发酵蔬菜中乳酸菌的功能性与安全性研究进展
发酵蔬菜中乳酸菌的功能性与安全性研究进展
胡晓清1，潘露1，王汝毅2
（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）(2.重庆涪陵出入境检验检疫局，重庆 408000）摘要：乳酸菌是发酵蔬菜制作过程中发挥重要作用的一类优势微生物，可利用蔬菜中的可溶性成分进行乳酸发酵，还能抑制有害微生物并发挥多重功能。本文首先对其最新研究进展做了归纳。近年来食品发酵微生物出现可转移耐药性问题，成为国际关注热点。作者结合研究实践，综述了可转移耐药性及其在发酵蔬菜乳酸菌中的研究现状，以及发酵蔬菜中乳酸菌的控制策略。
关键词：发酵蔬菜；乳酸菌；细菌素；可转移耐药性；直投式发酵剂
文章篇号：1673-9078(2012)11-1606-1611
Advances in the Functionality and Safety of
Lactic Acid Bacteria from Fermented Vegetable
HU Xiao-qing1, PAN Lu1, W ANG Ru-yi2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
(2.Fuling Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chongqing 408000, China)
Abstract:Lactic acid bacteria were regarded as the predominant species involved in the processing of fermented vegetable, for participating in lactic acid fermentation through utilizing soluble contents in vegetable, and inhibiting hazard microbes and playing multiple functions. This article reviewed the newest advances in this area. Recently, a new problem has appeared that transferable antibiotic resistance was revealed in the microorganism in food fermentation, and thus received much attention in international society. Based on t he practice experience, transferable antibiotic resistance and the investigation in lactic acid bacteria involving in vegetable fermentation were reviewed, and finally discussed the related control strategy.
Key words: fermented vegetable; lactic acid bacteria; bacteriocin; transferable antibiotic resistance; directed vat set
我国传统发酵食品种类居世界首位，如各种酒、发酵肉制品、发酵奶制品及发酵蔬菜等。发酵蔬菜主要包括泡菜、腌菜、酱菜、发酵蔬菜汁饮料等[1]，是以新鲜蔬菜及其汁液为材料，在添加水及盐、糖等调味料情况下，利用蔬菜自然附着或外源添加的微生物发酵而成。发酵蔬菜美味爽口，富含各类维生素、矿物质等营养物质，而且还蕴含多种功能性产物。
参与蔬菜发酵过程的微生物种类繁多，其中乳酸菌是最为重要的一类。乳酸菌是利用葡萄糖发酵能产50%以上乳酸、过氧化氢酶阴性、不运动且不形成芽孢的一大类革兰氏阳性菌。蔬菜发酵中常见的乳酸菌分别属于乳球菌（Lactococcus）、乳杆菌（Lactobacillus）、肠球菌（Enterococcus）、链球菌（Streptococcus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、明串珠菌（Leuconostoc）等。乳酸菌可从蔬菜表面带入，收稿日期：2012-09-08
基金项目：江苏省自然科学基金（BK2012114）
作者简介：胡晓清（1978-），男，副教授
通讯作者：王汝毅（1980-），女，工程师也可由空气中自然落入，其在蔬菜发酵中具有多种作用。而随着近年来抗药性微生物的大量涌现，曾经被认为是安全的食品级乳酸菌也出现可转移耐药性问题，为发酵蔬菜的安全性带来新的挑战。因此，笔者综述了发酵蔬菜中乳酸菌功能性和安全性研究的最新进展，并对其控制策略进行了讨论。
1 发酵蔬菜中乳酸菌的新功能
乳酸菌对于发酵蔬菜的品质发挥着多重作用，如增进营养价值、改善食品风味、抑制杂菌生长等，在此仅对近年报道的抑菌成分细菌素和重要生理功能加以介绍。
1.1 细菌素抑菌作用
危害蔬菜发酵的微生物分为致腐菌和致病菌，其中致腐菌使产品产生不良气味，甚至变质，并浪费大量营养成分。致腐菌主要包括霉菌、酵母和腐败细菌。其中霉菌可使蔬菜组织软化，甚至出现霉斑，影响感官。产醭酵母能在发酵液表面形成白色菌膜，严重影响感观。致腐细菌则使蔬菜发黑并生成恶臭物质如尸
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胺、腐胺、硫化氢、吲哚等。致病菌则因蔬菜产地、生产环境不同而差异较大，如报道的有各种大肠杆菌致病血清型、粪链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌等。在采用自然接种的蔬菜发酵过程中，这些有害微生物一般初期都广泛存在，而中末期绝大多数会消亡。前期研究认为乳酸、醇类的积累导致了有害菌的抑制，近些年对包括发酵蔬菜在内的发酵食品研究揭示，相当数量的乳酸菌可产生对其他微生物有拮抗或杀灭作用的蛋白或多肽类物质-细菌素（bacteriocin）[2]，某些乳酸菌细菌素甚至对与其种属关系较远的微生物仍有拮抗作用，这对于食品安全控制具有重要意义[3]。按照遗传和生化特征，乳酸菌产生的细菌素可分为3类[4]：I类，为羊毛硫抗生素（Lantibiotics），分子量小于5 KDa，包括Nisin，Lacti cin 481，Carnocin U-149，Lactocin S，Sublancin 168等[5]。
II类，为小分子量、非羊毛硫抗生素的膜活性肽，包括：ⅡA类，为N末端具有“-T-G-N-G-V-X-C-”结构、拮抗李斯特菌的活性肽，包括Pediocin PA-1，Sakacin A，Sakacin P，Leucocin A和Mesentericin Y105[6]；ⅡB 类，包括Lactococcin G，Lacto-coccin M, Lactacin F等[7]；ⅡC类，包括Divergicin A和Acidocin B[8]。
III类，为分子量大于40 KDa、热不稳定性蛋白，包括Helveticin J，Helveticin V，A cidophilicin A，Lactacins A和Lactacins B[9]。
大部分发酵蔬菜均为非加热方式食用，细菌素虽会进入人体食道，但由于易被肠道内蛋白酶降解, 因此细菌素不会对肠道内正常的微生物菌群产生不利影响。将合成细菌素的乳酸菌用于蔬菜发酵已有成功应用。Harri s等在制作德国发酵卷心菜过程中，利用能产生Nisin的乳酸乳球菌（L. lactis）NCK401菌株和抗Nisin的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）NCK293菌株混合培养发酵。在12天试验期内Nisin 产量维持恒定，可有效抑制卷心菜上可能残存的有害菌。而L. mesenteroides的生长则几乎不受影响，可在蔬菜汁液中迅速繁殖，产生有机酸和二氧化碳[10]。近年来，Lemos等从数百个食品来源的乳酸菌株中，筛选发现肠球菌能够产生抗多种菌的细菌素[11]，Lasta 分离并鉴定了乳球菌产生的一种27肽细菌素T46，均是优秀的食品级抑菌物质[12]。
1.2 其他新的功能
近年来发酵蔬菜被发现具有新的一些功能，或将特定功能物质合成能力的乳酸菌引入发酵过程，强化发酵蔬菜某些保健功能，主要包括：
1.2.1 γ-氨基丁酸
γ-氨基丁酸具有重要的生理活性，是人体中枢神经系统中三大抑制性神经递质之一，可缓解焦虑、降血压、利尿、安眠镇定、调节心律失常等，因此具有重要保健作用。Hirose等利用乳酸乳球菌（L. lactis）发酵甘蔗汁制备富含γ-氨基丁酸功能饮料，其条件为发酵液中甘蔗汁和脱脂奶含量分别为30%和10%，30 ℃培养48~72 h，该方法克服了天然甘蔗中GABA 含量随品种和产季不同而变化的缺陷。此外，乳酸菌发酵可有效保护并提升甘蔗汁中具有自由基清除能力的多酚[13]。笔者所在实验室从发酵食品中分离一株发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum CCTCC M 2011370），为γ-氨基丁酸高产菌，也具有在发酵蔬菜中应用的潜力。
1.2.2 乳酸钙与B族维生素
蔬菜汁经发酵后，植物中的钙转换为乳酸钙，而乳酸钙易被人体吸收，从而提高了人体对植物性食品中钙的吸收效率，是老年人群补钙的新型饮品。而且蔬菜经发酵后，微生物可转化生成较多的B族维生素，尤其是维生素B12，其在植物中不存在。因此，这类发酵蔬菜汁可开发为特定人群的功能饮品。
1.2.3 其他重要活性
乳酸菌作为益生菌，其产生的胞外多糖具有抗肿瘤、免疫刺激和降低血液中胆固醇的作用[14]，卫生部批准的肿瘤辅助抑制物中就有乳杆菌[1]。对腌制6星期的韩国大白菜泡菜的调查表明，在人体胃癌细胞AGS实验中其癌症抑制率为57~77%，而在人体肠癌细胞HT-29的实验中抗癌率为62~73%。此外，发酵蔬菜来源的乳酸菌还有抗氧化[15]、抗衰老[16]和抗诱变等活性[17]。胞外多糖之外的其他成分很可能也对乳酸菌活性发挥了作用，这有待进一步揭示。
此外，乳酸菌还可抑制重要致病菌沙门氏菌的入侵。Chiu等从台湾大白菜、橄榄、黄瓜、甜菜等发酵产品中分离乳酸菌。其中的1株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和1株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）除能抑制常见致腐致病菌外，还可抑制小鼠中沙门氏菌的入侵，其原因在于可粘附于小鼠小肠上皮细胞，因此该乳酸菌对于采用自然发酵的蔬菜产品安全控制具有重要意义[18]。
2 可转移耐药性及在发酵蔬菜乳酸菌中的分布
2.1 可转移耐药性及其在发酵食品中危害
长期以来，发酵食品中的乳酸菌被认为是安全的，但是近年研究发现，某些乳酸菌菌株具有可转移耐药性，极可能引发食品安全问题。抗生素的滥用对环境微生物造成了选择压力，使得各种耐药性微生物不断涌现，导致相当部分抗药性致病菌无药可医，因
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为一种临床抗生素的研制远远落后于微生物的进化速度。在获得性耐药性菌株中，耐药基因的来源可分为自身基因突变和从外界获得两种方式，外界获得的耐药性基因具有在微生物之间水平转移的可能，其大多位于质粒或转座子这类活跃的可移动元件上，而通过接合作用等实现跨种属界限转移。目前，国际上关于乳酸菌抗药性的研究集中在医学领域。临床上耐药性转移能力强的菌株往往传播范围广，蔬菜种植过程中接触的水体、土壤、空气及肥料中不可避免存在耐药菌株。而且农药中滥用的抗生素也会造成选择压力，促进耐药性乳酸菌的富集。传统发酵蔬菜多采用自然接种，一旦这些耐药性乳酸菌随事物进入人体并定植肠道后，耐药性基因会向其他肠道微生物转移，给疾病的治疗埋下了隐患。
国外发酵食品多为发酵奶制品和肉制品，因此国际上耐药性乳酸菌的报道侧重于此[19]，如发酵香肠、牛奶及肉制品[20]，这些耐药性乳酸菌均携带可转移耐药质粒或活跃的转座子，如粪肠球菌（Enterococcus faecalis）具有活跃的转座子Tn916、Tn1545、Tn920和Tn925[21]，有的菌株甚至同时携带多种耐药因子[22]。在可可芋头及发酵粟米粥中，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei），长双岐杆菌（Bifidobacterium longum）和分叉双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）中分别检测出阿伯拉霉素、粘菌素、新霉素、壮观霉素、四环素、甲氧苄氨嘧啶、万古霉素等抗性[23]。
为评价可转移耐药基因的危害程度，可考察各种耐药性基因在特定环境条件下的转移频率，这将为食品安全性评价提供参考[24]。Jacobsen等从发酵食品中分离到分别携带erm（B）和tet（M）抗药性基因的L. plantarum，当以E. faecalis JH2-2为受体菌时，耐药质粒在无菌小鼠体内的转移频率为10-4~10-5[25]。Flórez等分离到携带接合转座子Tn916（带有四环素耐药基因tet（M））的两株L. lactis，滤膜杂交显示Tn916对肠球菌的转移频率为10-7[26]。Hummel针对串联有tet（M）和tet（L）的转座子，发现其在E. faecalis 间的水平转移频率为1.4×10-8[27]。
2.2 发酵蔬菜中乳酸菌可转移耐药性评价
笔者所在实验室对包括泡菜在内的市售发酵食品中乳酸菌耐药性进行评估[28]。结果显示，不同泡菜中乳酸菌均存在耐药性菌株，其对红霉素、氯霉素、环丙沙星和卡那霉素耐药比例较发酵香肠中更高。如酸辣白菜中耐受卡那霉素的乳酸菌占到31%，其中多株作为优势菌种的L. plantarum携带可转移抗药性质粒，可能白菜种植或泡菜制作环境中存在较大抗生素污染。不同泡菜中乳酸菌耐药性的分布差异明显，如泡白菜中乳酸菌耐受环丙沙星比例约为25%，而耐受四环素比例仅为2%。
随后对几种常见抗性进行了分析。对四环素抗性而言，菌株中都检测到了tetM，有的存在于质粒，有的存在于基因组，还有少数同时分布于质粒和基因组。对红霉素抗性而言，相关基因ermB和erm定位情况类似。值得关注的是，发酵蔬菜来源的少数乳酸菌携带多种抗药性基因，如ermB、ahpA3（编码卡那霉素修饰酶）和tetM同时存在于SZ109质粒；tetM和erm 也同时出现在SHC062质粒，这意味这些菌株的出现源于多重抗性压力。
3 控制策略
我国蔬菜播种面积已占全世界43%，成为全球最大“菜篮子”，蔬菜发酵是重要的蔬菜加工方式。乳酸菌作为重要生产菌株，近年来出现的可转移耐药性，以及生物胺合成能力将导致食品安全问题。为解决这些问题，国内外学者分别从以下几方面进行了探索。
3.1 菌株的安全性和功能性评价
菌株的安全性是关注的首要指标。韩国等国的发酵蔬菜种类远低于中国，但其泡菜“Kimchi”已获国际精品认证，这归因于其在乳酸菌菌株方面做了大量安全性和功能性评价。近年，Lee等从韩国泡菜“Kimchi”中分离获得20株乳杆菌，其中9株为清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei），1株为L. plantarum。这些菌株安全性能良好，能通过分解胆盐而降低胆固醇，在缺少醋酸盐情况下仍可生成L(+)型乳酸。与商业化的益生菌L. rhamnosus GG菌株相比，其对HT-29细胞粘附能力更强，因此具有更优良的益生菌特性[29]。Nam 等利用基因组学探针分析技术，对39株乳酸菌进行检测以分析Kimchi发酵过程中的微生物多样性和生物活力。通过周期性取样获得乳酸菌宏基因组和宏转录组，并标记、杂交分析。宏基因组分析显示其中23株乳酸菌含量超过总数1%。宏转录组显示除2株外，所有乳酸菌均对发酵有贡献。优势菌株的含量基本保持不变，其中最大值与最小值相差不到1.5%。但宏转录组学分析显示发酵过程中，乳酸菌的相对含量变化较大，由 2.4%变化到9.5%，显示低丰度的菌株在kimchi 发酵中具有较高活力[30]。
此外，印度发酵蔬菜中乳酸菌也进行了评价。Tamang等从44个发酵竹笋中分离出优势乳酸菌，对其产酸能力、抑菌能力、植酸降解能力、胆盐耐受性
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进行了分析。结果显示这些乳酸菌具有很强功能性，而且菌株不产生物胺[31]。Kumar等从印度发酵蔬菜和饮料中分离出乳酸菌，菌株在pH 3.0模拟胃液中生长良好，对包括万古霉素在内的抗生素敏感，苯酚耐受性强，细胞表面疏水性高，可刺激小鼠淋巴细胞增殖[32]。这些乳酸菌可作为发酵竹笋及其他发酵蔬菜及饮料的优良生产菌株。
中国发酵蔬菜中的乳酸菌资源极其丰富，其安全性显得尤为重要。目前国内已开展这方面工作，如已对四川泡菜乳酸菌进行微生物资源标准化整理工作，包括菌株分离、鉴定和性能分析[33]。和国外发酵蔬菜不同的是，中国蔬菜发酵中微生物种类繁多，如何从复杂微生物区系中获知关键生产菌株，可借助近年来发展的不依赖于培养的分子生态学技术[34]。针对复杂生物体系中微生物区系结构，PCR-DGGE/TGGE、SSCP、FISH等均是成熟有效的分析方法[35,36]。不仅可解析微生物的空间分布，而且能获知微生物的时间分布[5]。Xiong等对当地发酵卷心菜中的微生物演变规律进行了研究，发现初期优势菌群为肠膜明串珠菌肠膜亚种（L. mesenteroides subsp.mesenteroides），随后是E. faecalis、L. lactis和玉米乳杆菌（Lactobacillus zeae），发酵结束时为L. casei，这为进一步解析泡菜中微生物消长规律和优化发酵过程奠定了基础[37]。
为增强标准化蔬菜发酵的安全性和风味性能，寻找具有新型抑菌物质产生能力、及良好风味形成能力的微生物菌株具有重要潜力[29]。
3.2 直投式发酵剂的应用
多菌种纯种发酵是发酵蔬菜的发展方向之一。蔬菜发酵体系中加入经过筛选的种子培养液，如L. plantarum, 可在保证安全性前提下改善稳定性。这在果蔬汁（如蕃茄汁、苹果汁等）中应用相对较早。罗云波报道L. plantarum、L. fermentum、L. mesenteroides 以5:3:2比例添加到发酵蔬菜[38]；沈国华按等比例将L. plantarum和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）接种腌渍蔬菜[39]。
乳酸菌可通过直投式发酵剂（directed vat set，DVS）的形式加入发酵食品。DVS是高度浓缩并标准化生产的冷冻型或冷冻干燥型菌种发酵剂。采用乳酸球菌、乳杆菌和肠膜串连菌制备DVS，用于发酵洋葱、甜菜等蔬菜已有报道。国内陆利霞等人利用L. plantarum、复合弯曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）和乳酸链球菌（Streptococcus lactis）DVS进行泡菜制作[40]。DVS用于蔬菜发酵不仅适用于工业化生产，而且也可满足餐饮行业及家庭等安全、快速生产泡菜的需求。3.3 发酵条件的优化控制
蔬菜发酵过程中的微生物群落组成及变迁受到发酵条件的直接影响。因此，蔬菜发酵条件的控制也是关键环节，目前这方面报道较多，在此不作赘述。值得提及的是2011年，Jeong等对不同材质（聚乙烯或聚丙烯塑料容器、玻璃容器，陶器）容器制备韩国泡菜发现，陶器效果最佳更佳。利用陶器发酵可提高乳酸菌产酸量和增殖速率，促进功能性产物的合成，使得泡菜的抗氧化活力和抗恶性细胞增生活力更高，泡菜口感更好。其机制在于陶器的多孔结构导致气体渗透性好，有利于乳酸菌生长和泡菜后熟[41]，这对于开发新型的发酵蔬菜容器奠定了理论基础。
4 结语
乳酸菌是发酵蔬菜制作过程中的重要微生物，具有多种重要作用及功能，近年研究显示，相当数量的乳酸菌能合成细菌素，对特定致病致腐菌具有良好抑制效果。乳酸菌也被用来生产富含γ-氨基丁酸、B族维生素和乳酸钙的发酵蔬菜产品，而且乳酸菌发酵蔬菜的新功能不断被揭示。可转移耐药性的发现为乳酸菌的安全性敲响了警钟，研究显示，包括发酵蔬菜在内的某些发酵食品中存在着耐药性乳酸菌菌株，有向人体肠道菌群转移的风险。因此，亟待从菌株安全性和功能性评价、直投式发酵剂的应用和发酵条件控制优化等方面加强控制，在保障发酵蔬菜安全性的前提下，提升产品功能性。
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活性乳酸菌加工工艺
活性乳酸菌加工工艺 摘要:活性乳酸菌乳饮料是近年发展起来的兼营养、保健功能为一体的新型乳饮料,产品中含有大量的活性乳酸菌,具有助消化和调整胃肠功能等功效。简述活性乳酸菌加工工艺和操作要点。 关键词:活性乳酸菌;乳饮料; Active Lactobacillus Processing Abstract:In recent years, the active lactobacillus fungus milk beverage is a developing new king beverage with nutrition and health care as an organic whole function,the products contain a large number of active lactobacillus fungus,and they can adjust intestines and stomach function efficiency.Briefly active lactobacillus processing and key operation Key words:active lactobacillus bacteria;milk drinks 近年,乳酸菌饮料具有可口、健康、方便与时尚的特性成为市场的新宠。乳酸菌饮料在其发源地日本则是处于长盛不衰的状态。强化健康因子是乳酸菌饮料的一大发展方向。为了适应减肥健美的需要。活性乳酸菌饮料是将乳或乳制品以乳酸菌发酵后作为主要原料，配以辅料和水调配而成的饮料。在此基础上可以添加各种营养强化剂,制成各种类型的营养保健饮料。同时它又是有益菌的重要来源,对维持肠道菌群平衡,治疗胃肠功能紊乱有一定疗效。目前，乳酸菌饮料的研究重点主要集中在产品的稳定技术和新产品的开发研制上，研究结果表明，添加稳定剂是提高乳酸菌饮料稳定性的一条有效途径。添加不同种类的营养物质制造出的新型乳酸菌饮料正成为一种发展趋势。 1 活乳酸菌乳饮料的生产方法 活乳酸菌乳饮料的生产方法是以脱脂乳粉、葡萄糖以一定的配方配合，接入乳酸菌培养发酵，发酵完成后不再杀菌，经过均质再与糖浆混合，最后加水调配而成，它是含有大量活乳酸菌的发酵型饮料。因乳酸菌发酵产生的代谢产物具有独特的滋味及抑制有害菌的繁殖，故不需添加任何防腐剂、稳定剂等添加剂，口感天然、纯滑，有益健康。它有别于传统的调酸型乳饮料，调酸型的方法是将砂糖、稳定剂、果汁、香精、防腐剂、有机酸等加入到稀释的牛奶中调配而成的，它不含活的乳酸菌[1]。 2 乳酸菌饮料的加工工艺[2] 工作发酵剂混合杀菌←糖、水、稳定剂 ↓↓ 原料乳→混合→→杀菌→冷却→接种，发酵→凝乳破碎，混合→均质→冷却→稀释→灌装→产品↑ ↑香精、酸味剂 杀菌←水（乳） 3 操作要点 3.1 原料乳酸度要求不超过20°T, 要求不含抗生素, 碱等抑菌物。 3.2灭菌、冷却、高温短时杀菌（90~95℃ 30 min），迅速冷却至43-45℃。 3.3接种、发酵
乳酸菌饮料的生产工艺及关键控制点
乳酸菌饮料的生产工艺及关键控制点 1．生产工艺流程 A．发酵乳生产 鲜牛乳→验收→净化→标准化→杀菌→高压均质→冷却→接种发酵→纯酸奶 Ｂ．乳酵菌乳饮料生产 糖和稳定剂干粉混合→搅拌溶解→杀菌→加入山梨酸钾和甜味剂→加入酸奶→加入酸味剂→加入香精→高压均质→灌装→（杀菌）→成品 2．关键控制点 关键点①：发酵乳的制作：A．原料奶收购。刚收购鲜奶一般要求在5℃下低温保存，抑制微生物的繁殖，牛奶酸度控制在16-18，细菌总数≤200000个/ mL，芽孢总数≤10 0个/mL，耐热芽孢总数≤50个/ mL，嗜冷菌≤10 个/mL，体细胞数≤500000个/mL,密度(20℃/4℃)1.028～1.032 ，脂肪≥3.0g/100g；蛋白质≥3.0g/100g；乳糖≈4.5g～5.0g/ 100g，抗生素残留≤0.007IU/ml(0.004μg/ml)。B.原料奶热处理。对原料乳的热处理（9 0℃保持10分钟或95℃保持5分钟）主要有两个目的：杀死原料乳的致病菌和有害微生物；使原料乳中的蛋白质适度变性，增加蛋白质的持水能力，增加发酵乳的网状结构，同时还有利于发酵菌的利用。C．菌种选择．对乳酸菌饮料的发酵剂一般选择嗜热链球菌和保加利亚杆菌，通常它的比例为1：1或2：1，杆菌不能占优势，否则酸度太强．Ｄ．发酵控制．目前常用菌种最适当生长温度为42-43℃，因此在接种前后奶的温度应控制在42±1℃（在活性乳加入发酵乳的温度应低于20℃）接种温度过低会使菌种的活化时间延长，发酵缓慢而且污染杂菌的机会增加，对发酵不利，接种温度过高不但会抑制菌种的活力而且可能杀死发酵菌影响甚至终止发酵。菌种的接种量应该严格控制，接种量太大则发酵过快，不利发酵乳的风味完全形成和良好组织结构的构建，接种量太小，则发酵周期太长，污染杂菌的几率增加。一般直投式的接种量为10-20U/T，继代式菌种的接种量为2-3%。发酵过程温度和时间控制也是重要因素，在整个发酵过程中，发酵罐（发酵室）的温度都应恒定（42-43℃），温度波动太大会严重影响发酵的进程，使发酵乳的品质变差；发酵的时间也应该严格控制，时间太短，发酵风味不好，结构差；时
乳酸菌的加工工艺
3.4菌种的选择［1］由于益生菌发酵乳在一般情况下，口感和风味很差，消费者难以接受。因此，在选择菌种时，常选择保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌与益生菌相配合，以改善风味。 3.5均质均质处理可使原料充分混匀，有利于提高乳酸菌的稳定性和稠度，使酸乳质地细腻，口感良好。均质所采用的压力一般为20～25MPa。3.6杀菌杀灭原料乳中的杂菌，确保乳酸菌的正常生长和繁殖，钝化原料乳中对发酵菌有抑制作用的天然抑制物；使牛乳中的乳清蛋白变性，以达到改善组织状态，提高粘稠度和防止成品乳清析出的目的，杀菌条件一般为90～95℃，5min。3.7接种杀菌后的乳应马上降温到45℃左右，以便接种发酵剂。接种量根据菌种活力、发酵方法、生产时间的安排和混合菌种配比而定。加入发酵剂应事先在无菌操作条件下搅拌成均匀细腻的状态，不应有大凝块，以免影响成品质量。3.8发酵［2］单独使用益生菌作为发酵剂时，酸化作用较慢，所以需要采用其他方式抑制杂菌的生长。可以采用的方法有：利用能刺激生长的第五来加快酸化作用；提高发酵剂中的菌数，或者选择能促进彼此生长的益生菌株，这些方法可单独使用，也可联合使用。由于益生菌在牛奶中生长能力较差，为此，我们必需利用二次发酵方法，即开始用益生菌在40℃条件发酵5h，然后再用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵（1：1），使益生菌在乳中成为优势菌群。由于益生菌是一类厌氧菌群，因此发酵时发酵液不要搅动，以免空气混入，影响发酵。后发酵时间在12h以上。3.9调酸酸液必需稀释至浓度为10%左右，然后经杀菌处理（95℃,10min）3.2原料乳的质量要求用于制作发酵剂的乳核生产发酵乳的原料乳必须是高质量的，要求酸度在18?T以下，杂菌数不高于500000cfu/mL，乳中全乳固体不得低于11.5%。 3.3发酵乳生产中的辅料3.3.1脱脂牛乳乳粉用作发酵乳的脱脂乳粉要求质量高、无抗生素和防腐剂。脱脂乳粉可提高干物质含量，改善产品组织结构，促进产酸，一般添加量为1%～1.5%。3.3.2乳化稳定剂稳定剂的添加，有利于保持乳的均匀一致性，其添加量应控制在0.1%～0.5%。 3.3.3配料软化水、乳化稳定剂、蔗糖、蛋白糖等辅料溶化后，必须经杀菌处理（95℃,10min），冷却后才能加入到发酵乳中。冷却温度不能过低，否则影响胶磨和均质质量；也不能过高，否则将杀死菌群，一般选择冷却温度为52℃。 5.常见问题及处理方法5.1不凝不凝的原因可能是发酵剂失灵，原料乳中含有抗生素活生产过程中受杂菌污染。必须每天对发酵剂进行活力测定，活力达不到要求的不得使用。加强原料乳的验收工作，发现乳内混有抗生素，不得用于发酵乳的生产。每天要对生产设备、仪器进行认真消毒。5.2产气发酵乳容易产生气泡，主要原因是发酵剂菌种不纯，混入产气菌，生产设备、管道及原料消毒不彻底，生产中人为污染等原因造成的。必须经常进行正规而严格的纯度实验，检查发酵剂中有无杂菌的污染，加工设备消毒。5.3乳清分离正常的成品发酵乳组织状态应平整光滑，凝固结实，组织细腻。如出现凝块崩坏，乳清分离，则可能是由于停止发酵后的搬运及运输途中的振动，致使凝块破碎而析出乳清。此外，当用母发酵剂制成生产发酵剂后，最好贮存3天再用，时间太短对组织状态也有较大影响。除上述情况外，消毒温度不足65℃，或乳中总干物质含量低于7%，都会造成成品组织状态不佳。乳清析出多因发酵时间太长，温度过高或发酵剂添加过量所造成的。5.4酸度不适酸奶的酸度过低，主要是发酵时间不足或发酵温度不适宜。如不是上述原因请检查发酵剂活力是否符合要求以及发酵剂的添加量是否合理。另外，牛乳中固形物含量不够，有发酵阻碍物质存在，有噬菌体溶化益生菌发酵产酸时也可能影响酸度。必须找出真正的原因，以采取相应的措施。酸度过高，主要是发酵时间过长，发酵后冷却温度过高，以及乳中固形物含量过高。 5.5异味、异臭产生异味可能是制品生产过程中被杂菌污染，并在乳中生长保存或长期老熟。 5.6香味不足制品香味不足，可能是菌种选择不当或使用的混合发酵剂中，发酵温度不适合，发酵时间不够都会使制品风味不足
乳酸菌及其乳酸菌发酵食品
乳酸菌及其乳酸菌发酵食品 发酵是一种古老、传统的食品储存与加工的方法，凡利用微生物的作用而制得的食品都可以称为发酵食品。发酵食品是人类巧妙地利用有益微生物加工制造的一类食品，具有独特的风味和营养价值，丰富了我们的饮食生活。发酵食品因在食品加工过程中有微生物参与作用，进而可以形成一些特异性风味物质和营养因子，如乳酸菌参与牛乳发酵，产生乙醛、丁二酮、丙酮、3-羟基丁酮、挥发性酸等芳香物质，以及胞外多糖、乳酸菌素、γ-氨基丁酸等营养因子。 乳酸菌是发酵食品最主要的有益微生物之一，人类对于乳酸菌的应用历史非常久远，在远古人类就在酿造食品方面不自觉地利用了乳酸菌。但是，人类能主动地去研究和掌握乳酸菌的生活规律，并加以应用，还是近百年的事。 1 乳酸菌 1.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是一类以糖为原料产乳酸为主的细菌的总称，乳酸菌不是分类学上的名词，属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eabacteriales)中的乳酸细菌科(lactobacillaceae)。在伯杰氏系统细菌分类学上，目前已发现的乳酸菌，至少分布于乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Strptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)，乳球菌属(Lactococcus)等19个属的微生物中。其中，在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要分布在乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等七个属种。 1.2 乳酸菌的基本特性 乳酸菌是革兰氏阳性，不形成芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，不耐高温，但耐酸的球菌或杆菌，乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在氧含量低或无氧的环境中生长。与其它细菌相比，乳酸菌对营养的要求比较严格，除了要供给适量的水分、充足的碳源、氮源和无机盐类外，还需要加入维生素、氨基酸等生长因子。乳酸菌都能发酵一定的糖类产生乳酸，但分解蛋白质和脂肪能力微弱，过氧化氢酶反应呈阴性，适宜在偏酸的环境中生长，可使培养基pH 值降到5.0以下，产酸及耐酸能力都较强。 1.3 乳酸菌的发酵类型 乳酸菌的发酵根据产物的不同，分为三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵是指发酵终产物中90%以上为乳酸的乳酸发酵过程，以乳酸链球菌和多数乳酸杆菌为主。异型乳酸发酵是指发酵终产物中除乳酸外,还有乙醇、二氧化碳等成分的乳酸发酵过程，以明串珠菌属的乳酸菌以及某些乳酸杆菌,如肠膜明串珠菌、短乳杆菌、甘露醇乳杆菌等。双歧发酵是双歧杆菌的产能模式，双歧杆菌是一类特殊的严格厌氧菌,对营养要求较高,它们对葡萄糖的代谢也可归入异型乳酸发酵,但与其他乳酸菌的异型发酵不同。 1.4 乳酸菌的代谢产物 乳酸菌发酵的代谢产物主要有有机酸类、细菌素类、乙醛等芳香物质、胞外多糖、γ-氨基丁酸等。有机酸类主要有乳酸、乙酸，及少量的甲酸、丙酸等，具有抗菌防腐的作用，并带给食品酸性的口感；细菌素又称乳酸菌素，具有固定抗菌谱，对病原菌和腐败菌具有很强的抑制能力；乙醛等芳香物质给乳酸菌发酵食品带来独特的发酵风味；胞外多糖作为生命物质的重要组成部分，广泛参与细胞的各种生命现象及生理过程的调节；γ-氨基丁酸是神经系统中重要的抑制性神经递质，具有改善脑机能，调节情绪抗焦虑，降低血压等方面具有重要作用。
乳酸菌高密度规模发酵工艺优化
乳酸菌高密度规模发酵工艺优化 随着人们对抗生素滥用的重视,益生菌越来越广泛地应用于饲料、食品和医药行业,乳酸菌作为一种微生物资源因此受到越来越多的关注。乳酸菌高密度规模发酵是为提高菌体的发酵密度而使用的技术手段和特殊的培养装置,使菌体密度相较于普通培养方式能有显著的提高,最终提高菌细胞的产出率的一种扩大培养方式。 在实际生产过程中,乳酸菌菌体密度是乳酸菌发酵产品的重要指标。本试验以嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌为研究对象,筛选适合其增殖的培养基,研究适合乳酸菌的培养条件,优化乳酸菌中试高密度发酵工艺以及冷冻干燥保护剂组成。 本文的研究结果如下:(1)两株乳酸菌的形态学特征乳酸乳球菌在MRS培养基上可以形成明显的白色菌落,直径在1mm左右,圆形边缘整齐,不透明,表面光滑无皱褶。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围由于产酸形成透明的水解圈。 显微镜下观察,细菌成球形,不形成链状。嗜酸乳杆菌在MRS培养基上可以形成明显的菌落。 菌落圆形、白色、凸起,表面光滑、边缘较光滑,直径在1mm左右。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围形成透明水解圈。 在显微镜下观察,细菌成短杆状。两株乳酸菌通过革兰氏染色均为紫色,是革兰氏阳性菌。 (2)乳酸菌培养条件前期发酵条件优化前期实验室工作通过对两株乳酸菌的条件优化摸索,确定了以乳清粉为中试培养基,并确定乳酸乳球菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在6.5、接种量在2%-7%之间,而接种量对最大活菌数的影响并不显著。培养28h可获最多的活菌,最大活菌数为 1.92±0.15
×108CFU/mL;嗜酸乳杆菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在 6-6.5、接种量在5%-7%之间。 嗜酸乳杆菌在乳清粉培养基中培养32h可获得最大活菌数为1.53±0.15 × 1 08 CFU/mL。(3)高密度规模化发酵工艺优化随着乳清粉含量的增加,通过离心获得的乳酸菌干重是不断增加的。 当乳清粉含量增加至60%时,细胞干重(DCW/L)增加至13.21 g/L。通过乳清粉的添加,可以显著提高发酵罐中乳酸菌的细胞干重。 而从菌粉获得率计算,当乳清粉含量增加至60%时,嗜酸乳杆菌获得率增加 至23.42%。(4)冷冻干燥保护剂优化通过对离心获得的菌体添加10%的脱脂奶粉和10%的葡萄糖,或添加10%脱脂奶粉和10%海藻糖能够达到较高的复苏率。 通过进一步筛选得到四种具有显著保护性能的保护剂,并通过对乳酸乳球菌冷冻干燥保护剂的四因素三水平正交实验,结果得出这四种因素对于冷冻干燥后复苏率的影响,从大到小的顺序依此是葡萄糖>硫酸锰>脱脂奶粉>海藻糖。这四个因素对于冷冻干燥后的复苏率的影响都是极显著的,是影响该实验结果的主要因子。 通过正交实验,确定了一种冻干保护性较强的冻干保护剂组合,这种冻干保 护剂配比为每公斤菌体添加葡萄糖90g、海藻糖90g、硫酸锰60g、脱脂奶粉30g。冷冻干燥后的菌粉在储藏时应保持低温的环境,本次实验制备的两种菌粉在-20℃C环境下密封保存4周后,存活率仍能超过50%。 (5)乳酸菌耐受实验两株冻干菌粉对于人工消化液均有一定的耐受能力,乳 酸乳球菌在人工胃液中模拟消化3h存活率9.3%。在人工肠液中,经过4h的模拟消化过程,乳酸乳球菌的存活率为8.6%。
乳酸菌饮料的生产工艺及关键控制点
乳酸菌饮料的生产工艺及关键控制点 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
乳酸菌饮料的生产工艺及关键控制点 1．生产工艺流程? 2．A．发酵乳生产? 3．鲜牛乳→验收→净化→标准化→杀菌→高压均质→冷却→接种发酵→纯酸奶? 4．Ｂ．乳酵菌乳饮料生产? 5．糖和稳定剂干粉混合→搅拌溶解→杀菌→加入山梨酸钾和甜味剂→加入酸奶→加入酸味剂→加入香精→高压均质→灌装→（杀菌）→成品? 6．2．关键控制点? 7．关键点①：发酵乳的制作：A．原料奶收购。刚收购鲜奶一般要求在5℃下低温保存，抑制微生物的繁殖，牛奶酸度控制在16-18，细菌总数≤200000个/ mL，芽孢总数≤100个 /mL，耐热芽孢总数≤50个/ mL，嗜冷菌≤10 个/mL，体细胞数≤500000个/mL,密度(20℃/4℃)1. 028～1.032 ，脂肪≥3.0g/100g；蛋白质≥3.0g/100g；乳糖≈4.5g～ 5.0g/100g，抗生素残留≤0.007IU/ml(0.004μg/ml)。B.原料奶热处 理。对原料乳的热处理（90℃保持10分钟或95℃保持5分钟）主要有两个目的：杀死原料乳的致病菌和有害微生物；使原料乳中的蛋白质适度变性，增加蛋白质的持水能力，增加发酵乳的网状结构，同时还有利于发酵菌的利用。C．菌种选择．对乳酸菌饮料的发酵剂一般选择嗜热链球菌和保加利亚杆菌，通常它的比例为1：1或2：1，杆菌
不能占优势，否则酸度太强．Ｄ．发酵控制．目前常用菌种最适当生长温度为42-43℃，因此在接种前后奶的温度应控制在42±1℃（在活性乳加入发酵乳的温度应低于20℃）接种温度过低会使菌种的活化时间延长，发酵缓慢而且污染杂菌的机会增加，对发酵不利，接种温度过高不但会抑制菌种的活力而且可能杀死发酵菌影响甚至终止发酵。 菌种的接种量应该严格控制，接种量太大则发酵过快，不利发酵乳的风味完全形成和良好组织结构的构建，接种量太小，则发酵周期太长，污染杂菌的几率增加。一般直投式的接种量为10-20U/T，继代式菌种的接种量为2-3%。发酵过程温度和时间控制也是重要因素，在整个发酵过程中，发酵罐（发酵室）的温度都应恒定（42-43℃），温度波动太大会严重影响发酵的进程，使发酵乳的品质变差；发酵的时间也应该严格控制，时间太短，发酵风味不好，结构差；时间太长则酸度太高，口感不好。一般要求直投式菌种发酵时间在3.5-6小时，继代式菌种的发酵时间稍短，一般在2.5-4小时，严格控制确保每次发酵乳品质一致性。 关键点②：稳定剂选择及溶解。A．稳定剂的选择。稳定剂是影响乳制品品质的重要因素，由于在酸性环境下，乳制品本身处于不稳定的状态，乳酸菌饮料易出现水析及沉淀，甚至水乳分层现象，因此对稳定剂的稳定效果有更大的依赖性，要求稳定剂有很好的稳定作用。单体胶（果胶、PGA、CMC）单独使用时对乳酸菌饮料稳定作用不是很理想，一般复配使用。Ｂ．稳定剂的溶解。由于乳酸菌饮料的稳定剂是以胶体为主，而且一般添加量较大，因此若直接加到水中容易吸水形成胶团，难以溶
乳酸发酵工艺流程
工艺流程：淀粉 水解反应 葡萄糖 预处理 液仓 淀粉乳 盐酸（酸化）调配 预热（85℃～90℃） 均质（300～500KPa） 杀菌(100℃，10min) 冷却(50℃左右) 菌种保藏菌种活化菌种扩培接种 发酵（终点pH4.2） 冷却（15℃～20℃） 溶解杀菌混合 氮源、中和剂（碳酸钙）分离
提纯 乳酸成品 保持冷链贮存或销售 4.2.1.2 操作要点说明 （1）预处理 净化可以除去原料中的杂质，使淀粉达到最高的纯净度。 （2）水解 淀粉是葡萄糖以ɑ-1，4-糖苷键连接起来的多聚体，在催化剂存在和适宜温度等条件下，易于水解成葡萄糖、麦芽糖、糊精等单体或低聚物。合理控制水解，尽可能减少副反应发生，则是糖化工艺所要控制的关键。 （3）预热 预热一方面可以杀菌，而且由于适当加热，可以使葡萄糖液化，并完全去除淀粉和多聚糖的存在，增加产品的稳定性。预热温度控制在85℃～90℃。 （4）均质 均质主要是使原料充分混合均匀，阻止分层，提高葡萄糖的稳定性和稠度，并保证单体均匀分布，从而获得质地细腻、口感良好的产品。均质压力控制在300～500KPa。 （5）杀菌 杀菌目的在于杀灭原料中的杂菌确保乳酸杆菌的正常生长和繁殖，钝化原料中的天然抑制物。杀菌温度控制在100℃，保温10min进行杀菌。 （6）冷却 冷却主要是为接种的需要。经过热处理的糖乳需要冷却到一个适宜的接种温度，此温度控制在50℃左右。 （7）接种 接种是造成糖乳受微生物污染的主要环节之一，因此严格注意操作卫生，防止细菌、酵母、霉菌、噬菌体及其他有害微生物的污染。接种时充分搅拌，使发酵菌与原料混合均匀。
（8）发酵 发酵温度控制在50℃左右，从而为微生物代谢提供最适的温度环境，发酵时间24h，且期间不搅拌。 自由逃逸。当残糖降到1g/1时，发酵终点判定：发酵时罐口敞开，让CO 2 就识为发酵已经完成，再测定pH 4.2时即可停止发酵。 （9）冷却 冷却目的是抑制乳酸菌的生长、降低酶的活性、防止产酸过度、使糖液逐渐 析出的速度。将发酵乳迅速降温至15℃～20℃。 凝固、降低和稳定CO 2 （10）混合 将经溶解和杀菌的氮源、中和剂与发酵乳进行混合。 （11）分离提纯 由于乳酸在发酵过程中加入碳酸钙，因此，发酵最终的醪液悬乳酸与碳酸钙形成的乳酸钙，以水和形式存在。根据这一特性，采取相应的过滤介质和方法，即离子交换脱盐转酸方式及其分离提纯工艺。 （12）灌装和冷藏 采用相应灌装机进行灌装后的成品置于0℃～5℃冷藏12h～24h，进行后熟。
乳酸菌发酵及酸奶工艺优化研究
乳酸菌发酵及酸奶工艺优化研究 在经济不断发展过程中，人们的生活水平发生了很大的变化，在生活质量方面有了很大的提高。在人们生活水平提高的同时，人们的思维方式也发生了很大的变化，人们在生活中，对酸奶饮品的需求量出现了越来越多的情况。酸奶饮品成为了人们生活中越来越重要的食品，因此，人们对酸奶加工工艺也非常重视，这样能够对酸奶销量中存在的问题进行解决。在酸奶生产中，乳酸菌发酵水平是核心技术，对其进行分析，能够对酸奶工艺进行优化。 标签：乳酸菌；发酵原理；优化 经济水平的不断提高，人们在生活观念上发生了很大的变化，对健康问题越来越重视，同时，对生活品质的追求也在逐渐提高。奶制品在营养成分方面非常好，因此，受到了人们的欢迎，在奶制品中，酸奶因为能够促进消化，同时，在吸收效果方面非常好，受到了很多人的喜爱。在酸奶制作工艺中，要对乳酸菌工艺进行重视，这样能够对酸奶的质量进行保证。 1 乳酸菌的定义及种类 1.1 定义 乳酸菌是一种发酵糖类产生的物质，其主要是一种革兰氏染色阳性细菌，通常，乳酸菌主要分为18个属类，一共有200多种。乳酸菌也会形成在葡萄糖或者乳糖的发酵过程中，这种物质是一种对人体非常有益的益生菌。乳酸菌在很多的产品生产中都进行了使用，这种物质能够对食品的营养价值进行提高，而且，对食品的口味也能进行改变，同时，对食品的附加值也进行了改变。人们对乳酸菌的性能进行重视，因为能够对人体健康情况产生影响。很多实验研究表明，在食品中添加乳酸菌能对胃肠正常菌群进行改善，同时，也能提高食物的消化率，对胆固醇也能进行降低。 乳酸菌能够对肠道内出现的腐败菌生长繁殖进行控制，同时，也能制造很多的营养物质，对机体的营养状态以及生理功能都有很大的影响。乳酸菌的生理功能和机体的生命活动有很大关系，一旦乳酸菌出现停止成长的情况，就会导致人和动物的健康情况受到很大影响。乳酸菌被应用到很多行业生产中，其中，在食品行业中效果最为明显。乳酸菌是一种对人体有益的益生菌，能够和碳水化合物进行融合，最终形成有利于人体肠胃消化的物质，因此，乳酸菌被视为对健康有利的物质，在酸奶生产中得到了广泛的应用。 1.2 种类 乳酸菌的种类非常丰富，有来自于动物源的物质，但是这种菌种在状态方面非常的不稳定，因此，在生物功效方面也极其不稳定，人们在食用这种物质以后经常会出现动物蛋白过敏的情况，同时也会导致排异反应出现。另外一种是植物