、八—1—
前B
1.本课程主要讲述了哪些实验技术,其中被称为生化实验室中三大实验技术的是?
答:层析技术、电泳技术、离心技术、分光光度技术、免疫化学技术。其中层析技术、电泳技术、离心技术是生物学的三大实验技术。
第一章生物化学基本操作与要求
1 ?洗涤液的种类配置与应用
答:(1)钻酸洗液(称取5g重絡酸钾粉末置于250mL烧杯中,加水5mL,尽量使其溶解, 慢慢加入浓硫酸lOOmL,边加边搅拌。冷却后贮存备用,若颜色变绿,表示洗液已失效。)用于洗涤玻璃器皿。(2)浓盐酸,洗去水垢或某些无机盐沉淀。(3) 30%硝酸,洗涤CO? 测定仪器及微量滴管(4) 45%尿素,洗涤蛋白制剂、血样(5)有机溶剂,洗涤油脂、脂溶性染料(6)去污粉,一般污染物
2.化学试剂的分级
答:
第二章层析技术
1.层析技术及其原理
答:层析技术是一种基于被分离物质的物理、化学、生物学特性的不同,使它们在某种机制中移动速度不同而进行分离和分析的方法。
O
2.层析法的分类
答:按流动相的形式分:气相色谱法1.气固色谱法2.气液色谱法,液相色谱法1.液固色谱法2.液液色谱法;按固定相的形式分:1 .柱层析法2.纸层析法3.薄层层析法。
3.几种主要凝胶的中英文名称、型号、及型号数字代表的含义
答:葡萄糖凝胶(dextran型号Sephadex G?10?200数字代表凝胶的吸水率)
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide主要型号有Bio-Gel P-2?30(),数字代表它们的排阻极限的10'3)琼脂糖凝胶(agarose Sepharose,Bio-Gel A)
4.凝胶层析及其基本原理、操作过程和主要应用
答:是利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。原理:由于被分离物质的分子大小不同,洗脱时,大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部,只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随溶剂向下移动,因此流程短,首先流出层析柱,而小分子物质,由于直径小于凝胶网孔,能自由进出胶粒网孔,使之洗脱流程增长,移动速度慢而后流出层析柱。应用:1)脱盐及去除小分子杂质2)蛋白质的分离、生物大分子的纯化3)分子量测定4)去热源物质5)溶液的浓缩
第三章电泳技术
1.电泳(技术)的概念
答:带电物质在电场屮向相反电极移动的现象。
2.电泳的分类
答:按分离的原理:1.区带电泳2.自由界面电泳3?等速电泳4.等电聚焦电泳;
按支持介质的不同:1?纸电泳2.酷酸纤维薄膜电泳(1、2为区带电泳)3.琼脂凝胶电泳
4.聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳(PAGE)
5.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);按支
持介质形状不同:1.薄层电泳2.板电泳3.柱电泳;
按用途不同:1?分析电泳2.制备电泳3.定量免疫电泳4.连续制备电泳;
按所用电压不同:1.低压电泳2.高压电泳。
3.什么是迁移率?影响迁移率、电泳分离的主要因素
答:是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度,m二v/E。
迁移率与带电分子所带净电荷成正比,与分子的大小和缓冲液的粘度成反比,与粒子的形状有关;
电泳分离的影响因素:1?带电颗粒的性质(所带净电荷的数量大小及形状)2.溶液的pH 值(离等电点远,快)3.溶液的离子强度(离子强度小泳动快)4.电场强度5.电渗作用
(方向一致,快)6.支持介质的筛孔。
4.如何制备聚丙烯酰胺凝胶?
答:1.化学聚合:加速剂TEMED使催化剂过硫酸钱形成自由基,这些自由基的产生可引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应形成;
2.光聚合:催化剂核黄素经光照形成无色基,再被痕量氧氧化成自由基,引发聚合反应。
TEMED存在可加速聚合。
5.什么是双向电泳?
答:由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合组成。第四章离心技术
1.离心技术的概念
答:是利用转头旋转产生的离心力,根据物质颗粒沉降系数、质量、密度的差异将其分离的方法。
2.名词:相对离心力、、沉降系数、
答:相对离心力:F-mo2r, F常用重力加速度表示,称为相对离心力。
沉降系数:单位离心力下的沉降速度。
3.离心机和离心转头(转子)的种类
答:离心机的种类:低速、高速、超速离心机,冷冻离心机,台式、地式离心机,制备性、分析性离心机;
离心转头的种类:1.角度转头FA2.甩平式转头SW3.垂直转头V4.区带转头Z5.连续流动转头CF。
4.简述离心分离的方法(3种)p99~101
答:1.差速沉降离心:不断改变离心速度,使沉降速度不同的颗粒在不同的速度和时间下分批分离的方法,一般用于沉降系数相差较大的颗粒,用角度转头。
2.差速区带离心:在一定离心力的作用下存在沉降系数差的不同颗粒各自以一定速度沉降,
后在密度梯度不同的介质上形成区带,用于分离有一定沉降系数差的颗粒或密度相似大小不同的样品和核酸、蛋白质等成分。
3.等密度离心:离心管中预先放好梯度介质离心时,样品的不同颗粒一直移动到与他们密
度相等的特定梯度位置上,形成不同的区带,用于分离人小相近而密度不同的样品。
5.如何进行离心区带的收集?
答:1.用注射器和滴管由离心管上部吸出
2.用针刺穿离心管底部滴出
3. 用针刺穿离心管区带部分的管壁,把样品区带抽出
4. 用一根细管插入离心管底,泵入超过梯度介质最大密度的取代液,将样品和梯度介质压出, 用自动部分收集器收集。
第五章分光光度技术
吸收光谱:通常分子处于基态,当他吸收一定能量跃迁到激发态,则产生吸收光谱。
3. 图示说明分光光度计的基本结构
答:
劉L I
吸收池 检测器 测■仪表 (玻璃)(光电池) (微电流计)
4. 分光光度计的光源及适用范围
答:光源要求:1?能提供连续的辐射;2.光强度足够大;3.在整个光谱区内光谱强度不随 波长有明显变化;4.光谱范围宽;5.使用寿命长、价格低。
热辐射光源用于可见光和近红外光区的光源如钩灯和卤钩灯,使用波长范围是 32()?llOOnm,
气体放电光源用于紫外光区的如氢灯和氛灯,使用波长范I 韦I 是195?400nm 。
5. 分光光度法在核酸与蛋白质的纯度分析中的应用原理
答:可用A260/A280的比值鉴定其纯度
纯DNA 比值为1.8,纯RNA 比值为1.0。
第六章免疫化学技术
2. 阐述2种免疫电泳的原理(对流免疫电泳、火箭免疫电泳) 答:
在pH8?6的磁凝胶中,抗原蛋白质带负电 荷,抗体几乎不带电荷。在电泳时,由于电渗竹 用的影响,抗体向负极移动。将抗原置于负极, 将血清抗体叠丁?正极,电泳后则在两孔之间相 遇,并在比例适当的部位形成沉淀线。
① I o
② )o
③ 0(
④ Q
图12?10对流电泳结果示意图
① Ag 为阳性:②Ag 为弱阳性:③Ag 为强阳性:④Ag 为强阳性
光源
单色器 钩灯) (梭傥)
火箭免疫电泳,是将单向免疫扩散和电泳相结合的一朿
定量检测技术。
支持物:琼脂糖,加入抗体融化
缓冲液pH&6,抗原带强负电,而抗体在 此pH 不带
电,不能迁移。
电泳时,含于琼脂糖凝胶中的抗体与 抗原结合,
形成一个形状如火箭的不溶性 免疫复合物沉淀峰,
峰的高度与检样中的 抗原浓度呈正相关。
根据样品的沉淀峰长度即可计算出待
测抗原的含量。
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3. 对流免疫电泳与双向免疫扩散法的异同 答:对流免疫电泳:是在凝胶介质中将电泳法和扩散法相结合的一种免疫化学方法。 双向免疫扩散法:是以琼脂为介质的Ag-Ab 沉淀反应。
异:对流免疫电泳是抗原、抗体分子在电场作用下定向运动,双向免疫扩散法是自由扩散。 同:都基于琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应的特性,根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡,诃 定性定量地检测岀样品屮抗原或抗体的存在及含量。
4. ELISA 及其基本原理
答:酶联免疫吸附法是指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反 应的定性和定量方法。
基本原理: P121
1) 使抗原或抗体结合到固相载体表而
2) 抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体
3) 把受检标本(Ag 或Ab )和酶标抗原或抗体与 固相载体表面的抗原或抗体起反应n 结合在固相 载体丄的酶量与受紐标本(Ag 豉Ab )量成正比
4) 加入酶的底物后,底物被酶催化反应生成有 色物质,颜色的深浅与受检物质的量成正比。
第七章固定化技术
1. 固定化酶、固定化细胞的概念
答:固定化酶:将水溶性酶用物理化学方法处理,固定于不溶性载体上,称为不溶于水, 但仍有酶活性的一种酶制剂形式。
固定化细胞:就是被限制自市移动的细胞,即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一 定的空间界限内,但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。
2. 固定化酶的优点,
沉淀帯 含有抗休的胶
答:优点:1.纯化简单2.酶的稳定性有所改进;
3.酶的使用效率提高,可以反复利用;
4.反应条件容易控制。
3.固定化酶的制备方法
答:1)吸附法:利用离子键、物理吸附等方法,将酶固定在纤维素、琼脂糠、多孔玻璃等载体上;2)包埋法:用物理方法把酶包埋在凝胶细小的格子中,或包围在半透膜或聚合物中,酶本身不参与反应;3)共价结合法:酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定话酶的方法;4)交联法:双功能试剂或多功能试剂与酶分子中的氨基酸残基作用,使酶与酶之间交联成网。
4.固定化细胞比固定化酶有何优点?
答:
1?省去酶纯化的过程,降低成本。
2?可以单一酶的形式作用,也可以复合酶系形式完成部分代谢或发酵过程。3?细胞增殖,酶反应加快。
4.可以连续发酵生产。
5 ?可以保持酶的原始状态。
第八章生物大分子制备技术
1.生物大分子的制备的一般步骤是哪些?答:
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行:
①确定要制备的生物大分子的目的和要求。
②建立可靠的分析测定方法
③掌握生物大分子目的产物的理化性质。
④生物材料的预处理和细胞破碎。
⑤分离纯化方案的彌。
⑥生物大分子制备物的均一性(纯度)的鉴定。
⑦产物的浓缩,干燥和保存。
2.生物大分子制备物均一性要满足什么鉴定要求? 答:
1?纯度:主要取决于研究的目的和应用上的要求。如为研究蛋白的结构,要求均一;
工业医药方面应用的酶和蛋白质制剂,达到一定纯度即可,不要求均一.
2?活性:要求大分子保持天然构象状态,有高度的
生物活性。
3?收率:希望收率越高越好,但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多,损失越大。
3.细胞破碎的方法
答:
?:?动物组织和细胞:可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。?:?植物组织和细胞:由于具有细胞壁,一般常用
与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法
破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。
?:?细菌细胞的破碎:比较困难,因为整个细菌细胞壁的骨架是共价键连接而成的肽聚糖大分子,非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡.与石英砂研磨.高压挤压.溶菌酶处理(以分解肽聚糖)。
反复冻融法;自溶法;溶胀法;有机溶剂处理法;表面活性剂处理法。
5.蛋白质的分离纯化方法及简述(分四大类,pl42)
答:1?以分子大小和形态的差异为依据的方法:差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等;
2.以溶解度的差异为依据的方法:盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等;
3.以电荷差异为依据的方法:电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等;
4.以生物学功能专一性为依据的方法:亲和层析等。
5.什么是膜分离、透析、超滤、盐析法
膜分离:用具有选择透过膜性能的薄膜(分离膜),在外力推动下对多组分溶质和溶剂进行分离、提纯、浓缩的方法。
透析:是通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理,将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
超滤:是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜,而使大分子溶质不能透过,留在膜的一边,从而使大分子物质得到了部分的纯化。盐析:溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程
6.DNA、RNA的定量
答:
1、紫外分光光度法要求是较纯的样品。
测叫、OD280
1 OD260 = 50 gg/mL 双链D\A
=40 fig/mL 单链DNA或RNA =2() pg/mL单链寡核昔酸
OD260/OD280JhJ断核酸纯度:
纯DNA OD260/OD280 = 1.8
纯RNA OD26(/OD280 =2.0 若有蛋白质、酚类污染,则明显降低
2、荧光定量电泳EB染色
第九章放射性同位素技术
1?什么是同位素示踪法,有什么特点?
答:是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法。
特点:1?灵敏度高2.测量方法简便易行3.能准确地定量定位4.符合研究对象的生理条件。
2.放射性防护的三原则
答:放射实践的正当化、放射防护的最优化、个人剂量限制
第十章PCR
1.什么是PCR, PCR的主要步骤是什么?
答:聚合酶链反应技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苗三磷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶进行的酶促合成反应。主要步骤:1.双链DNA模板加热变性成单链(变性);
2.在低温下引物与单链DNA互补配对(退火);在适宜温度下TaqDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸(延伸)。
2.什么是PCR-SSCP,简述它的基本原理、主要应用。
答:
?聚合酶链式反应?单链构象多态性
?是在PCR技术基础上发展起来的,它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物屮单碱基突变(点突变)的手段。
?该方法已被用做癌基因和抑癌基因突变的筛查检测,遗传病的致病基因分析和基因诊断,基因制图等领域。
原理:
在SSCP测定中,双链DNA被变性成为单链DNA, 每一条单链DN A都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象,即使同样长度的DNA 单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA用非变性PAGE分离,单链DNA的迁移率和带型,都取决于其折叠构象。
高级动物生化试题 问答题: 1. 简述非编码RNA(non-coding RNA)的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA(transfer RNA,tRNA) 结构特征之一是含有较多的修饰成分,核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的,但其功能不清楚。5’末端具有G(大部分)或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环,在这一环的顶端有三个暴露的碱基,称为反密码子(anticodon).反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构,tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息,并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体,同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用,又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能,例如,在没有核糖体或其他核酸分子参与下,携带氨基酸转移至专一的受体分子,以合成细胞膜或细胞壁组分;作为反转录酶引物参与DNA合成;作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA) 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA,在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分,并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”,蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象,但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明,rRNA并非仅仅起到物理支架作用,多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如:核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构,同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成,与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环,类似tRNA中的二氢尿嘧啶环,称为“D”环。H3和H4,H6和H7,H8和H9,H10和H11之间分别形成Pk1,pK2,pK3,pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成,类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环,称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域(TLD)和mRNA类似域(MLD),TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环,MDL则包括ORF和H5,这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器(如叶绿体,线粒体)中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能,它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时,它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关,是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体,也识别那些延迟停转的核糖体,介导这些有问
【实验操作考核要点】 一、目的要求 1.掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 3.正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4.熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合适的混匀方法)。 5.正确掌握溶液转移的操作。 6.正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1.吸量管操作(20分); 2.可调式微量移液器操作(20分); 3.溶液混匀操作(视具体情况,采用合适的混匀方法)(15分); 4.溶液转移操作(10分); 5.分光光度计比色操作(25分)。 6.整体表现(10分)。 三、操作考核标准 (一)吸量管操作(20分,每项操作5分) 1.执管 要求右手拿吸量管,左手拿橡皮球,只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度;吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2.坐姿 要求腰、背保持竖直,看刻度时眼睛保持平视。 3.吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm,不能一插到底,也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内;调控吸量管吸取液量的刻度时,吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4.排出液体
吸量管尖应靠上受纳容器内壁,让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压,而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 (二)可调式微量移液器操作(20分,每项操作5分) 1.设定容量值 转动加样器的调节旋钮,反时针方向转动旋钮,可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮,可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时,不要用力过猛,并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2.吸液 (1)选择合适的吸头安放在取液套筒上,稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙; (2)把按钮压至第一停点,垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮,吸入液体,等一秒钟,然后将吸头提离液面,贴壁停留2-3秒,使管尖外侧的液滴滑落。 3.放液 (1)将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜; (2)平稳地把按钮压到第一停点,等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体; (3)压住按钮,同时提起加样器,使吸头贴容器壁擦过,再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4.压放按钮时保持平稳;加样器不得倒转;吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕,将取液器读数调至最大量程值,竖立放于支架上。 (三)溶液的混匀(操作流程中下划实线的三处,每项操作5分,共15分)1.肝糖原的提取与鉴定操作中,肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀,也可用滴管或吸量管吸、吹混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。 2.肝糖原定量测定中,肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶,加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3.肝糖原定量测定中,加蒽酮溶液后的混匀,可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液(浓硫酸配制)比重大于样品水溶液很多,一加入便沉于管
实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时,2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物,这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键,因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出,双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应,因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热,产生蓝紫色化合物,此反应为一切蛋白质及α-氨基酸(除脯氨酸 和羟脯氨酸)所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏,1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此,此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的(特别是含酪氨酸)蛋白质溶液与硝酸共热时,呈黄色(硝基化合物),再加碱则变为橙黄色,此反应也称为黄蛋白反应。 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH
三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液:取10mL鸡蛋清,用蒸馏水稀释至100mL,搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1%茚三酮-乙醇溶液:称取0.1g茚三酮,溶于100mL 95%乙醇。 (4) 10%NaOH溶液、1%硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器:试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管,加入少量尿素,用微火加热使之熔化,待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时,尿素已缩合为双缩脲并放出氨气(可由气味辨别)。待试管冷却,加入约1mL10%NaOH溶液,振荡使其溶解,再加入1滴1%硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取1支试管,加入1mL蛋白质溶液,再加入2mL 10%NaOH溶液摇匀,然后再加入2 滴1%的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量,否则会产生蓝色的氢氧化铜,从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果,并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管,分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL,再加0.5mL 0.1%茚三酮-乙醇溶液,混匀后在小火上加热煮沸1-2min,放置冷却,观察颜色变化。 (2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液,风干后再在原处滴 一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察斑点出现及其颜色。 (3) 记载上述实验过程和结果,并解释现象。 3、黄色反应 向6个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。
生物化学第一章蛋白质化学测试题 一、单项选择题 1.测得某一蛋白质样品的氮含量为0.40g,此样品约含蛋白质多少?B(每克样品*6.25) A.2.00g B.2.50g C.6.40g D.3.0 0g E.6.25g 2.下列含有两个羧基的氨基酸是:E A.精氨酸B.赖氨酸C.甘氨酸 D.色氨酸E.谷氨酸 3.维持蛋白质二级结构的主要化学键是:D A.盐键 B.疏水键 C.肽键D.氢键 E.二硫键(三级结构) 4.关于蛋白质分子三级结构的描述,其中错误的是:B A.天然蛋白质分子均有的这种结构 B.具有三级结构的多肽链都具有生物学活性 C.三级结构的稳定性主要是次级键维系 D.亲水基团聚集在三级结构的表面 E.决定盘曲折叠的因素是氨基酸残基 5.具有四级结构的蛋白质特征是:E
A.分子中必定含有辅基 B.在两条或两条以上具有三级结构多肽链的基础上,肽链进一步折叠,盘曲形成 C.每条多肽链都具有独立的生物学活性 D.依赖肽键维系四级结构的稳定性 E.由两条或两条以上具在三级结构的多肽链组成6.蛋白质所形成的胶体颗粒,在下列哪种条件下不稳定:C A.溶液pH值大于pI B.溶液pH值小于pI C.溶液pH值等于pI D.溶液pH值等于7.4 E.在水溶液中 7.蛋白质变性是由于:D A.氨基酸排列顺序的改变B.氨基酸组成的改变C.肽键的断裂D.蛋白质空间构象的破坏E.蛋白质的水解 8.变性蛋白质的主要特点是:D A.粘度下降B.溶解度增加C.不易被蛋白酶水解
D.生物学活性丧失 E.容易被盐析出现沉淀9.若用重金属沉淀pI为8的蛋白质时,该溶液的pH 值应为:B A.8 B.>8 C.<8 D.≤8 E.≥8 10.蛋白质分子组成中不含有下列哪种氨基酸?E A.半胱氨酸 B.蛋氨酸 C.胱氨酸 D.丝氨酸E.瓜氨酸 二、多项选择题 1.含硫氨基酸包括:AD A.蛋氨酸 B.苏氨酸 C.组氨酸D.半胖氨酸 2.下列哪些是碱性氨基酸:ACD A.组氨酸B.蛋氨酸C.精氨酸D.赖氨酸 3.芳香族氨基酸是:ABD A.苯丙氨酸B.酪氨酸 C.色氨酸D.脯氨酸4.关于α-螺旋正确的是:ABD A.螺旋中每3.6个氨基酸残基为一周 B.为右手螺旋结构
大学生生物化学实验技能大赛初赛试题及答案 一、选择题 1、下列实验仪器中,常用来取用块状固体药品的仪器是()。 A. 药匙 B. 试管夹 C. 镊子 D. 坩埚钳 2、托盘天平调零后,在左盘衬纸上置氧化铜粉末,右盘衬纸上置1个5g砝码,游码标尺示数如下,此时天平平衡。则被称量的氧化铜质量为()。 A. 8.3 g B. 7.7 g C. 3.3 g D. 2.7 g 3、用减量法从称量瓶中准确称取0.4000 g分析纯的NaOH固体,溶解后稀释到100.0 mL,所得NaOH溶液的浓度为()。 A. 小于0.1000 mol/L B. 等于0.1000 mol/L C. 大于0.1000 mol/L D. 三种情况都有可能 4、已知邻苯二甲酸氢钾(KHC8H4O4)的摩尔质量为204.2 g/mol,用作为基准物质标定0.1 mol/L NaOH溶液时,如果要消耗NaOH溶液为25 mL左右,每份应称取邻苯二甲酸氢钾()g左右。 A. 0.1 B. 0.2 C. 0.25 D. 0.5 5、NaHCO3纯度的技术指标为≥99.0%,下列测定结果哪个不符合标准要求?()。 A. 99.05% B. 99.01% C. 98.94% D. 98.95% 6、精密称取马来酸氯苯那敏对照品12 mg,应选取()的天平。 A. 千分之一 B. 万分之一 C. 十万分之一 D. 百万分之一 7、实验室标定KMnO4溶液,常用的基准物质是()。 A. Na2CO3 B. Na2S2O3 C. Na2C2O4 D. K2Cr2O7 8、标定氢氧化钠常用的基准物质是()。 A. EDTA B. K2Cr2O7 C. 草酸 D. 邻苯二甲酸氢钾 9、下列物质可以作为基准物质的是()。 A. KMnO4 B. Na2B4O7·7H2O C. NaOH D. Na2S2O3 10、下列物质中,可以用直接法配制标准溶液的是()。 A. 固体NaOH B. 浓HCl C. 固体K2Cr2O7 D. 固体Na2S2O3
生物化学实验讲义 赵 国 芬 2010年9月
实验之前说明 1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实 验的方法,同时开出不同的10个实验. 2.共开出10个不同的实验 实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定 实验三血液葡萄糖的测定-福林(Folin)-吴宪氏法 实验四双缩脲测定蛋白质的含量 实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定 实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用 实验八植物组织中维生素C的定量测定 实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验十植物组织中DNA的提取和鉴定 3.穿着要利索,做好实验记录 4.注意实验室卫生和安全. 一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解. 二. 生物化学所用的实验技术 1.样品: :血液、血浆、血清、组织 植物样品:果实、花蕾、茎等 无论用什么做材料,为了提取物质,需匀浆 2.移液管的使用: 移液管吸管 移液管 奥氏吸管 读数时视线与凹面相平,取液时要用吸管嘴吸,放出液体时注意嘴部液体的残留问题。 3.离心机的使用: 平衡(管平衡、机器平衡)缓起和慢停 4.分光光度计 机器原理和测定原理(比尔定律) 5.水浴锅的使用 三、实验报告的书写(用教务处统一印刷的报告纸写) 目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论
实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 一、实验目的 通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响,对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。 二、实验原理 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素,都可以使酶丧失活性。此外,温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉,被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化,可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序,遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 三、试剂 1.0.5%淀粉溶液 2.碘化钾-碘溶液 3.1%尿素溶液。 4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0: 6.0.5%NaCl溶液。 7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次,然后取20m1蒸馏水含于口中,半分钟后吐入烧杯中,纱布过滤,取滤液lOml,稀释至2Oml为稀释唾液,供实验用。 四、操作步骤 一、温度对酶活性的影响 (一)淀粉酶的观察 1、取3支大试管,编号后按表操作 2、在白色比色板上,置碘液2滴于各孔中,每隔1分钟,从第二管中取出反应
华中农业大学本科生课程考试试卷 考试课程与试卷类型:植物生理学实验原理与技术(A)姓名: 学年学期:2008-2009-1 学号: 考试时间:2009--班级: 一、名词解释 ( 每题 4 分 , 共 12分 ) 1. 聚丙烯酰胺凝胶 2. 离心技术 3.可见光分光光度法/反相纸层析 二、填空题 ( 每空 2 分 , 共 42分 ) 1. 反相纸层析法分离油菜不饱和脂肪酸的实验中 ,分离后的不饱和脂肪酸经红氨酸溶液显色后 , 其最终产物颜色是(1),从点样端起层析谱带所对应的脂肪酸依次是 (2) 、(3)、(4)、(5)、(6)。 2. 圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶的实验中 , 电泳时上槽接电源(7)极 ,下槽接电源 (8) 极 , 电泳开始电流应调节至每管(9)mA, 十分钟后电流调节至每管 (10) mA; 在上槽或样品中加入溴酚蓝是起(11)的作用。 3. 核酸提取过程中 , 将含有 DNA 的溶液置72℃处理 3 分钟,其目的是(12);在淀粉酶活性测定过程中将淀粉酶液置于 70℃下处理 15 分钟的目的是(13)。 4.在微量凯氏定氮法测定植物组织中的总氮和蛋白氮,有三个主要的实验阶段,它们分别是(14)、(15)和(16)。在第二阶段,若收集三角瓶中的溶液颜色由_(17)变为(18),表明反应完全。第三阶段所用的标准浓度的滴定溶液名称是(19)。 5. DNA 提取研磨时加入的研磨缓冲液的NaCl浓度是(20),研磨时加入SDS的作用是(21)
三、是非判断题 (判断对错,对的标T,错的标F,每题 2 分,共 10 分 ) 1.萌发的小麦种子中含有很高活性的淀粉酶,其中α-淀粉酶不耐热,在70℃迅速钝化。() 2.本学期测定还原性糖和可溶性蛋白含量时都用到了斐林试剂,这两个实验中所用的斐林试剂的配方是相同的。() 3.DNA提取中,加入冷乙醇是为了使DNA分子复性变粗。() 4.离心机使用中,要求同一台离心机所用的离心管都有相同的重量。()5.油菜种子硫甙葡萄糖苷的快速分析法中,反应的实质是测定水解硫苷产生的葡萄糖的数量。() 四、问答题(共36分) 1.试述维生素C测定的基本原理及其实验过程中的注意事项(12分) 2.简述凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。为什么一些不法商人要在蛋白质制品中加入三聚氰胺?(12分) 3.凝胶电泳法测定同工酶的原理是什么?为什么本学期所作的胶条染色后显示的谱带就是过氧化物同工酶带?(12分)
生物化学实验技能大赛活动方案 一、活动目的 通过举办生物化学实验技能大赛,使广大学生树立崇尚科学,勇于创新,开拓进取,敢于实践的精神风貌,增强专业素养。在深化教育改革,推进素质教育的要求下,不断提高学生实验设计及实验操作的能力,从而提高广大学生学习《生物化学》这门课程的兴趣,推动生物化学实践教学的改革;增加同学们的合作交流,促进相互间的学习与沟通,拓展知识的应用范围,培养创新意识及团队精神,提高综合实验设计、分析和生物化学实验操作技能,提高大学生动手能力和实践技能,促进我校良好学风的建设,营造浓厚的学习、学术氛围,特此举行此次生物化学实验技能大赛。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔。 二、组织机构 主办单位:韶关学院教务处 承办单位:英东生命科学学院团委 三、参赛对象 韶关学院全日制在校学生均可参加,自行组队(可跨专业),团队人数1至4人。 四、比赛流程: 1.初赛 各参赛队伍需上交报名表(附件1)并按照作品格式要求(附件2)独立完成实验设计,于2016年11月9日-11月20日将实验设计和报名表(放在同一文件夹压缩打包命名为:学院+实验课题+队长姓名+队长短号)发送至邮箱()参加初赛,纸质版需上交到英东楼B309生科院辅导员办公室处。评委老师对实验设计进行评定后,筛选出约20支参赛队伍进入复赛。 2.复赛 2016年11月26日09:00—17:00为预实验阶段,实验室开放,各参赛队伍可在当天熟悉比赛场地或对所需材料、仪器、试剂等作实验前的预处理。 2016年11月27日09:00—17:00为正式复赛阶段,进入实验室按照实验设计进行操作,并当场完成实验报告,复赛分数根据实验过程及实验报告进行评定。 复赛评选出8支队伍进入决赛,决赛名单当场公布。 复赛地点:英东实验室 决赛 2016年12月3日19:00—22:30为决赛阶段,进行实验报告答辩,决赛分为四个环节:报告陈述、现场答辩、观众提问、专家点评。获奖的实验报告将在英东大厅展示15天。 决赛地点:图书馆学术报告厅 五、参赛要求 1.作品内容 (1)物质提取类 如从柑橘皮中提取果胶;从果蔬中提取类胡萝卜素;从芦荟中提取碳水化合物;从鸡蛋清中提取某蛋白;从三七中提取三七皂等。 (2)物质检验类 如检验市面上某几种品牌牛奶是否掺假;检验市面上某几种食品是否含有防腐剂;检验某品牌的食用植物油是否含胆固醇等。 (3)物质含量测定类 如洗衣粉磷含量分析;测定某品牌奶粉的蛋白质含量是否达标;比较几种饲料中某物质的含量等。
生物化学实验报告 姓名: 专业: 院系: 学号:
实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法 一、实验原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法,又叫做分子筛层析法,排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛,它可以把分子按大小不同进行分离,如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡,使其充分戏液膨胀,然后装入层析柱中,加入欲分离的混合物后,再以同一溶剂洗脱,在洗脱过程中,大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外,而小分子可以进入凝胶内部,流速缓慢,以致最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,无论是天然凝胶还是人工凝胶,它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶,人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶,后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶,它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶,不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构,其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后,交联度高的,孔隙小,只有相应的小分子可以通过,适于分离小分子物质。相反,交联度低得孔隙大,适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后,柱床总体
积称为“总体积”,以Vt表示。实质上Vt是由Vo,Vi与Vg三部分组成,即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积,相应于一般层析柱法中内流动相体积;Vi为内体积,即凝胶颗粒内部所含水相的体积,Vg为凝胶本身的体积,因此Vt-Vo等于Vi+Vg。 洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示: Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长短粗细无光,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得,上式可改写成: Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积;Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出;Vi可由g.Wr求得。因此,对一层析柱凝胶床来说,只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。 Vo表示外体积;Vi内体积;Ve II、Ve III分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况: 1、当Kd=0时,则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质,洗脱体积等于空隙体积。
邻二氮菲法测定蔬菜中铁的含量 摘要 用邻二氮菲分光光度法直接测定蔬菜中的铁含量,方法简便、快速、准确,为指导人们合理食用蔬菜进行补铁及进一步开发蔬菜产品提供了可靠的理论依据[1 2]。 关键词蔬菜铁含量邻二氮菲 1.前言 铁作为必需的微量金属元素,对于人体的健康十分重要。铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其它酶系统的主要组分,可协助氧的运输,还能促进脂肪的氧化。蔬菜是人们摄取微量铁的主要途径之一,缺铁可造成贫血并容易疲劳,而过多则会导致急性中毒。所以,蔬菜中铁含量的测定具有重要的营养学意义,可为指导人们合理食用蔬菜进行补铁以防治缺铁性贫血,提供可靠的理论依据。 2.实验目的 综合运用所学知识,用仪器分析法测定金属元素含量;练习灵活运用各种基本操作和查阅资料的能力。 3.实验原理 蔬菜中金属元素常与有机物结合成难溶或难于解离的物质,常采用有机物破坏法是被测的金属元素以氧化物或无机盐的形式残留下来,以便测定。本实验采用有机物破坏法(干法),即在高温下加入氧化剂,使有机物质分解。根据不同浓度的物质具有不同的吸光度,采用分光光度法来测定蔬菜中的铁含量。在pH值4~6的条件下,以盐酸羟胺将三价铁还原为二价铁,二价铁再与邻二氮菲(phen)生成桔红色络合物[3],用分光光度计在510nm测定蔬菜中铁的含量。 盐酸羟胺还原三价铁的反应如下: 2 Fe3++2NH2OH·HCl→2 Fe2++N2+2H2O+4H++2Cl- 邻二氮菲与二价铁的反应式如下: Fe2+ + 3(phen) =Fe(phen)3 4.实验器材 722型分光光度计(1台),电子天平(1台)蒸发皿(4个),100mL容量瓶(4个),
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理. 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物,等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理,将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、.抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计. 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95%乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol/L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、.乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r/min)。弃去清液,得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次,离心10分钟(3000r/min), 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇,搅拌片刻,将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次,抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上,风干;得酪蛋白纯晶。 5、准确称重,计算含量和得率。 含量:酪蛋白g/100mL牛乳(g%)
得率: 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么? 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2(C6H10O5)n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性,能使3,5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
生物化学实验理论考试题答案 1.醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端,为什么? 答;电泳时点样端应靠近负极,因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电,根据同性相吸,异性相斥原理,点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时,设置空白对照管的作用,为什么? 答;空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度,但是作为溶剂也能吸收,反射和透射一部分的光,因此必须以相同的溶剂设置对照,排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜的电泳原理? 答;血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动,而各种蛋白质等电点不同,且在PH为8.6时所带电荷不同,分子大小不等,形状各有差异,所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.何谓Rf值?影响Rf值的因素? 答;Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度有关,对同一种物质来讲Rf是一个常量。 5.什么是盐析?盐析会引起蛋白质的变性吗?一般用什么试剂? 答;盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时,蛋白质的溶解度下降,当中性盐的浓度达到一定程度的时候,蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性,因为蛋白质的结构并未发生改变,去掉引起盐析的因素蛋白质仍能溶解;一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析 6.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理? 答;还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸,而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比,用分光光度计测出溶液的吸光度,通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度,从而得出还原糖的浓度。 7.影响蛋白质沉淀的因素是什么?沉淀和变性有什么联系? 答;水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶
生命科学学院 关于举办首届大学生生物化学实验技能竞赛的通知 一、竞赛目的 激励大学生自主学习,培养大学生创新意识和团队精神,增强综合实验设计能力,提高生化实验操作技能,营造浓厚学术创新氛围,促进良好学风的建设,选拔优秀项目和选手参加山东省第五届生物化学实验技能大赛。 二、竞赛组委会 组长:王宝山、魏成武 成员:戴美学、杨桂文、谭效忠、苗明升、张鸿雁、杜希华、王珂、原永洁三、参赛对象 生命科学学院在校本科生,不限年级和专业。参赛队伍2-3人为一队,每队一名指导教师。每个参赛队限提交一份实验设计书,每个指导教师指导的项目数一般不超过6项。 四、参赛作品内容及要求 (一)作品内容 1、物质提取类 如从柑橘皮中提取果胶;从果蔬中提取类胡萝卜素;从芦荟中提取碳水化合物;从鸡蛋清中提取某蛋白;从三七中提取三七皂等。 2、物质检验类 如检验市面上某几种品牌牛奶是否掺假;检验市面上某几种食品是否含有防腐剂;检验某品牌的食用植物油是否含胆固醇等。 3、物质含量测定类
如洗衣粉磷含量的分析;测定某品牌奶粉的蛋白质含量是否达标;比较几种饲料中某物质的含量等。 4、探索物质在某一方面的应用类 如探索蛋白酶对草菇保鲜的影响机理;探索木瓜蛋白酶在食物色氨酸测定上的应用等。 5、比较不同品牌物质的营养价值 如对不同品牌螺旋藻片营养成分测定和营养价值的评价测定;对不同品牌饲料中营养价值比较等。 6、其他参赛者感兴趣的方面 (二)作品要求 1、作品要求在保证安全性的前提下,具有一定的科学性、实用性、创造性,具有较强的实际意义,以创新及紧密联系生产生活实际为佳,同时在实验室内的可操作性强。 2、每组参赛队严格按照实验设计书设计格式要求撰写实验设计书,并提交至大赛邮箱,一经提交不得修改,违者则取消决赛资格。 3、参赛作品原则上不能与山东省大学生生物化学实验技能大赛前四届作品相同(前几届作品请参考大赛相关网站:http://202.194.131.160/G2S/ Template/View.aspx?action=view&courseType=0&courseId=282),亦不可抄袭外省比赛作品,否则取消参赛资格。 4、实验设计书设计的项目最好进行过预实验(可利用寒假在指导教师指导下利用实验室条件进行预实验),并在“生科院首届大学生生物化学实验技能竞赛报名表”中如实注明是否做过预实验。 5、实验设计内容应能在8小时内完成,便于决赛时在限定的时间内进行实验操作。
实验一胆固醇的提取2012-11-15 16:20:00 生物师范班题目 1.比色法测定样品的理论基础是什么? 被测样品必须要有颜色。 2. 胆固醇含量在多少范围时,与值呈良好的线性关系? 在400mg/ml范围内。 3.在提取胆固醇的过程中,为什么要加无水乙醇? 促使蛋白质沉淀。 4.在试管中加入1ml磷硫铁试剂,会产生什么现象?(至少写2点) 产生紫红色化合物。产生热量。 5.在无水乙醇中加磷硫铁试剂时,正确的加法是什么?将产生什么现象?请准确描述 该现象。 沿管壁慢慢加入。溶液分层。上层是无水乙醇,下层是磷硫铁试剂。 1. 胆固醇提取过程中,无水乙醇为什么要分两次加入? 目的是使蛋白质以分散很细的沉淀颗粒析出。 2.我们用比色法测定胆固醇含量的仪器名称是什么? 分光光度计 3. P-S-Fe试剂配置时,能用稀硫酸吗?为什么? 不能。因为FeCl3本身是亲水性物质,稀硫酸中含有水,会降低P-S-Fe试剂的浓度,从而导致反应不能发生。 4.请简述移液枪的使用步骤。 根据所要吸取的溶液的体积选定合适量程的移液枪。 调好量程。 插枪头。 吸取液体。 将移液枪的量程调至最大。 5. 请简述0.08mg/ml胆固醇标准溶液的配置方法。 准确称取胆固醇80mg,溶于无水乙醇,定容至100ml 将贮液用无水乙醇准确稀释10倍既得。
实验二总糖和还原糖测定2012-11-15 16:20:00 生物师范班 1. 请写出还愿糖与非还原糖结构的不同之处 拥有自由的醛基和酮基 2. 对没有还原性的糖,用什么方法进行糖含量的测定? 酸水解的方法将非还原性的糖降解呈还原糖。 3. DNS之所以能和还原糖反应,是因为其结构中含有__________? 硝基 4. 如果将DNS和其与还原糖反应的产物同时进行比色,谁的A值更大?为什么? 产物的更大,因为产物生成棕红色,颜色越深,吸光度越高。 5. 还原糖提取过程中,为什么要离心两次? 因为这样可以更好地将还原糖全部提取出来。第二次洗涤沉淀。 海洋技术班 1.单糖都是还原糖吗?为什么? 是的,因为有自由醛基和酮基 2.为什么能用比色法测定还原糖的量? 因为还原糖的量与光吸收值呈线性关系。 3.DNS的全称是? 3,5-二硝基水杨酸 4.总糖提取过程中,碘液的作用是什么? 确认淀粉水解完全。 5.请简述标准曲线的作用。 通过标准曲线来算出未知样品的浓度。
生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI; 2、层析; 3、透析; 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳; 5、蛋白质变性; 6、复性; 7、Tm 值; 8、同工酶; 9、Km值; 10、DNA变性;11、退火;12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量,哪一种方法需要完整的肽键( ) A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的() A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口(Sakaguchi)反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是() A、苯异硫氰酸 B、2,4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收() A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中,哪一种在280nm具有最大的光吸收() A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质() A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后,可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净,你选用下列哪一种试剂检查() A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于() A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有() A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为()
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:(图1-1光吸收示意) 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率,L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法; 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中,在电场的作用下,向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带,用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比,与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大,带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远,质点所带净电荷越多,电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压),博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂,琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小,消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快,电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
枣庄学院2016年大学生生物化学实验技能大赛 初赛试题及答案 一、选择题 1、下列实验仪器中,常用来取用块状固体药品的仪器是()。 A. 药匙 B. 试管夹 C. 镊子 D. 坩埚钳 2、托盘天平调零后,在左盘衬纸上置氧化铜粉末,右盘衬纸上置1个5g砝码,游码标尺示数如下,此时天平平衡。则被称量的氧化铜质量为()。 A. 8.3 g B. 7.7 g C. 3.3 g D. 2.7 g 3、用减量法从称量瓶中准确称取0.4000 g分析纯的NaOH固体,溶解后稀释到100.0 mL,所得NaOH溶液的浓度为()。 A. 小于0.1000 mol/L B. 等于0.1000 mol/L C. 大于0.1000 mol/L D. 三种情况都有可能 4、已知邻苯二甲酸氢钾(KHC8H4O4)的摩尔质量为204.2 g/mol,用作为基准物质标定0.1 mol/L NaOH溶液时,如果要消耗NaOH溶液为25 mL左右,每份应称取邻苯二甲酸氢钾()g左右。 A. 0.1 B. 0.2 C. 0.25 D. 0.5 5、NaHCO3纯度的技术指标为≥99.0%,下列测定结果哪个不符合标准要求?()。 A. 99.05% B. 99.01% C. 98.94% D. 98.95% 6、精密称取马来酸氯苯那敏对照品12 mg,应选取()的天平。 A. 千分之一 B. 万分之一 C. 十万分之一 D. 百万分之一 7、实验室标定KMnO4溶液,常用的基准物质是()。 A. Na2CO3 B. Na2S2O3 C. Na2C2O4 D. K2Cr2O7 8、标定氢氧化钠常用的基准物质是()。 A. EDTA B. K2Cr2O7 C. 草酸 D. 邻苯二甲酸氢钾 9、下列物质可以作为基准物质的是()。 A. KMnO4 B. Na2B4O7·7H2O C. NaOH D. Na2S2O3
实验一蛋白质和氨基酸的呈色反应 一、目的要求 (1)学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。 (2)学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。 二、原理 ㈠蛋白质和氨基酸鉴定常用方法 蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构,可以与某些试剂反应、生成有色物质。 1.双缩眠反应 当脲(即尿素)加热至l80℃时.两分子脲缩合,放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。 然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。这一呈色反应称为双缩脲反应。 紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。 蛋白质或二肽以上的多肽分子中,含有多个与双缩脲结构相似的肽键,因此也有双缩脲反应。应当指出,含有—个CS—NH2、一CH2一NH2,一CRH—NH2,一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2,-CHOH—CH2NH2等基团的物质,甚至过量的铵盐也干扰本实验。
2.Salkowski(1888)蛋白黄色反应 它是芳香族氨基酸,特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。苯丙氨酸和苯 反应很困难。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄,原因在此。 硝基苯衍生物呈黄色,在碱性溶液中,它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。参考反应是: 3.茚三酮反应 蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色 外.其他氨基酸生成紫红色.最终为蓝色化合物。
三、器材与试剂 ㈠器材 ⒈试管及试管架⒉水浴锅⒊量筒⒋滴管⒌滤纸片⒍移液管 ㈡试剂和材料 ⒈10%NaOH溶液⒉1%CuSO4溶液⒊0.5%苯酚溶液⒋浓HNO3 ⒌卵清蛋白溶液(蛋清:水=1︰20)⒍尿素⒎0.1%茚三酮乙醇溶液 四、操作步骤 1.双缩脲反应 (1)取一支干燥的试管,加入少量尿素,用微火加热使尿素熔化,待融化的尿素重又开始硬化时停止加热,此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨(可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色)。试管冷却后,加入约1毫升10%氢氧化钠溶液,振荡使双缩脲溶解,再加入2滴1%硫酸铜溶液,混匀后观察有无紫色出现。