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Bradford法测蛋白质浓度

Bradford法测蛋白质浓度
Bradford法测蛋白质浓度

参考文献Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

Anal. Biochem. 72:248–254.

Bradford法测蛋白质浓度——完整版

【摘要】:配制一组浓度分别为0.10mg/ml ,0.08mg/ml,0.06mg/ml ,0.04mg/ml ,0.02mg/ml,0 mg/ml 的牛血清蛋白(BSA)溶液,测定这组溶液的吸光度,得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度,根据标准曲线得到蛋白质的浓度。

Bradford法检测蛋白浓度专题

Bradford法测蛋白质浓度

一、实验目的

配制一组浓度分别为0.10mg/ml ,0.08mg/ml,0.06mg/ml ,0.04mg/ml ,0.02mg/ml,0 mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液,测定这组溶液的吸光度,得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度,根据标准曲线得到蛋白质的浓度。

二、实验原理

考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质—色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/ml,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

三、实验过程

1.准备所需的药品和仪器。

2.计算所需配制的溶液的量。

先配制1 mg/ml的牛血清蛋白(BSA)母液,再往母液中加入磷酸缓冲溶液(PBS)配制一组浓度分别为1.0mg/ml ,0.8mg/ml,0.6mg/ml ,0.4mg/ml ,0.2mg/ml的BSA溶液,再将这组溶液稀释10倍,得到一组浓度分别为0.10mg/ml ,0.08mg/ml,0.06mg/ml ,0.04mg/ml ,0.02mg/ml的BSA溶液。计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。

3.具体操作过程。

用天平称量1.00g牛血清蛋白(BSA),溶于去离子水中,配成100ml的溶液,溶液的浓度为10mg/ml。用移液枪分别取100ul,80ul,60ul,40ul,20ul的BSA溶液,置于1.5ml 的EP管中,再分别加入900ul,920ul,940ul,960ul,980ul的磷酸缓冲溶液(PBS)配成1ml 的溶液,震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为1.0mg/ml ,0.8mg/ml,0.6mg/ml ,0.4mg/ml ,0.2mg/ml的BSA溶液。

移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液,置于1.5ml的EP管中,各加入900ul 的PBS溶液,震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为0.10 mg/ml ,0.08mg/ml,0.06mg/ml ,0.04mg/ml ,0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液(BSA溶液浓度为0 mg/ml)作对照试验。

用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液,滴加到孔板中,再分别加入200ul的考马斯亮蓝(CBB)。静置10min后,用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。

四、实验数据及处理

测得的BSA溶液的吸光度如下:

用orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线。

五、实验结果分析

得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807,R2=0.9541。可以看出吸光度—浓度的关系曲线中R2值较小,即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点:一是移液枪的操作不是很熟练,二是移液枪在移液过程中存在着气泡,使移的液体体积不准确。

(整理)6种方法测定蛋白质含量.

6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏(kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05NaOH配制。 (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4?5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6?4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 2.器材: 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分

几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 (一)蛋白质测定方法的比较(原理、优缺点)蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry 法)和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry 法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2010) 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高,适用于0.2~ I.Omg氮,误差为土2%;操作复杂费时,整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。,测得结果为总氮含量,包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广,几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法(一) 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

蛋白质含量测定方法汇总

实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有染料法,双缩脲(Biuret)法,酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1.掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2.了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合,此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色,吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势,因为它操作简单,反应时间短,染料-蛋白质颜色稳定,抗干扰性强。本法的缺点是:对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质,有一定误差,因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的,故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管;试管;721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液:配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液:称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml,再加入85%的浓磷酸100ml,用水稀释至1000ml,混匀备用。

[操作步骤] 1.标准曲线的绘制: 按上表分别向各支试管内加入各种试剂,充分混匀,5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2.样品测定: 取1ml样品溶液(约含25~250微克蛋白质),加入染料溶液5ml混匀,5min后测定其595nm吸光度值,对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2),或与此相似的基团[如—CH2-NH2,—CS-NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-12-25| 字体: [大 中 小] 一、微量凯氏(kjeldahl )定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入cuso4作催化剂,k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得 样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(biuret 法) (一)实验原理 双缩脲(nh3conhconh3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与cuso4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较 【摘要】:蛋白质含量测定方法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford),Folin —酚试剂法(Lowry)杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以在本公司订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替,杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃),通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,每种方法都有其优缺点,在选择方法时应考虑:⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度;⑵蛋白质的性质;⑶溶液中存在的干扰物质;⑷测定所要花费的时间 【关键词】:凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 1.1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一,被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL;硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素;用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min;与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 凯氏定氮法适用范围广泛,测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品,节省时间,提高了工作效率,适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

蛋白质含量的测定

蛋白质含量测定法 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry 法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: CH2COOH |+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 170

2NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2) (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 五种蛋白质测定方法比较如下: 171

蛋白质含量的测定方法

蛋白质含量的测定方法 蛋白质含量的测定是我们判断每一种食物是否含有高蛋白,所以我们建议大家应该要对于蛋白质的检测方法有一定的认识。一般我们在生活中检查蛋白质含量的方法是通过硫酸铜的方法,也可以通过酚试剂的方法,所以大家觉得哪种方法比较方便,我们建议大家可以尝试一下文章介绍的方法。 双缩脲法(Biuret法)灵敏度低1~20mg中速20~30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似。 紫外吸收法较为灵敏50~100mg快速5~10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶; Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高~5mg慢速40~60分钟双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和phe还原硫酸铵;Tris 缓冲液;甘氨酸;各种硫醇耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化。 考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1~5mg快速5~15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液; SDS最好的方法;干扰物质少;颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化。 硫酸铜法:称取0.2g硫酸铜,6g硫酸钾,把0.5g粉碎好的大豆(不用测量水分的)用滤纸包好放入定氮瓶中中,加20ml硫酸,

(瓶口上放一个小漏斗,防止蛋白跑掉)小火在电炉子上消化,等没有碳化颗粒,并处于澄清状态时,拿下来凉一会。再加过氧化氢直到把瓶颈上的蛋白冲洗干净为止,再消化30分钟。拿下来,等凉。 通过这篇文章对于蛋白质含量测定方法的介绍,我们应该都知道如何在生活检查蛋白质的含量,所以我们建议大家应该要对于蛋白质的测定方法进行分析。一般我们在生活中检测蛋白质的方法是比较多的,希望你们可以采纳文章介绍的方法。

蛋白质含量测定方法比较

. 蛋白质含量测定主要有五种方法,分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点,优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点:重现性好,是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点:操作比较繁复,费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸,生物碱,含氮类脂,卟啉,含氮色素等非蛋白质含氮化合物。 双缩脲定氮法 双缩脲(NHCONHCONH)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个33分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO形成紫色络合物,称4为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点:较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的

缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋1 / 5 . 白质测定。 缺点:不太灵敏;不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点:对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。 缺点:准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。此外,进行紫外吸收

2010版药典lowry法测定蛋白含量的方法

第二法,Lowry法 ------摘自2010版药典 本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白复合物,此复合物加入酚试剂后,产生蓝色化合物,该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质的含量成正比,根据供试品的吸光度,计算供试品的蛋白质含量。 试剂 (1)酚试剂称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MnO4·2H2O)25g,置1500ml 蒸馏瓶中,加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml,上连回流管(使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞)微沸回流10 小时。取下回流管,加入硫酸锂150g、水50 ml、溴液几滴,煮沸约15分钟,驱除过量的溴。冷却,加水至1000ml,过滤,为酚试剂储备液。 酚试剂储备液用氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)测定酸浓度,然后加水稀释至相当于1mol/L沿酸浓度。 (2)碱性铜溶液量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5ml,4%碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25ml,摇匀,即得。本液临用配制。 (3)氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)的配制及标定去氢氧化钠适量,加水搅拌使溶解成饱和溶液,冷却后,置聚乙烯塑料瓶中,静置数日,澄清后,量取澄清的氢氧化钠饱和溶液28ml,加新煮沸后的冷却水,使成1000ml,摇匀。 取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g,精密称定,加新煮沸过的冷水50ml,振摇,使其尽量溶解;加酚酞指示剂2滴,用本液滴定;在接近终点时,应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解,滴定至溶液显粉红色。每1ml氢氧化钠滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量,算出本液的浓度。 标准蛋白溶液的制备用水将蛋白标准品定量稀释至每1ml含1mg,作为储 备液。精密量取储备液2.5ml置25ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即为每1ml含100μg 的标准蛋白质溶液。 测定法精密量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置试管内,加水至1ml, 加碱性铜溶液5ml,摇匀,室温放置10分钟,快速加入酚试剂0.5ml摇匀,室温放置30分钟,显色后,照紫外-可见分光光度法(附录ⅡA),在波长650nm处测定吸光度(呈色后,如果发现浑浊,经每分钟3000转离心15分钟后,取上清液测定)。精密量取标准蛋白溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中,自“加水至1ml”起,同法操作。准确量取水1ml,自“加碱性铜溶液5ml”起,同法操作,作为空白对照。以标准品的蛋白质浓度对其相应吸光度做直线回归,求得直线回归方程,即得供试品的蛋白质含量。

蛋白质含量测定(凯氏定氮法)

食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法) 一、目的与要求 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2、掌握凯氏定氮法的操作技术,包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。 三、仪器与试剂 硫酸铜(CuSO4·5H20)硫酸钾硫酸(密度为1.8419g/L)硼酸溶液(20g/L) 氢氧化钠溶液(400g/L)0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。 混合指示试剂:0.1%甲基红乙溶液液1份,与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。 微量定氮蒸馏装置:如图3-所示。 图3-微量凯氏定氮装置 1、电炉; 2、水蒸气发生器(2L平底烧瓶); 3、螺旋夹a; 4、小漏斗及棒状玻璃塞(样品入口处); 5、反应室; 6、反应室外层; 7、橡皮管及螺旋夹b;8、冷凝管;9、蒸馏液接收瓶。 四、实验步骤 1、样品消化 称取样品约2.00g(±0.001g),移入干燥的100mL凯氏烧瓶中,加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾,稍摇匀后瓶口放一小漏斗,加入20mL浓硫酸,将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上,使用万用电炉,在通风橱中加热消化,开始时用低温加热,待内容物全部炭化,泡沫停止后,再升高温度保持微沸,消化至液体呈蓝绿色澄清透明后,继续加热0.5h,取下放冷,小心加20mL水,放冷后,无损地转移到100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀备用,即为消化液。 试剂空白实验:取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸,按以上同样方法进行消化,冷却,加水定容至100mL,得试剂空白消化液。

几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较 蛋白质含量测定方法,是生物化学【摘要】: 研究中最常用、最基本的分析之一。目前 常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法 (Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford),Folin—酚试剂法(Lowry)杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以在本公司订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马 斯然烧定氮法所代替,杜马斯燃烧法是基 于在高温下(大约900 ℃),通过控制进 氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定 的。这6种方法并不能在任何条件下适用 于任何形式的蛋白质,每种方法都有其优

缺点,在选择方法时应考虑:⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度;⑵蛋白质的性质;⑶溶液中存在的干扰物质;⑷测定所要花费的时间 【关键词】:凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂 作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再 用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为 蛋白质含量。 特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一,被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样

试验——蛋白质含量测定方法

测定法比较: 定氮法比较繁复,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后样品仍能回收利用。缺点是准确度较差,干扰物质多,用标准曲线法测定蛋白质含量时,对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。 Lowry法是较早发展的一种灵敏的检测方法,最低灵敏度为5微克,通常测定范围20-250微克。优点是灵敏度高,缺点是费时较长,要精确控制操作时间,标准曲线不是严格的直线形式,且专一性差,干扰物质较多。 Bradford法是灵敏度更高的一种方法,优点有:灵敏度高,比lowry法高4倍左右,最低检测达1-5微克;测定快速、简便,染色稳定;干扰物质少。确点是用于不同蛋白质测定时有较大的偏差;仍有干扰,如SDS、去污剂、Triton x100等;标准曲线有轻微的非线性。 原理: 定氮法:蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分 解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。 双缩脲:将两分子尿素分子加热脱去一分子氨而形成的就是双缩脲 NH2-CO-NH-CO-NH2 双缩脲在碱性溶液中与CU2+结合形成紫红色络合物,这样的呈色反应,称之为双缩脲反应 因为蛋白质含有大量彼此相连的肽键(-CO-NH-),也可以在碱性条件下与CU2+进行双缩脲反应, 生成紫红色的络合物。且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10—120g/L这个范围内有良好的 线性关系。 Folin-酚试剂法(Lowry法):此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入 了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:①在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 ②Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深

蛋白质浓度的测定(精华)

蛋白质浓度的测定 一.紫外吸收法 1. 近紫外吸收光谱法(280 nm) 原理:蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基,这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质,它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。某些蛋白质含有二硫键,也会在280 nm附近吸收紫外光。近紫外吸收法就是根据这个性质,对蛋白质进行定量。因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异,所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。比如,当蛋白质浓度为1 mg/ml时,吸光度A280可为0-4之间的任何值。但是,大部分的蛋白质的吸光度A 时0.5-1.5之间的某个值。 280 该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。这种方法操作简单,测定完成后,样品可以被回收,对buffer没有特殊要求,这是该方法的优点。该方法的缺点是:其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定,比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强,少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。同时,不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。 蛋白质浓度的计算: 朗伯比尔定律:A (absorbance) = ε c l,因此:c(mg/ml)= A/ε l (cm)。消光系数:当蛋白质浓度为1 mg/ml,光径为1 cm时,所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。 蛋白质的消光系数计算公式:A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。其中M为蛋白质分子质量,5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数,n是该氨基酸残基的数目。 2. 远紫外吸收光谱法 在190-210 nm围,蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。此波长围,肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍,而且在190 nm,氧气对紫外光的吸收非常强,因此,通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。对于1 mg/ml的蛋白质溶液,它们的消光系数通常在30-35之间。对于不同的蛋白质,

几种蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定方法比较 蛋白质含量测定方法比较 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford 法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: CH2COOH + 3H2SO4→2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) 2NH3 + H2SO4→ (NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 五种蛋白质测定方法比较如下:方法、灵敏度、时间、原理、干扰物质 说明:凯氏定氮法(Kjedahl法)灵敏度低,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为±2%费时8~10h,将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定,非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离),用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长; 双缩脲法(Biuret法):灵敏度低1~20mg,中速20~30min,多肽键+碱性Cu2→紫色

蛋白质含量的测定(Folin—酚法)

实验报告 实验名称:蛋白质含量的测定(Folin-酚法)实验日期: 班级:学生姓名: 研究背景与目的:蛋白质是生物最重要的基本组成成份之一, 蛋白质的定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃,Folin-酚法是一种灵敏度极高,可快速测定蛋白质含量的方法,广泛地应用于蛋白质含量的测定。 本实验培养掌握使用Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和操作方法,同时熟练722分光光度计的使用和比色法。 实验原理:Folin-试剂是由两部分组成,甲试剂相当于双缩脲试剂,在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜离子结合生成络合物。试剂乙是磷钨酸和磷钼酸的混合液,在碱性条件下极不稳定,易被蛋白质和试剂甲生成的络合物还原,生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应。 根据此试剂与蛋白质的反应以及一定条件下,兰色深度与蛋白的量成正比,可用比色法,使用分光光度计,通过对呈现蓝色的混合物进行浓度测定,再依据比例计算出蛋白质含量。 仪器与试剂:722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司) 架盘天平 具塞刻度试管8支15ml 移液器100ul-1000ul和1ml-5ml 容量瓶50ml*1 小烧杯漏斗研钵 Folin酚试剂:试剂甲试剂乙 250ug/ml牛血清白蛋白标准原液 材料:绿豆芽下胚轴 实验步骤: 1.标准曲线的绘制 取6支15ml具塞刻度试管,编号。如下表所列加入相应试剂。 2.样品测定 (1)称取绿豆芽下胚轴1g于研钵中,匀浆。转入50ml容量瓶中,定容。然后过滤,滤液即为样品液。

(2)取具塞刻度试管2支,编号8、9,分别加入滤液1ml,分别加入试剂甲5ml,混匀后放置10分钟,然后各加入试剂乙0.5ml,迅速混匀,室温下放置半小时, 于650nm波长下比色,记录消光值,取其平均值完成计算。 数据整理与计算: 表1 Folin-酚法测蛋白质含量的标准曲线 图1 从标准曲线中查得样品的OD650平均值对应的蛋白质含量X(ug/ml)=71ug/ml,然后按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。 样品中蛋白质含量(%)=X(ug/ml)*样品总体积(ml)*100 样品重(g)*106 将数据X(ug/ml)=71ug/ml代入公式 样品中蛋白质含量(%)=71*50*100/(1*106)=0.355% 结果分析:经过本实验的数据计算,得到绿豆芽中蛋白质含量为0.355%,而网络上查得的绿豆芽中蛋白质含量为2.2%,与实验测得相差一个数量级,但是与其他实验组的同学讨论得知,所测得的含量都与我组所测的数量级相同。分析可知,豆芽的品种不同,生长所需要的条件和时间也不尽相同,所以与网络查得的数据比较价值很小,而与其他组比较可知我组数据相对准确。 参考文献:https://www.wendangku.net/doc/bf2700816.html,/view/e4ec35360b4c2e3f572763f6.html 《蛋白质含量的测定》 https://www.wendangku.net/doc/bf2700816.html,/life/class/biochemistry/Experimentation/Ex08.doc 《Folin—酚法测定血清蛋白质含量》 https://www.wendangku.net/doc/bf2700816.html,/view/499547a6f524ccbff1218488.html《蛋白质含量测定——福林酚法》 https://www.wendangku.net/doc/bf2700816.html,/blog/static/2041113420100209343510/《Folin—酚试剂法(Lowry法)》 思考题:

可溶性蛋白质含量的测定

可溶性蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝G—250染色法 一.原理 考马斯亮蓝G—250染色法是利用蛋白质与染料结合的原理,定量地测量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色,最大光吸收由465nm变成595nm,通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2min即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定1h之后,蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高(比Lowry法灵敏4倍)易于操作,干扰物质少,是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质很高时线性偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 二.实验材料、试剂与仪器设备 1.实验材料 水稻不同萌发时期的种子 2.试剂 (1)标准蛋白质溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)。称取牛血清白蛋白25mg,加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40Ml,用蒸馏水稀释至100mL即可。 (2)考马斯亮蓝试剂。称取100mg考马斯亮蓝G—250,溶于50mL90%乙醇中,加入100mL85%的磷酸,再用蒸馏水定容到1000mL,贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。3.仪器和设备 分光光度计,离心机,研钵,烧杯,量瓶,移液管,试管等。 三.实验步骤 1.标准曲线的绘制 取6支试管,按下表加入试剂,摇匀,向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂,摇匀,并放置5min左右,以0号试管为空白对照,在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2.样品测定 (1)样品提取。称取鲜样0.25—0.5g,用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,3000r/min 离心10min,上清液备用。 (2)吸取样品提取液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释),放入试管中(每个样品重复2次),加入5mL考马斯亮蓝试剂,摇匀,放置2min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查的蛋白质的含量。 四.结果计算 样品蛋白质的含量=C V/1000VW(mg/g) 式中:C—查标准曲线值,ug; VT—提取液总体积,mL; WF—样品鲜重,g; VS—测定时加样量,mL

蛋白质含量测定法

蛋白质含量测定法 蛋白质含量测定 组成蛋白质的基本单位是氨基酸,氨基酸通过脱水缩合形成肽链,蛋白质是一条或多条多肽链组成的生物大分子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方法学验证,同时应尽可能选用与待测品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。 第一法凯氏定氮法 本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物,当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质的含量。 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。 测定法除另有规定外,按测定法(1)操作。 (1) 本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的供试品溶液适量,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(附录VⅡ D第二法)测定供试品溶液的含氮量,除另有规定外,氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。 (2)本测定法适用于含有无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的总氮量及非蛋白氮供试品溶液适量,分别置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(中国药典2019年版二部附录第二法)测定,以总氮量减去非蛋白氮量即为供试品溶液的含氮量,除另有规定外,氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。 附注:非蛋白氮供试品溶液制备的常用方法: (1)钨酸沉淀法精密量取供试品适量(蛋白质含量不高于0.2g)置20ml量瓶中,加水10ml,加10%钨酸钠溶液2ml,0.33mol/L硫酸溶液2ml,加水至刻度,摇匀,静置30分钟,滤过,取续滤液,即得。(可依据蛋白质浓度适当调整10%钨酸钠溶液及0.33mol/L 硫酸溶液用量,使钨酸终浓度保持1%。) (2)三氯醋酸沉淀法精密量取供试品适量(蛋白质含量约6~12mg),加 等体积的10%三氯醋酸溶液,混匀,静置30分钟,滤过,取续滤液,即得。(可依据蛋白质浓度适当调整10%三氯醋酸溶液用量,使三氯醋酸终浓度保持5%。) 适用范围:本法灵敏度较低,适用于0.2~2.0mg氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中所含氨基酸的结构差异会稍有区别。 第二法福林酚法(lowry 法)

0731 蛋白质含量测定法 - 国家药典委员会

0731
蛋白质含量测定法
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组成蛋白质的基本单位是氨基酸, 氨基酸通过脱水缩合形成肽链, 蛋白质是一条或多条 多肽链组成的生物大分子。 不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方 法学验证,同时应尽可能选用与待测定品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。2 第一法 凯氏定氮法3
本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物, 当与硫酸和硫酸铜、 硫酸钾一同加热消化时使 蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸液吸收后以 硫酸滴定液滴定,根据酸的消耗量算出含氮量,再将含氮量乘以换算系数,即为蛋白质的含 量。 本法灵敏度较低,适用于 0.2~2.0mg 氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中 所含氨基酸的结构差异会稍有区别。 供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备,生物制品按如下方法操作。
精密量取供试品(如供试品为冻干制剂或固体粉末时,应复溶后量取)适量,用 0.9%氯 化钠溶液稀释并定量制成每 1ml 中含氮量约 1mg 的溶液,精密量取 1ml,作为总氮供试品 溶液进行测定。非蛋白氮供试品溶液的制备,除另有规定外,照附注项下钨酸沉淀法操作, 即得。 测定法 除另有规定外,按测定法(1)操作,生物制品按测定法(2)操作。
(1) 本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各 品种项下规定的供试品溶液适量,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(通则 0704 第二法)测定供 试品溶液的含氮量,除另有规定外,氮转换为蛋白质的换算系数为 6.25。
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中国药典 2010 年版一部无蛋白质测定的附录;二部附录Ⅶ M 中收载的蛋白质含量测定法,包括凯式定 氮法、福林酚法(Lowry 法) 、双缩脲法、2,2’-联喹啉-4,4’-二羧酸法(BCA 法) 、考马斯亮蓝法、紫外 -可见分光光度法共六种方法;三部附录Ⅵ B 中收载的蛋白质测定法,包括凯氏定氮法、Lowry 法和双缩 脲法三种方法。上海所通过对已有的蛋白质测定法的系统性、规范化研究,将中国药典 2010 年版二、三部 各附录的所有测定方法进行梳理规范,拟整合成统一的附录。 2 关于各法测定所用蛋白对照品,为正确规范使用对照品和标准品,拟统一改为“蛋白测定用对照品” 。但 是,由于二部品种与三部品种中蛋白测定用对照品的来源、适用范围等均不同,二部采用中检院对照:血 清白蛋白(牛) ;三部亦采用中检院对照:蛋白含量测定国家标准品;两者未统一。故拟订标准中暂未统称 为“蛋白测定用对照品” ,而是将其分别标示为“血清白蛋白(牛)对照品”和“蛋白含量测定国家标准品” , 从而供不同品种分别采用,以免混淆。建议中检院统一对照品后再作修订。 3 本法中国药典 2010 年版二部、三部均有收载,且与欧洲药典 8.0 版、英国药典 2013 年版与美国药典 36 版附录中收载的方法基本一致。不同点在于:(1)二部附录对供试品溶液并未做具体规定,三部附录给出了 供试品溶液的制备方法;(2)二部附录给出非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的测定,三部 附录采用钨酸沉淀法用于非氮的测定,采用三氯醋酸沉淀法直接测定供试品中蛋白氮的含量。二部、三部 所用这两种蛋白沉淀方法原理、操作、试液浓度均基本一致。经试验验证,整合为现有内容。

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