Primer5设计引物------图文并茂一步步教你

1、打开后的界面如图。

2、点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图

3、输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

4、此主题相关图片如下：选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏此主题相关图片如下：选中OK键，

5、分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶此主题相关图片如下：

6、选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。此主题相关图片如下：

7、软件默认引物为二五个碱基此主题相关图片如下

8、可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可此主题相关图片如下：

9、在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III 酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。此主题相关图片如下：

10、选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。

11、从3端删除7－9个碱基同正义链。此主题相关图片如下：

12、将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。完成后点analyze，认为可以后点OK。此主题相关图片如下：

13、最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。GC含量不应超过60％此主题相关图片如下：

14、该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印此主题相关图片如下：

15、如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示，同上输入目的基因片段，选SEARCH图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere 中的参数可以不选，为默认设置。点OK。此主题相关图片如下：

16、显示满足设计参数的候选结果，点OK.此主题相关图片如下：

17、点SENES选择正义链，RATING表示引物评分，最好选评分高的。此主题相关图片如下：

18、点ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。整个一队引物评价同目的基因克隆的引物设计相同此主题相关图片如下：

手把手教你结构设计(入门到熟练)

手把手教你结构设计（入门到熟练） 1.结构设计的过程（了解） 本文是送给刚接触结构设计及希望从事结构设计的新手的，其目的是使新手们对结构设计的过程以及结构设计所包括的内容有一个大致的了解，请前辈们不要见笑了，新人们有什么问题也可以在贴中提出来，大家共同讨论，共同进步。 1，看懂建筑图 结构设计，就是对建筑物的结构构造进行设计，首先当然要有建筑施工图，还要能真正看懂建筑施工图，了解建筑师的设计意图以及建筑各部分的功能及做法，建筑物是一个复杂物体，所涉及的面也很广，所以在看建筑图的同时，作为一个结构师，需要和建筑，水电，暖通空调，勘察等各专业进行咨询了解各专业的各项指标。在看懂建筑图后，作为一个结构师，这个时候心里应该对整个结构的选型及基本框架有了一个大致的思路了. 2，建模(以框架结构为例)（关键） 当结构师对整个建筑有了一定的了解后，可以考虑建模了，建模就是利用软件，把心中对建筑物的构思在电脑上再现出来，然后再利用软件的计算功能进行适当的调整，使之符合现行规范以及满足各方面的需要.现在进行结构设计的软件很多，常用的有PKPM，广厦，TBSA等，大致都差不多。这里不对软件的具体操作做过多的描述，有兴趣的可以看看，每个软件的操作说明书（好厚好厚的，买起来会破产）。每个软件都差不多，首先要建轴网，这个简单，反正建筑已经把轴网定好了，输进去就行了，然后就是定柱截面及布置柱子。柱截面的大小的确定需要一定的经验，作为新手，刚开始无法确定也没什么，随便定一个，慢慢再调整也行。柱子布置也需要结构师对整个建筑的受力合理性有一定的结构理念，柱子布置的合理性对整个建筑的安全与否以及造价的高低起决定性作用...不过建筑师在建筑图中基本已经布好了柱网，作为结构师只需要对布好的柱网进行研究其是否合理.适当的时候需要建议建筑更改柱网.当布好了柱网以后就是梁截面以及主次梁的布置.梁截面相对容易确定一点，主梁按1/8~1/12跨度考虑，次梁可以相对取大一点主次梁的高度要有一定的差别，这个规范上都有要求。而主次梁的布置就是一门学问，这也是一个涉及安全及造价的一个大的方面.总的原则的要求传力明确,次梁传到主梁，主梁传到柱.力求使各部分受力均匀。还有，根据建筑物各部分功能的不同，考虑梁布置及梁高的确定（比如住宅，在房中间做一道梁，本来层就只有3米，一道梁去掉几十公分，那业主不骂人才怪...）。梁布完后，基本上板也就被划分出来了，当然悬挑板什么的现在还没有，需要以后再加上...,梁板柱布置完后就要输入基本的参数啦，比如混凝土强度啊，每一标准层的层高啊，板厚啊，保护层啊，这个每个软件设置的都不同，但输入原则是严格按规范执行.当整个三维线框构架完成，就需要加入荷载及设置各种参数了，比如板厚啊，板的受力方式啊，悬挑板的位置及荷载啊什么的，这时候模形也可以讲基本完成了，生成三维线框看看效果吧，可以很形象的表现出原来在结构师脑中那个虚构的框架. 2.计算 计算过程就是软件对结构师所建模型进行导荷及配筋的过程，在计算的时候我们需要根据实际情况调整软件的各种参数，以符合实际情况及安全保证,如果先前所建模型不满足要求，就可以通过计算出的各种图形看出，结构师可以通过对计算出的受力图，内力图，弯矩图等等对电算结果进行分析，找出模型中的不足并加以调整，反复至电算结果满足要求为止，这时模型也就完全的确定了.然后再根据电算结果生成施工图，导出到CAD中修改就行了，通常电算的只是上部结构，也就是梁板柱的施工图，基础通常需要手算，手工画图,现在通常采用平面法出图了，也大大简化了图纸有利于施工. 3.绘图 当然，软件导出的图纸是不能够指导施工的,需要结构师根据现行制图标准进行修改，这就看每个人的绘图功底了，施工图是工程师的语言，要想让别人了解自己的设计，就需要更为详细的说明，出图前结构师要确定，别人根据施工图能够完整的将整个建筑物再现于实际中，这是个复杂的过程，需要仔细再仔细，认真再认真。结构师在绘图时还需要针对电算的配筋及截面大小进一步的确定，适当加强薄弱环节，使施工图更符合实际情况，毕竟模型不能完完全全与实际相符.最后还需要根据现行各种规范对施工图的每一个细节进行核对，宗旨就是完全符合规范，结构设计本就是一个规范化的事情.我们的设计依据就是那几十本规范，如果施工图中有不符合规范要求的地方，那发生事故，设计者要负完全责任的......总的来讲，结构施工图包括设计总说明，基础平面布置及基础大样图，如果是桩基础就还有桩位图，柱网布置及柱平面法大样图，每层的梁平法配筋图，每层板配筋图，层面梁板的配筋图，楼梯大样图等，其中根据建筑复杂程度，有几个到几十个结点大样图. 4.校对审核出图 当然，一个人做如此复杂的事情往往还是会出错，也对安全不利，所以结构师在完成施工图后，需要一个校对人对整个施工图进行仔细的校对工作，校对通常比较仔细资格也比较老，水平也比较高，设计中的问题多是校对发现的，校对出了问题后返回设计者修改。修改完毕交总工审

引物设计原则(必看)

mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能

利用INTERNET设计PCR引物举例

利用IN T ERN ET设计PCR引物举例 周咏东 华西医科大学附属第一医院眼科(610041) 国际互联网上信息资源十分丰富,给人们的生活、学习和工作带来了极大的方便。过去,需要设计PCR引物时,研究人员需要查阅大量文献,有时因无法查到原文,或无相关报道,会使研究工作一开始就不能顺利开展。笔者在科研中发现,有许多科研人员未能掌握I NT ERN ET上有关引物设计的共享资源,故结合实际应用经验予以介绍。使你的科研工作如虎添翼。 IN T ER NET上设计引物,分为两个步骤: 1　检索待扩增基因的DN A序列 首先接入IN T ERN ET,然后键入网址:w w w.ncbi.nlm. nih.g ov便进入了美国国家医学图书馆的生物技术信息中心的主页。在“Sear ch”右边的检索框内选择“G enBank”,然后在“fo r”右边的框内键入你检索的基因序列名,如“human Bcl-2cDN A sequence”,点击“Go”,检索就开始了。 出现的下一网页是“Cur rent Q uery”即告诉你检索出相关文献的数目。如你对结果不满意,该网页下半部分有“A dd T er m(s)to Q uer y”和“M o dify Cur rent Q uer y”两栏供你重新检索;如你对检检索结果满意,即可点击“Retr iev e XX”(X X 为查出的文献数)。接着即显示了刚才调出的文献名。你可选择一篇最符合的,然后将“Display”键右边的框内选择为FA ST A r epor t”(这是下一步设计引物所规定的),点击“D is-play”健,你要的序列就显示出来了。 最后,将这段序列全选,在“编辑”栏中点击“复制”,将此窗口最小化,重开窗口,进入下一步骤。 2　引物的设计 在新开的窗口中,健入网址w ww.g eno me.w https://www.wendangku.net/doc/b86178601.html, 你即进入了“Whitehead Instit ut e for Bio medical R eser ch/ M IT Cent er for Genome Resear ch”的主页。在主页中先找到“G enome Center Softw ar e”标题,在其中的标题为“Ex peri-mental W eb-based Softw ar e”中,点击“W WW.P rimer P ick-ing(Pr imer3)”,此项,我们将用此网上软件设计引物。 网页上显示为“P r imer3o ld V ersio n”及“Click Her e T o T r y N ex t Ver sio n”,这两个版本大同小异,随便用哪一个。关键是在“Paste sour ce sequence belo w”文字下方的大空框内,粘贴上第一步查出的那段序列。然后根据自己的要求,对列出的各项引物设计指标作相应变动,否则为默认。确认指标设定完毕后,点击粘贴序列框下方的“Pick Pr imer s”键,你即得到了所需的引物,显示在“P rimer3O utput”网页上,共有5对,你可按需任选其一。 通过上述两个步骤,你如愿以偿,是不是很简便、快捷?快动手试一试吧!。 编辑　陈小娜 2.1.2非标准数字影像设备上网直接接入模块　该模块用于解决一部分带有数字网络接口,但又仅符合生产厂家内部标准的设备上网问题。以往,生产数字影像设备的众多厂家由于没有统一的上网标准,使医院相当一部分数字影像设备难以上网,因此,该模块须克服许多困难和问题,在实践中逐渐地、局部性地予以实现和完善。 2.1.3　非标准数字影像设备上网间接接入模块　此模块专用于对医院过去引进的,生产厂商根本就没提供上网接口的一部分早期非标准数字影像设备,通过对影像重新A/D的方法让它们间接上网。 2.2　数字影像会诊中心模块　建立医院数字影像局域网与PA CS系统,其核心意义在于能够方便地汇集各种各类检查的数字影像,提供给专家进行综合会诊。因此,在PA CS局域网基础上,建立硬件设施过硬、图像显示清晰、显示技术优良,能同时方便地显示各种数字诊断影像的数字化影像会诊中心,在很大程度上将代表整个项目的临床诊断价值与水平。2.3　数字影像局域网网络工程模块　网络工程模块包括:网络服务器、数据存储与管理软件系统模式、网络布局与工作站分布、网络构架与布线等等。此部分模块归属于计算机Intr anet信息网络工程范畴,对当前医院影像局域网In-tr anet的软硬件性能指标及设备系统的可扩展性具有决定性的作用。 2.4　各工程模块的信息流与局域网系统P ACS软件模块　如果说硬件是骨架,软件就是血液。建立了良好的硬件平台以后,必须要建立合理的网络信息流向和配以优良的PA CS 软件系统,才能保证整个系统能够正常运行。因此,这是建立数字影像会诊中心时,必须很好建立的又一个重要模块。 总之,医院建立数字影像局域网,并逐步过度到最终院际广域网连接已是二十一世纪医院计算机网络发展的必然趋势。我们必须紧跟这一时代发展潮流,扎扎实实从手上工作做起,理清各个系统模块关系,做好各方面技术储备,为医院建立数字影像局域网及P A CS系统作好准备。 编辑　杨立新 142?医学信息2001年3月第14卷第3期 Internet应用●

引物设计大全

引物设计和Primer-BLAST的应用 Lv Peng 2015.11.18

CONTENT 1.PCR-引物设计目的 2.引物设计原则 3.设计引物软件 4.在线设计工具 5.probeBase 简介

1.1PCR（Polymerase Chain Reaction） 聚合酶链式反应 1971 Khorana 提出设想 1985 Kary Mullis 发明了PCR 1986年5月 Mullis在冷 泉港实验室 做专题报告 冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory，缩写CSHL），又译为科尔德斯普林实验室。

几不同的PCR技术 1.扩增已知序列两侧DNA的PCR：反向PCR（Inverse PCR，IPCR）、锚定PCR（anchored PCR）、RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）、连接介导的PCR（ligation-mediated PCR，LM-PCR）； 2.检测有限量稀有靶序列，即一对引物扩增产物不足以以通过凝胶电泳观察到的时：巢式PCR（nested PCR）； 3.快速、灵敏、特异而准确定量的PCR：实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR，RQ-PCR）。

特性 优化 碱基组成 （G+C ）含量应在40%-60%，4种碱基要分布均匀；长度 一般为18-27个核苷酸长度。上下游引物长度差别不能大于3bp ；重复和自身互补序列 不能有大于3bp 的反向重复序列或自身互补序列存在；上下游引物互补性一个引物的3’末端序列不能结合到另一个引物的任何位点上； 解链温度（Tm ） 两个引物的Tm 值相差不能大于5℃，扩增产物与引物的Tm 值相差不能大于10℃3’末端 引物3’末端碱基尽量为G 或C ，不能使3’末端有NNGC 或NNCG 序列引物序列不要有局部的GC rich 或AT rich （特别是3’端），避开T/C 或A/G 的连续结构 1.2引物设计原则 引物特性及优化设计

引物设计原则(含Realtime引物)

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析） 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

简并引物设计原则

The central role of UDPGDH played in capsule and other polysaccharides synthesis. KPS, capsule polysaccharide; LPS,lipopolysaccharide 简并引物设计方法 （1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。 （2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W/X，也可在线分析。所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。 （3）确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp 之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。 若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。 （4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer 5.0 支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T，该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。 （5）对引物的修饰若得到的引物为： 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3 则简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度很高不利于PCR，可以通过次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤可以很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。 这样设计出来的简并引物对，适用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。 简并引物设计原则

引物设计1

1-2890(引物1) #1: Product of length 640 (rating: 171) Contains region of the molecule from 1 to 640 Tm: 72.1 C TaOpt: 48.8 C GC: 32.3 Sense Primer: CCTGGTTAATCCAAATCAC Similarity: 100.0% Length: 19 Tm: 44.1 C GC: 42.1 dH: -142.0 kcal/mol dS: -372.4 cal/mol dG: -29.2 kcal/mol Antisense Primer: GACAGGCCCTAATTAAGTT Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 45.0 C GC: 42.1 dH: -158.0 kcal/mol dS: -418.4 cal/mol dG: -31.5 kcal/mol Tm Difference: 0.9 GC Difference: 0 #1: Product of length 540 (rating: 171) Contains region of the molecule from 1 to 540 Tm: 72.2 C TaOpt: 49.4 C GC: 33.1 Sense Primer: CCTGGTTAATCCAAATCACT Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 45.8 C GC: 40.0 dH: -149.8 kcal/mol dS: -393.2 cal/mol dG: -30.8 kcal/mol Antisense Primer: ATAAGATTTGAGGTCAGCCA Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 46.4 C GC: 40.0 dH: -147.7 kcal/mol dS: -386.3 cal/mol dG: -30.7 kcal/mol Tm Difference: 0.6 GC Difference: 0.0 1-2890(引物2) #1: Product of length 603 (rating: 171) Contains region of the molecule from 514 to 1116 Tm: 73.9 C TaOpt: 50.3 C GC: 37.0 Sense Primer: TTGAAGATGGCTGACCT Similarity: 100.0% Length: 18 Tm: 42 C GC: 47.1 dH: -129.6 kcal/mol dS: -335.0 cal/mol dG: -27.9 kcal/mol Antisense Primer: GGAGGCCCTTTAACTTAA

手把手教你学FPGA 设计思想篇

泽屹电子 手把手教你学FPGA 设计思想篇 阿东团队编著

手把手教你学FPGA 设计思想篇

目录 写在前面...................................................................................................................................... - 4 - 1 什么是设计思想.................................................................................................................... - 6 - 2 概述........................................................................................................................................ - 6 - 3 代码简单化............................................................................................................................ - 6 - 4 注释层次化............................................................................................................................ - 7 - 5 交互界面清晰化.................................................................................................................... - 7 - 6 模块划分最优化.................................................................................................................... - 7 - 7 代码工具化............................................................................................................................ - 8 - 8 方案精细化............................................................................................................................ - 8 - 9 资源合理化............................................................................................................................ - 9 - 10 时序流水化.......................................................................................................................... - 9 - 11 资源优化方法.................................................................................................................... - 10 - 12 代码自检............................................................................................................................ - 10 - 13 通用电路BB化.................................................................................................................. - 10 -

PCR引物设计原则

PCR引物设计原则 引物(Primer)是人工合成的两段寡核苷酸序列。 1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、G十C含量：应在40%-60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发. 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构. 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。引物3’端最好选T，错配的几率与A 相比大大的降低了。G、C之间错配的概率小于A、T. 6、引物的5’端可以修饰，而3’端不能进行修饰。5’端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白质结合的DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3’端开始的，因而3’端不能进行任何修饰，另外3’端也不能有形成任何二

级结构的可能。 如何设计引物 不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（DNA的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区）。 PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务）

分子生物学--引物设计

PCR引物设计与分析 摘要：本文简单的介绍了PCR技术以及PCR引物设计原则和技巧，并以一段序列为例，介绍两种引物设计软件的使用方法。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价则可采用“Oligo 6”软件。 关键词：PCR；引物设计；软件； 1PCR 聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。 PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 2引物设计原则及注意

引物设计原则及酶切位点选择和设计

引物设计原则及酶切位点选择和设计 [整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。但这就需要你仔细设计引物。连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。 （一）设计引物前应做的准备工作： 准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用 （二）设计引物所要考虑的问题 两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。我看promega的说明书上说，最好隔四个。还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。 最好使用酶切效率高的。 最好使用双酶切有共同buffer的酶。 最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。 Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。 Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。 其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。1.一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意。

LAMP技术原理和引物设计

LAMP原理及引物设计与实例 ．LAMP引物的设计 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同. B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 2．扩增原理 60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 https://www.wendangku.net/doc/b86178601.html,MP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产

手把手教你天线设计——用MATLAB仿真天线方向图

手把手教你天线设计—— 用MATLAB仿真天线方向图 吴正琳 天线是一种变换器，它把传输线上传播的导行波，变换成在无界媒介（通常是自由空间）中传播的电磁波，或者进行相反的变换。在无线电设备中用来发射或接收电磁波的部件。无线电通信、广播、电视、雷达、导航、电子对抗、遥感、射电天文等工程系统，凡是利用电磁波来传递信息的，都依靠天线来进行工作。此外，在用电磁波传送能量方面，非信号的能量辐射也需要天线。一般天线都具有可逆性，即同一副天线既可用作发射天线，也可用作接收天线。同一天线作为发射或接收的基本特性参数是相同的。这就是天线的互易定理。天线的基本单元就是单元天线。 1、单元天线 对称振子是一种经典的、迄今为止使用最广泛的天线，单个半波对称振子可简单地单独立地使用或用作为抛物面天线的馈源，也可采用多个半波对称振子组成天线阵。两臂长度相等的振子叫做对称振子。每臂长度为四分之一波长、全长为二分之一波长的振子，称半波对称振子。 对称振子是一种经典的、迄今为止使用最广泛的天线，单个半波对称振子可简单地单独立地使用或用作为抛物面天线的馈源，也可采用多个半波对称振子组成天线阵。两臂长度相等的振子叫做对称振子。每臂长度为四分之一波长、全长为二分之一波长的振子，称半波对称振子。

1.1用MATLAB画半波振子天线方向图 主要是说明一下以下几点： 1、在Matlab中的极坐标画图的方法： polar(theta,rho,LineSpec)； theta：极坐标坐标系0-2*pi rho：满足极坐标的方程 LineSpec：画出线的颜色 2、在方向图的过程中如果rho不用abs(f)，在polar中只能画出正值。也就是说这时的方向图只剩下一半。 3、半波振子天线方向图归一化方程： Matlab程序： clear all lam=1000;%波长 k=2*pi./lam;

知识：手把手教你计算光电参数,设计高光效产品

知识：手把手教你计算光电参数，设计高光效产品 作为一个光学设计师，在工作中经常遇到关于光电参数计算的问题，以前100lm/W灯管就是好产品，但随着LED的发展，要求也水涨船高，现在很多工程案例为了节能，光效从120涨到150、甚至180lm/W，让人非常头疼。 下面结合实例，谈一谈怎么设计一款光电满足要求的灯具。 标称值一般指产品稳定后的测试数据。 你首先必须知道灯具测试的标准，大部分灯具可以直接通过积分球完成光电测试，依据IESLM79提供的方法，需要待灯具稳定后来测试，至于一些参数虚标的产品可以无视。

图1.IES LM79中对灯具稳定的要求 为什么一定是稳定后的数据，大部分LED产品从瞬态到稳态都有一个衰减，而这些衰减很大，不能够忽视。 通过测试这些衰减大小，可以等到一个相对的热衰减系数，可以参看红字部分。 表2市场上8-9W球泡灯的测试参数 LED灯珠选型与测试 设计的时候，首先是LED选型，LED规格书好多页，让你眼花缭乱。主要有额定功率、光通量、电压、色温、显色指数、色容差等等。如果继续深究下去，支架有ppa、pct、emc 几种，芯片尺寸有好多种，荧光粉、硅胶、金线、支架金属都有很大的猫腻，这些对光源寿命都有着很大影响。 对LED而言，最重要的就是额定电流下光通量，比如现在最常用2835颗粒，额定60mA 的光通量24-26lm。那是不是我将100pcs该LED焊在灯条上，60mA测试时光通量就是240-260lm？

答案是否定的，以下是一些误差的来源，最后测试报告一定是以自己仪器测试为准，所以就需要弄清楚这些系数。 表3 一些误差汇总 然而这些系数有时候推算比较麻烦，也少不了很多一对一测试。所以我的思路是，直接将厂商的标准LED灯珠焊在灯板上，用大积分球测试，直流供电，测试多个电流下的数据。 如果你设计一款常规的产品，对光效没有要求，额定电流下测试就可以了。但如果你需要更高光效的产品，那些方法就不适用了，要么选择更亮的灯珠，要么就是降低电流使用，更多的时候两者需要结合来使用。 表4 一款颗粒的测试数据 LED灯珠数量计算 做好以上一些工作后了，你还缺少两个重要的参数，一个是灯具电源转换效率，另外一个就是灯具的光学效率，可以通过如下公式计算，有时候面对全新的灯具无从入手，可以根据经验进行一些估算。