重组人干扰素_2b表达与分离纯化研究_姚文兵

中　国　药　科　大　学　学　报

Journal of China Phar maceutical University　2001,32(2):152～154

重组人干扰素α2b表达与分离纯化研究

姚文兵＊,许　敏,吴梧桐,沈子龙

(中国药科大学生物制药学院,南京210009)

摘　要　目的　从湿菌体中分离纯化重组人干扰素α2b。方法　采用(NH4)2SO4盐析-H3PO4处理-C M32离子交换层析-DE52离子交换层析-Sephadex G100凝胶层析等非亲和层析纯化方法。结果　回收率约为30%, HPLC检验纯度达96%,每毫克蛋白比活力达1.66×108IU。结论　分离纯化系统令人满意,回收率较高。

关键词　重组人干扰素α2b;分离;纯化;鉴定

中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:1000-5048(2001)02-0152-20

干扰素是人体细胞或动物细胞在诱生剂作用下产生的一种蛋白质,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。人干扰素α是目前抗病毒药物中临床效果显著者之一,广泛用于各种病毒感染,尤其是对乙型、丙型肝炎的治疗。其中α2b亚型与其他亚型相比,具有来自正常细胞并产生中和抗体的频率较低等特点。本文以协作单位构建的rHuIFNα2b 工程菌,对其培养并采用非亲和层析法对r HuI FNα2b进行了分离纯化,取得了较为满意的结果。

1　实验材料

1.1　rHuIFNα2b工程菌

由南京军事医学研究所张林元教授构建。

1.2　仪器

BS-100A自动部分收集器(上海县东风五金厂);8823A-紫外核酸蛋白检测仪(北京新技术应用研究所);TH-100梯度混合器(上海沪西仪器厂); HP1090高效液相色谱仪(惠普公司);冻干机(瑞典Pharmacia公司)。

1.3　试剂

阳离子交换纤维素(C M32)、阴离子交换纤维素(DE AE-52)、凝胶Sephadex G-100(华美生物工程公司);聚乙二醇20000(日本进口分装);SDS-PAGE 中分子量标准蛋白质(Promega进口分装);胰化蛋白胨、酵母粉(Oxoid进口分装);琼脂粉(日本进口分装);异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(BBI进口分装);牛血清白蛋白(Sigma进口分装);其余均为国产分析纯或生化试剂。

2　实验方法

2.1　种子液制备

将斜面上生长成熟的菌株接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基(每升含10g胰化蛋白胨、5g 酵母粉、5g氯化钠)中,37℃摇床200r/min培养至OD600约为1.0。

2.2　发酵培养

发酵培养液16L:蛋白胨160g,酵母粉80g, Na2HPO4·12H2O240g,KH2PO432g,NH4Cl12.8g, NaCl64g,MgSO43.2g,CaCl20.16g和少量防泡剂,在121℃灭菌20min后冷却至37℃,外加单独灭菌的9.6%葡萄糖1L,氨苄青霉素0.8g,接种种子培养液800ml进行发酵,保持溶氧100%。培养约7 h,离心收集菌体。

2.3　总蛋白含量的测定

以牛血清白蛋白为标准,按Bradford方法[1]测定总蛋白含量。

2.4　抗病毒活性测定

按文献方法[2]进行。

2.5　分离纯化方法

收集湿菌体,用含100mmol/L Na Cl,pH7.5、20 mmol/L磷酸缓冲液洗涤后悬浮于五倍体积的pH

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收稿日期　2000-10-20　＊通讯作者Tel:025-*******　E-mail:studies@https://www.wendangku.net/doc/ba4332262.html,

7.5,20m mol/L磷酸缓冲液中,冰浴超声破碎30 min,4℃1.5×104r/min离心10min,取上清液冰浴搅拌、缓慢加入碾细的硫酸铵固体至85%饱和度后,4℃放置23h,1.2×104r/min离心15min收集蛋白质沉淀,溶于适量去离子水后,用pH7.2、10 mmol/L磷酸缓冲液透析除硫酸铵。然后移置0.1 mol/L磷酸中,4℃透析1012h,改置pH7.2、30 mmol/L磷酸缓冲液中透析至中性,4℃下2×103r/ min离心除沉淀即为干扰素粗液。

将干扰素粗液先在起始缓冲液中平衡,然后上CM32阳离子交换纤维素柱,从0.1mol/L至0.3 mol/L AAB梯度洗脱,收集含r HuIFNα2b的洗脱成分。将上柱收集液用pH7.5、25m mol/l磷酸缓冲液平衡后上DE AE-52阴离子交换纤维素柱,从含0.1mol/L至0.3mol/L的Na Cl的pH7.5、25mmol/ L磷酸缓冲液梯度洗脱,收集含rHuIFNα2b的洗脱成分。再将上述收集液经聚乙二醇(MW=20000) 4℃浓缩,上Sephadex G-100凝胶层析柱,用pH7.

5、25mmol/L磷酸缓冲液洗脱,收集含rHuIFNα2b 的洗脱成分。

3　实验结果

3.1　rHuIFNα2b的分离纯化

分离纯化结果见表1。

Tab1.Purification of r HuIFNα2b

Procedure

Activity

(IU/ml,×108)

Specific

acti vity(IU/mg)

Purification

factor

R ecovery

(%)

Cell lysis3.931.04×1051100 Precipitation3.343.33×1053.285 Acidification2.471.40×1064.162 CM322.205.76×10610.356 DEAE-521.965.93×1073.250 Sephadex G-1001.181.66×1082.830

按照本实验设计的非亲和层析方法将r HuI FNα2b纯化了1210倍,比活力达1.66×108IU/ mg,总回收率为30%。高于文献报道的有关结果[3]。

3.2　纯化产物的鉴定

3.2.1　纯化产物的SDS-PAGE　结果见图1

。Fi g1.Non-reduced SDS-PA GE pattern of rHuIFNα2b

1.sample;

2.reference;

3.mid-range protein molecular weight markers[a. phosphorylase b(rabbit mus cl e)97400kDa;b.s erum album,bovine 66200kDa;c.oval bumin,chicken egg42700kDa;d.carbonic anhydrase, bovine erythrocytes31000kDa;e.lysozyme,chicken egg white14400kDa] 3.2.2　纯化产物的HPLC分析　结果见图2

。

Fig2.HPLC anal ys is of rHuIFNα2b

从电泳图谱看,经纯化后呈现单一而清晰的r HuIFNα2b条带。根据电泳迁移率推算,r HuI FNα2b 的分子量约为19kDa。对纯化的r HuI FNα2b进行凝胶过滤高效液相色谱分析鉴定,结果表明样品中含单一分子量的蛋白质,保留时间为11.33613.854 min的洗脱物占总洗脱物的96%。

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2期 姚文兵等:重组人干扰素α2b表达与分离纯化研究

4　讨　论

1)本实验中表达系统以天然活性的可溶性蛋白形式表达干扰素,避免了不溶性蛋白-包涵体的产生,也由此避免了包涵体溶解、复性过程中生物活性的丢失,为纯化过程中的高活性、高回收率以及高稳定性打下了基础。

2)文献报道的rHuIFNα2b的纯化方法主要有两大类,亲和层析法和非亲和层析法。亲和层析法得到的r HuI FNα2b的纯度一般达96%以上,回收率也一般达60%[4],但其缺点是亲和层析柱价格昂贵,使用次数有限;另一方面在纯化过程中柱体易从亲和层析上脱落,导致异源蛋白的污染,而非亲和层析方法则可避免上述缺点,从而大大降低成本。但存在的不足是蛋白回收率较低。本实验根据rHuIFNα2b的多种理化性质设计了一组新型层析柱系统,得到的回收率约30%,与其他文献报道的20%～25%的回收率相比[3]是较高的,但与亲和层析法相比回收率仍然偏低,如果能采用更为合适的纯化系统提高非亲和层析的回收率,则可使该法更为完善,这有待于进一步研究。

参考文献

[1]　F.奥斯伯.精编分子生物学实验指南[M].北京:科技出版

社,1998.

[2]　中国生物制品规程.一部.北京:中国人口出版社,1996.

[3]　周　圆,金冬雁,曾　庆等.重组人α2b型干扰素的纯化与鉴

定[J].生物工程学报,1994,10(1):61-65.

[4]　阎玉清,王晓沁,巫爱珍等.人干扰素α2b生产工艺的研究

[J].生物工程学报,1996,12(1):23-27.

Study on Isolation and Purification of Recombinant Human Interferonα2b

YAO Wen-Bing,XU Min,WU Wu-Tong,SHEN Zi-Long

College of Biophar maceutics,China Pharmaceutical U niversity,Nanjing210009,China

ABSTRAC T　AIM　The purpose is to isolate and purify recombinant human interferonα2b.METHODS　r HuI FNα2b expressed in engineering strain is isolated and purified by ultrasonic smash,ammonium sulfate precipita-tion,phosphoric acid acidification,cation exchange chromatography(CM-cellulose-32),anion exchange chromatograph (DE AE-cellulose-52)and gel ultrafiltration(Sephadex G-100).RESULTS　The recovery of r HuIFNα2b was30%. The purified protein with a specific activity of1.66×108IU/mg appears as a peak with purity of96%on the HPLC. KEY WOR DS　rHuIFNα2b;Isolation;Purification;Identify

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