酒曲中根霉菌的分离纯化

酒曲中根霉菌的分离纯化

一、实验目的：

1、了解酒曲的多种形态、其中的主要微生物及其在米酒发酵中的作用

2、根据根霉菌生长特性设计特有的分离及形态观察方法

二、实验原理：

酒曲中通常含有根霉、毛霉及酵母菌，还有一些特有的酶类，在米酒酿造中根霉菌通常起双边发酵的作用，因此根霉种类、发酵特性对于产品的特性品质具有非常重要的意义。

根霉在人工培养基或自然基物上生长时，菌丝体向空间延伸，遇光滑平面后营养菌丝体形成葡蔔枝，节间产生假根，假根处葡蔔枝上着生成群的孢子囊梗，柄顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊孢子。进行根霉菌分离时常利用此生长和形态特性判断是否根霉菌，再挑取单个孢子囊孢子进行纯化。

酒酿制作所用原料多为糥米，其主要成分为淀粉，经过蒸煮糊化后，利用酒曲中根霉菌较强的液化和糖化能力将其中的淀粉降解为不可酵糖和可酵糖，由淀粉降解为葡萄糖等还原糖的过程通常称为糖化，可酵糖供根霉菌本身的酒化酶及酵母菌利用产生酒精，不可酵糖则残留在发酵醪中形成米酒或酒酿特有的体和甜香味。

不同酒曲中的根霉菌菌种不同，发酵时间和其它环境条件要求也不同，通过对发酵过程中还原糖、酒精度等参数的测定，结合发酵物的感官评定，判断是否终止发酵。

三、试剂和器材：

酒曲，PDA培养基，糥米等

培养皿，载玻片，显微镜等

四、方法与步骤：

本实验直接用融化的PDA培养基稀释分离。这一方法对于在原材料中占较大数量比例的微生物尤为适用。

（1）酒精洗研钵、烧灼、杀菌。将0.5g酒曲放入钵中，加无菌水5ml，研磨成粉。

（2）琼脂培养基融化后，冷地至45℃（置45℃水溶中）。

（3）取其中的一支试管，用接种环挑取待分离材料少许。放入试管中已融化为液状的琼脂培养基中，塞回棉赛、双手摇搓度管，使接种物混匀。

（4）取第2根试管，用接种环从第一管中取1—2环接入第2管中，如上法混匀，再同法移入第3管中。

（5）依次把3支试管培养分别倾入3个已灭菌的培养皿中制成平板，置25~28的恒温箱内培养。

（6）培养17—18小时后，透过平皿对光观察，有无菌丝生长，用接种针挑挖菌丝少许。接于斜面培养基上，即可纯化。

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

变质米饭中霉菌的分离提纯

变质米饭中霉菌的分离提纯 【摘要】 粮食是最易被霉菌污染的一种食品原料，霉菌污染会造成粮食的霉烂变质，其产生的毒素会造成人畜中毒，而发霉变质的米饭中就有许多细菌，我们要从众多的细菌中提取我们实验所需要的一种霉菌，所以我们就要进行霉菌的分离与提纯。培养基是人工配制的适合微生物繁殖或积累代谢产物的营养物质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢物。本实验用的培养基是查氏培养基，它是培养霉菌用的，用以提供氮源、碳源及能源等。把从变质的霉菌中提取的较纯的霉菌接种到培养基中培养，进而再分离，最后提纯得到纯净单一的霉菌。然后将得到的霉菌做一些相对应的染色实验，再次验证霉菌的性质。 【关键字】 米饭分离提纯鉴定 霉菌(mold)是能引起物质霉腐的丝状真菌(Mycelial fungus)的统称，它不是分类学上的名词，而是真菌(Fungus)的一部分。凡是生长在培养基上成绒毛状或棉絮状菌丝体的菌，都称之为真菌。霉菌分别属于植物分类学的菌类植物的子囊菌纲(一、comycetes),藻状菌纲(Phycomcetes)和半知菌纲(Fungi imperfecti)。 霉菌在自然界中分布极为广泛，土壤、空气、水和生物体内外到处都有，与人们日常生活关系密切。霉菌除应用于传统的酿酒、制酱和制作其它发酵食品外，在农业、纺织、食品、医药和皮革等方面都起着极为重要的作用。但是，不少霉菌(黄曲霉、灰绿曲霉、绿青霉等)能在食品、谷物上生长并产生真菌毒素。粮食中常常生长的主要是寄生性和腐生性霉菌，其种类约有200多种。 发霉变质的米饭中有许多细菌，要想混杂的细菌群体中获得只含有某一或某一株细菌，就得进行微生物的分离与纯化。常用方法有：简单单细胞挑取法及平板分离法。本实验运用平板分离法。它是根据所分离的微生物的生长条件加入某种物质或选择某一温度、酸碱度等，进行培养，淘汰一些不需要的微生物，从而得到所需的微生物。 1.实验材料和方法 1.1材料与仪器

蛋白质分离与纯化教学设计课题

蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点

【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。

米曲霉的介绍

1.菌种特点： 米曲霉( 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉 米曲霉是一类产的，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、、、等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链降解为糊精及各种低分子糖类，如、等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为、及各种，而且可以使辅料中、等难吸收的物质，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于、、生产曲酸、等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产不能表达的真核生物活性蛋白的。米曲霉所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病

细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 一、实验目的 1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。 要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度 /℃培养时间/d 土样细菌稀释分离10-5，10-6， 10-7 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 土样放线菌稀释分离10-3，10-4， 10-5 高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3， 10-4 马丁氏琼脂28～30 3～5 面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5， 10-6 马铃薯葡萄糖28～30 2～3 细菌分离平 板 细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 三、实验材料 1. 菌源土样 2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。 4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。 4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 （一）系列稀释平板法 1. 取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

常见霉菌的代表属

常见霉菌的代表属 （一）根霉（Rhizopus) 分类：与毛霉同属接合菌纲毛霉目。 分布:分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。 形态特征： 很多特征与毛霉相似，菌丝也为白色、无隔多核的单细胞真菌，多呈絮状。——与毛霉主要区别在于根霉有假根和匍匐枝，与假根相对处向上生出孢囊梗。孢子囊梗与囊轴相连处有囊托，无囊领。 繁殖：无性繁殖产孢囊孢子，有性繁殖产生接合孢子。根霉的孢子囊和孢囊孢子多为黑色或褐色，有的颜色较浅。 代表种：米根霉（R.oryzae) 黑根霉(R.nigrican)等。 应用：①根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。 ②有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。③有的也可用于甾体转化。 （二）毛霉（Mucor) 分类地位 分布 形态特征 繁殖方式 代表种—总状毛霉、高大毛霉、 鲁氏毛霉、梨形毛霉 应用 在分类系统中属于接合菌纲、毛霉目。 分布:广泛分布于土壤、空气中，也常见于水果、蔬菜、各类淀粉食物、谷物上，引起霉腐变质。 形态特征：菌丝发达、繁密；白色无隔多核，为单细胞真菌。 形态特征：毛霉的孢子囊梗有单生的，也有分枝的。 分枝有单轴、假轴两种类型。 毛霉的菌丝多为白色，孢子囊黑色或褐色，孢子囊孢子大部分无色或浅兰色，因种而异。繁殖：可形成孢囊孢子、厚垣孢子、接合孢子。 无性繁殖： 孢子囊梗直接从菌丝体上发出，单生或分枝，顶端产生膨大的孢子囊，孢子囊为球形，囊壁上常有针状的草酸钙结晶。在囊轴与孢子囊梗相连处无囊托，但孢子囊壁破裂时，留有残迹—囊领。 经济价值：蛋白酶、淀粉酶、 有机酸、甾体转化 毛霉的应用：

霉菌毒素 常见种类介绍

常见种类介绍 据统计，己知的霉菌毒素有300多种，常见的毒素有： 黄曲霉毒素（Aflatoxin）玉米赤霉烯酮/F2毒素（ZEN/ZON, Zearalenone） 赭曲毒素（Ochratoxin）T2毒素（Trichothecenes） 呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，deoxynivalenol） 伏马毒素/烟曲霉毒素（Fumonisins，包括伏马毒素B1、B2、B3）黄曲霉毒素（Aflatoxin） 特征：1.主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生。 2.由约20种结构相似的化学物质组成，其中以B1、B2、G1、G2及M1最为重要。 3.国家法规规定饲料中这种毒素的含量不得超过20ppb. 4.敏感性：猪>牛>鸭>鹅>鸡 黄曲霉素对猪的影响： 1.采食量降低或拒食。 2.生长迟滞，饲料报酬变差。 3.免疫功能降低。 4.造成肠道及肾脏出血。 5.肝胆肿大、受损和癌变。 6.影响生殖系统，胚胎坏死，胎儿畸形，盆血。 7.母猪泌乳量下降。乳汁中因含有黄曲霉毒素，从而对哺乳小猪产生影响。 黄曲霉毒素对家禽的影响： 1.黄曲霉毒素对所有品种的家禽都有影响。 2.导致肠道、皮肤出血。

3.肝胆肿大、受损和癌变。 4.高水平摄入时可导致死亡。 5.生长不良，产蛋性能变差，蛋壳品质恶化，蛋重减轻。 6.抗病能力、抗应激能力和抗挫伤能力降低。 7.影响鸡蛋品质，现已发现在蛋黄中有黄曲霉毒素的代谢产物出现。 8.低水平（低于20ppb）仍可产生不良影响。 黄曲霉毒素对其它动物的影响： 1.降低生长速度和饲料报酬。 2.奶牛产奶量下降，另外黄曲霉毒素可以将黄曲霉毒素M1的形态分泌到牛奶中。 3.可引起犊牛直肠痉挛、脱肛。 4.高水平黄曲霉毒素也可引起成年牛肝脏的损害，抑制免疫功能，导致疾病爆发。 5.致畸、致癌。 6.影响饲料适口性，降低动物免疫力。 玉米赤霉烯酮（ZEN） 特征：1.主要由粉红色镰刀菌产生。 2.主要来源是玉米，热处理不能破坏此毒素。 3.敏感性：猪>>牛、畜类>禽类 危害： 玉米赤霉烯酮是一种具有雌激素类物质活性的毒素，主要危害种用畜禽，其中青年母猪对之最为敏感。 ◆1～5ppm：后备母猪阴部红肿，假发情。 ◆>3ppm: 母猪和后备母猪不发情。 ◆10ppm：保育及育肥猪增重减缓，仔猪脱肛，八字腿。 ◆25ppm：母猪偶发性不孕。

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

酵母菌的分离纯化

酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN

酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分

土壤中分离霉菌

土壤中分离霉菌 培养基（ms加乳酸和抑菌物质）1ml量 土豆200g蔗糖30g 琼脂20g 大量元素母液50ml铁盐、微量元素、有机成分母液各10ml 乳酸5g氯霉素0.1g ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1、实验器材的准备与灭菌 *用报纸包扎好所需的培养皿等工具进行灭菌 *加热至160℃～170℃维持2小时 *用高压灭菌锅制备无菌水 *准备好取土的工具及酒精 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2、药品的称量 *用分析天平准确称量元素和药品 *称量后溶解配制成母液 *在进行少量药品的称量 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3、其他药品的称量 * 用天平称取土豆100g *蔗糖30g *琼脂20g *放入抑菌物质0.1g *乳酸5g ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

蛋白质分离与纯化技术

化工学院生物工程一班胡冠南 3010207234 蛋白质分离与纯化技术 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。所以研究蛋白质的结构与功能是研究生物科学的基础。蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。然而该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。所以对该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。 一．蛋白质分离的准备 从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。如果不能满足这一条件，蛋白将很快失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。在不同的实验中所通到的困难各不相同，有的困难是如何抵抗外源性蛋白酶的作用而维持蛋白质的稳定，在有些实验中的困难是如何维持酶的活性。在不同的实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持—定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。pH和pKa是描述缓冲液的两个重要概念。pH值是指溶液中氢离子浓度的负对数，pH＝-log(H+)。 pKa值是溶液中酸解离常数的负对数值。溶液的pH值与pKa值越接近表明溶液的缓冲能力越强，离pKa值越远则缓冲能力越弱。 表1 常用缓冲液的pKa值

黑曲霉介绍以及使用说明

黑曲霉详细说明 产品英文名称：Aspergillu s niger CAS编 号： 6826- 42-2 别名： 山东黑曲霉孢子粉|培养物载体销售|发酵菌种厂家|高孢 子数菌种供应商|饲料发酵菌种报价 分子式：c11h1204 EINECS 编号： 6826- 42-2 有效物质 含量： 75 % 品牌：康丰源产品规 格： 500克 执行标 准： QS9001：2008 黑曲霉孢子粉 一、黑曲霉在发酵饲料方面的应用： 《2014年饲料添加剂目录》有关于黑曲霉可以直接添加使用的决定。 1、黑曲霉能够提高发酵后饲料的营养水平和消化吸收率。本品所含的微生物能分解饲料中的大分子糖类为单糖和寡糖,并生成多种有机酸、维生素、生物酶、未知生长因子，大大提高了发酵饲料的营养水平和消化吸收率； 2、使饲料脱毒。通过微生物自身的生命活动，使饲料内所含的有毒有害物质被降解而脱除，从而大大提高了饲料的安全性； 3、提高动物的抗病力。本品所含的微生物直接参与动物肠道的屏障作用，补充动物肠道有益微生物的数量，通过生物竞争机制阻止病原微生物的定植和生长繁殖.恢复和维护动物肠道的微生态平衡，从而提高动物的免疫力和抗病能力； 4、提高饲料的适口性，显著增加食欲。在饲料中添加本产品可以提高饲料利用率、提高动物的生产性能，降低生产成本，改善养殖环境。 黑曲霉在发酵剂方面还能发酵能量饲料、蛋白饲料、粗饲料等所有种类饲料。发酵的饲料既适用于猪、牛、羊等家畜动物，又适用于鸡、鸭、鹅等家禽动物，而且适用于鱼虾水产、黄粉虫昆虫等各种动物。发酵饲料能使饲料解毒脱毒，大大提高饲料的安全性，而且在发酵的过程中会产生淡淡的香味，从而增加了动物的适口性；发酵过程中还能生成多种有机酸、维生素、生物酶、氨基酸及其他多种未知生长因子，大大提高了发酵饲料的营养水平和消化利用率；提高动物的抵抗力，降低饲料成本。 二、黑曲霉孢子粉使用说明： 《2014年饲料添加剂目录》有关于黑曲霉可以直接添加使用的决定。 产品优势：1.孢子含量高，便于产品的存放 2.产品有效菌对环境的适应性强 3.孢子的发酵再生能力高 产品用途：1.用于生物肥料秸秆腐熟剂等发酵时添加； 2.用于复合微生物肥料接种剂； 3.用于禽畜的粪便、有机垃圾发酵剂； 4.用于动物饲料发酵时添加； 产品配方：麦片、豆皮、微量元素、纯种米曲霉/黑曲霉菌株等。 使用量：万分之三到万分之五，即每吨加300克——500克 （根据实际菌孢子量和生产工艺的要求添加）。

蛋白表达、分离和纯化

蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源：易生物实验浏览次数：2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词：蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MC AC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材

一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库：.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库：.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.

酒曲中根霉菌的分离纯化

酒曲中根霉菌的分离纯化 一、实验目的： 1、了解酒曲的多种形态、其中的主要微生物及其在米酒发酵中的作用 2、根据根霉菌生长特性设计特有的分离及形态观察方法 3、掌握倒平板的方法和分离纯化微生物的基本操作 二、实验原理： 酒曲中通常含有根霉、毛霉及酵母菌，还有一些特有的酶类，在米酒酿造中根霉菌通常起双边发酵的作用，因此根霉种类、发酵特性对于产品的特性品质具有非常重要的意义。 根霉在人工培养基或自然基物上生长时，菌丝体向空间延伸，遇光滑平面后营养菌丝体形成葡蔔枝，节间产生假根，假根处葡蔔枝上着生成群的孢子囊梗，柄顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊孢子。进行根霉菌分离时常利用此生长和形态特性判断是否根霉菌，再挑取单个孢子囊孢子进行纯化。 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）被广泛用于培养霉菌和酵母菌，它是半合成培养基。 三、试剂和器材： 培养基制备材料：马铃薯、葡萄糖、琼脂 溶液和试剂：无菌水、乳酸石炭酸棉染液、 仪器和其他用品；酒曲，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌培养皿，载玻片，吸管、接种环、无菌玻璃涂棒、显微镜等 四、方法与步骤： 1.培养基的制备 培养基的配方如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、水1000ml、 PH自然 （1）培养基制备：将马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤备用。称取加入20g葡萄糖和4g琼脂与适量水放于三角烧瓶中加热溶解，待融化后不足水至1000ml并加入马铃薯充分搅匀。 （2）分装：按实验要求取适量配制的培养基分装在试管内用于纯化培养。由于是固体培养基，装量宜不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。 （3）加塞：培养基分装后，在试管口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养

米曲霉的介绍

WOIRD格式 1.菌种特点： 米曲霉(Asp.oryzae)属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色， 后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为 疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球 形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也 有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形 或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真 菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色， 背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食 品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业 产品霉变。米曲霉(Aspergillusoryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶, 其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、 植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子 糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为 蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解， 提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵 工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真 核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵 专业资料整理

饲料中霉菌总数测定方法

霉菌总数检测操作规程 1 原理 根据霉菌生理特性，选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的培养基，采用平板计数法测定霉菌总数。 2 试剂与仪器 2.1 所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器 2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 2.3 所用试剂和培养基 高盐察氏培养基 取高盐察氏培养基109g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，115℃高压灭菌30 min，备用。 3、操作步骤 3.1配制0.85%生理盐水 称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。 3.2 锥形瓶加入生理盐水90mL，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）。 3.3 将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺、带6颗玻璃珠具塞试管，121℃灭菌30min。（注意计算数量） 3.4 枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。（1-3步需提前一天完成） 3.5 对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。 3.6 吸取1:10稀释液10mL注入带玻璃珠的试管，置微型混合器上混合3min。 3.7 用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。 3.8 另取一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一

霉菌鉴定结果

霉菌的鉴定方法参照微生物学实验手册[118]。 （1）菌落特征的鉴定观察： 观察菌落形状、特征，菌落颜色，培养基颜色是否有变化等。 （2）菌株特征及孢子形态观察： 挑取菌株的少量菌丝于载玻片上，显微镜下观察菌丝的颜色、特点，有无特殊构造，成熟子实体的颜色、形态等。 （3）霉菌的糖化能力测定实验： 配制含有4%淀粉的溶液100ml，加入一定体积菌液并发酵24H后，测定溶液中还原糖的含量，采用DNS法测定溶液中还原糖的含量。 霉菌的糖化能力表示为F。 F=残糖含量/4%淀粉 采用（DNS）3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量。 (1) 原理 碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液与还原糖溶液共热被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540 nm 波长下测定棕红色物质的吸光度。 (2) 1mg/ ml葡萄糖标准液 准确称取100 mg分析纯葡萄糖（预先在80 ℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100 ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 (3) 3,5-二硝基水杨酸试剂 将6.3 g 3,5-二硝基水杨酸和262 ml 2mol/L NaOH溶液，加到500 ml含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。 (4) 制作葡萄糖标准曲线 取7支25 ml刻度试管，编号0～6，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml 葡萄糖标准溶液于7支试管中，并以蒸馏水补至2.0 ml，然后各加入DNS试剂1.5 ml。摇匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25 ml刻度处，颠倒混匀。在540 nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线(图3-1)。得到回归方程y＝49.665x+1.3421，其相关系数R2＝0.9951。 (5) 还原糖测定 取上清液0.2ml到试管中，再加入3,5-二硝基水杨酸1.5ml、蒸馏水1.8ml，摇匀后，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容到25ml，混匀后，540nm波长下比色，记录吸光值。通过标准曲线查

霉菌分类及生长

霉菌分类及生长条件 霉菌是一种多细胞微生物，广泛存在于自然界中，在微生物学上属于真菌。其通过孢子的形式繁衍。霉菌孢子普遍存在于土壤和一些腐烂植物中，经由空气、水及昆虫传播到植物上，一旦孢子接触到破裂的种子，就会迅速发生霉变现象。 霉菌按其生活习性分为田间霉菌和仓储霉菌两种。田间霉菌是指青霉菌属、麦角菌属和镰孢菌属（梭霉菌属），此类霉菌属野外菌株，通常谷物在未采收前就已感染，最适生长温度为5℃~25℃，该类霉菌在低温环境中也会繁殖，阴冷潮湿的天气更易于这些霉菌生长。仓储霉菌主要是指储存的饲料或原料，在适宜的温度、湿度等条件下产生的霉菌，以曲霉菌属为主，该类霉菌最适宜的生长温度为25℃~30℃，相对湿度为80％~90％。但是，田间霉菌若在适宜条件下、在仓储环境中也会快速繁殖，造成严重污染。 霉菌生长条件四要素：碳水化合物（如玉米等谷物、饲料）、充足的水分（湿度在85%以上）、适宜的温度（12℃~25℃）、氧气。 霉菌毒素产生、分类及危害 霉菌毒素是谷物或者饲料中的霉菌在适宜的条件下，在农田里、在收获时、在储存或加工过程中生长产生的、有毒的二次代谢产物。 迄今为止已经分离和鉴定出来的霉菌毒素有300多种。一般而言，霉菌毒素主要是由4种霉菌属所产生：曲霉菌属（主要分泌黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等）、青霉菌属（主要分泌橘霉素等）、麦角菌属（主要分泌麦角毒素）、镰孢菌属（主要分泌玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T －2毒素、串珠镰孢菌毒素），也是最见的几种霉菌毒素。不同霉菌毒素的危害能对动物产生危害的、最多见到的霉菌毒素多达20多种，分别亲嗜一种或多种组织与器官，并且多能对动物免疫系统产生损害，尤其是黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，造成免疫复合性损害，这种病理作用一方面与这些霉菌毒素的免疫毒理有关，也与它们泛嗜性的病理损害有关。霉菌毒素中毒在猪病发生学中的地位，全世界的谷物有25%以上受到霉菌毒素污染，我国的污染更为严重，中国农科院畜牧所的一项调查检测表明，配合饲料中不同程度霉菌毒素的污染高达80%以上。这说明生猪中少有不受霉菌毒素危害的，霉菌毒素中毒的患病率（包括显性患病率和隐性患病率之和）远远高于任何一种侵袭性疾病。 现代研究表明，饲料霉菌毒素无论是在许多传染病的发生上还是非传染病的发生上经常扮演“始作俑者”的角色。在饲料霉菌毒素中毒的基础上发生猪瘟（CSF）、猪伪狂犬病（PR）、蓝耳病（PRRS）、圆环病毒病（PCVⅠ）已是常见之事。在霉饲料中毒的基础上发生的肝肾

曲霉菌的鉴定与应用

曲霉菌的鉴定与应用 发表时间：2010-07-15T14:38:22.890Z 来源：《中外健康文摘》2010年第10期供稿作者：柴淼潘宇罗晓慧袁国明[导读] 这种营养菌丝与组织结合非常牢固，因此在留取标本时，一定要嘱咐病人要用力咳痰并要咳到带盖的容器中。柴淼潘宇罗晓慧袁国明（黑龙江省哈尔滨市第一医院黑龙江哈尔滨 150000） 【中图分类号】R563 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)10-0046-02 曲霉菌以腐物寄生的形式广泛存在于自然界中，为条件致病菌。引起人类感染的约20多种，常见的有8种。烟曲霉菌、黄曲霉菌是引起肺曲霉病最重要的两个菌种。近几年，由于广谱抗生素的广泛使用及联合使用是造成肺曲霉病的重要原因之一。特别是2008年以来，肺曲霉病的发病率突然在全国范围内迅速上升。临床上治疗时机的延误是造成死亡的主要原因。对于曲霉病的诊断，找到病原体为金标准。检验科微生物工作者如何配合临床应对这种突如其来的事件，迅速制定和建立实验室的快速检测方法成为当务之急。多年培养出的应急意识及工作经验，使我们在短时间内迅速制定出了曲霉菌实验室快速鉴定的最有效、最可靠的检测方法。 1 方法 1.1标本留取真菌的菌丝分为两种：一种为气中菌丝，另一种叫营养菌丝。这种营养菌丝与组织结合非常牢固，因此在留取标本时，一定要嘱咐病人要用力咳痰并要咳到带盖的容器中。 1.2培养曲霉菌的培养一般接种在沙保弱培养基中，但实践经验告诉我们，接种在血平板中最好。因为在血平板中培养18～24小时后生长出的菌落会产生特殊的颜色，它是鉴别曲霉菌的重要特征之一。如，曲霉菌的菌落为灰绿色，黄曲霉菌的菌落呈棕黄色，菌落的背面还可见到皱褶。 1.3涂片由于营养菌丝与组织粘膜结合牢固，直接留取痰液涂片检查很难查到。即使找到了也只是一些子囊及壳细胞，而被误认为是酵母菌。这也是造成临床治疗延误的重要原因，因此涂片检查应在培养后进行，挑取菌落时一定是刮取而不是沾取，染色后应先用低倍镜找视野（即蒲公英花样结构），再换油镜观察。各种曲霉菌有它特有的形态特点。 正确留取标本是曲霉菌能够检出的前提条件，培养选择血平板是24小时内出现典型曲霉菌菌落的保障，镜下查到完整曲霉菌结构是一步鉴定到种的关键。掌握了这三个方面，实验室查到病原体就有了可靠的依据。 2 结论 为什么肺曲霉菌病比以往以8倍的速度上升，最重要的原因就是抗生素的广泛使用和联合应用后细菌，甚至是正常菌群被抑制或杀死使真菌得以生长繁殖导致菌群失调，造成真菌感染。许多抗生素对人体中的白细胞有抑制和杀灭作用。中性粒细胞可组织曲霉菌菌丝的形成，单核细胞则主要影响分生孢子，中性粒细胞和吞噬细胞功能的降低及数量的减少，加大了曲霉菌感染的风险。曲霉菌的检测以找到病原体为金标准，美国国家免疫变态感染疾病学提供IPA诊断标准是组织病理学检查检到曲霉菌菌丝。侵袭性操作，如：纤支镜、经皮肺穿、开胸手术等方法，所取组织培养阳性。国内目前实验室对曲霉菌检测的标准没有报道，临床发表文章普遍认为曲霉菌的分离难度大，培养时间长（需一周）。PCR检测为曲霉菌的最佳选择，实际上这种方法是不值得提倡的，其原因是曲霉菌广泛分布在自然界中，空气中也存在。实验室不是在真空中，假阳性不可避免。PCR对曲霉菌基因片段的扩增加大了对环境污染的危险性。由于过去IPA的诊断较晚，治疗困难，病死率极高，未经治疗几乎100%死亡，仅部分免疫损害因素消除的患者可以存活。在肝脏、骨髓移植和严重的白细胞减少的患者中，至临床出现症状到死亡一般仅10～14天，故治疗成功的关键在于早期诊断，尽早应用合理的抗真菌药物。 作为微生物室工作者，今后的工作会更复杂、更艰难，应对更艰巨的挑战是我们应该承担的责任和义务。