｂｃｌ－２、ｂａｘ基因是目前已知的细胞凋亡中最重要的调控基因，可通过线粒体途径介导ｃｙｔ—Ｃ等物质释放。随着近年来关于ｂｃｌ－２、ｂａｘ和ｃａｓｐａｓｅ０在细胞凋亡信号传导过程中关系研究的进一步深入，发现ｂｃｌ－２、ｂａｘ不但可作为ｃａｓｐａｓｅ一３的上游调控机制，参与对ｃａｓｐａｓｅ－３活性的调节ⅢＪ，还可作为ｃａｓｐａｓｅ－３的直接底物作用于ｃａｓｐａｓｅ－３的下游，二者在细胞凋亡传导过程中既相互联系又相互制约。
３．１ｂｃｌ．２、ｂａｘ可作为ｃａｓｐａｓｅ一３的上游调控机制ｂｃｌ－２、ｂａｘ蛋白位于线粒体上游，是线粒体膜的通透性改变的重要调控因素心“，其过度表达能控制ｃｙｔ—Ｃ的释放和下游ｃａｓｐａｓｅ?３蛋白酶的活化，介导细胞的存活或死亡Ⅲ１。ｂａｘ在死亡信号刺激下可转位至线粒体膜上，形成同源二聚体或多聚体，并在线粒体膜上形成通透性ＰＩ＇孔道，破坏膜内离子及蛋白浓度差，释放出ｃｙｔ—Ｃ等促凋亡因子旧“。在ｄＡＴＰ存在下ｃｙｔ—Ｃ通过半胱氨酸蛋白酶作用域与Ａｐａｆ－１结合形成凋亡体，并招募ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－９在其上寡聚∞”，进而激活ｃａｓｐａｓｅ－３，启动ｃａｓｐａｓｅ级联反应怛…。超表达的ｂｃｌ－２蛋白一方面可与ｂａｘ形成异源二聚体，抑制ｂａｘ的转位及二聚体化，关闭ＰＩ’孔道，通过阻断ｃｙｔ—Ｃ的释放，抑制下游ｃａｓｐａｓｅ－３的激活，而有效地抑制细胞凋亡的发生¨…。另一方面，ｂｃｌ－２还能与Ａｐａｆ－１结合并抑制其功能，阻止ｐｒｏ—ｃａｓｐａｓｅ－９活化实现抗凋亡的效应…ｏ。此外，有研究发现ｂｃｌ－２的过度表达可引起细胞核谷胱甘肽积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，阻止胞内ｃａ２＋流动，抑制线粒体膜释放ｃｙｔ－ｅ，从而抑制ｃａｓｐａｓｅ－３的活化，阻断凋亡进程。
３．２ｃａｓｐａｓｅ一３可作为ｂｃｌ－２的上游调控机制ｂｃｌ－２可作为ｃａｓｐａｓｅ－３的直接作用底物，ｂｃｌ－２蛋白的Ｎ端可变环区可被ｃａｓｐａｓｅ一３在Ａｓｐ３４处剪切，裂解为具有类ｂａｘ促凋亡活性功能的片段，加速凋亡进程。这一步骤被证明是凋亡信号转导最关键限速步骤之一【３“。Ｋｉｒｓｃｈ等¨ｕ用细胞凋亡提取物诱发细胞凋亡时，可见ｂｃｌ一２的剪切片段。在对提取物进行ｃａｓｐａｓｅ一３免疫清除后，ｂｃｌ－２则不被剪切。当用ｓｔａｕ—ｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（一种癌基因抑活药）诱导缺乏ｃａｓｐａｓｅ一３表达的ＭＣＦ－７细胞凋亡时，ｂｃｌ一２也不被剪切，由此说明ｃａｓｐａｓｅ－３是ｂｃｌ一２的生理性酶解蛋白酶，可构成阳性凋亡反馈通路。
万方数据
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