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九种载体的多克隆位点及质粒图谱

九种载体的多克隆位点及质粒图谱

(pLLP-OmpA、pLLP-STII、pMBP-P、pMBP-C、pTrc-CKS、pET-GST、pET-Trx、pET-His、pET-DsbA)

这九种载体的多克隆位点均为

GGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC CAC(TAA)CAT CAT BamHI EcoRI NheI His His His CAT CAT CAT TAA GCTT

His His His HindIII

我们建议您扩增基因5 '端选BamHI或BglII,3'端选NheI或XbaI 或SpeI,同时3'端不要带终止密码子,注意与GGA TCC(Gly Ser)表达框架正确,载体用NheI—BamHI双酶切。BamHI和BglII为同裂酶,NheI、XbaI和SpeI为同裂酶。

如您目的基因无法满足上述要求,如同时含有BamHI和BglII,5'端可选择EcoRI,但须注意与表达框架GAA TTC(Glu Phe)对齐。如您目的基因同时含有XbaI、NheI和SpeI,3'端可选择EcoRI。

如果您的目的基因已带有终止密码子,同样可以进行克隆表达,只是注意有些表达载体是在C端带6个His。

PCR引物设计时BamHI和EcoRI位点的5'端保护碱基有2至3个GC即可,而XbaI、NheI和SpeI位点5'端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割。

(一)pLLp-OmpA

Size: 7.5Kb

多克隆位点:

Plpp lac operator RBS

CGAGGCGCAAAAA A TG AAA AAG ACA GCT A TC GCG

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala

OmpA signal

ATT GCA GTG GCA CTG GCA GGT TTC GCT ACC GTC GCT CAG GCT GGA TCC GCA Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala BamHI

GAA TTC AGC GCT AGC CAC CAT CAT CAT CAT CAT TAAGCTT

EcoRI NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His- stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证ctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatttttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaa aataagtgccttcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagctagagag gctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattca ctggaactctagataacgaggcgcaaaaaatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggcaggtttcgctaccgtcgctcaggct ggatccgcagaattcagcgctagccaccatcatcatcatcattaagcttagatccggctgagcaacgacgtgaacgcaatgcgttccgacgtt caggctgctaaagatgacgcagctcgtgctaaccagcgtctggacaacatggctactaaataccgcaagtaatagtacctgtgaagtgaaaaa tggcgcacattgtgcgacattttttttgtctgccgtttaccgctactgcgtcacgcgtaacatattcccttgctctggttcaccattctgcgctgactct actgaaggcgcattgctggctgcgggagttgctccactgctcaccgaaaccggataccctgcccgacgatacaacgctttatcgacta

载体其它部分序列见Genebank Locus ASAK3121 (plasmid pIN-III-ompA1)

(二)pLLp-STII

Size: 7.5kb

多克隆住点:

lac operator RBS

GAAGGAGATA TACAT A TG AAA AAG AAC A TC GCA TTC CTC

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu

STII signal

CTG GCA TCT ATG TTT GTT TTC TCT ATC GCT ACC AAC GCT TAC GCT GGA TCC

Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala BammHI GCA GAA TTC AGC GCT AGC CAC CAT CAT CA T CAT CAT TAA GCTT

NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His- stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证ctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatttttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaa aataagtgccttcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagctagagag gctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattca ctggaactctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaaaagaacatcgcattcctcctggcatctatgtttgttttctctatc gctaccaacgcttacgctggatccgcagaattcagcgctagccaccatcatcatcatcattaagcttagatccggctgagcaacgacgtgaac gcaatgcgttccgacgttcaggctgctaaagatgacgcagctcgtgctaaccagcgtctggacaacatggctactaaataccgcaagtaatag tacctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgacattttttttgtctgccgtttaccgctactgcgtcacgcgtaacatattcccttgctctggttc accattctgcgctgactctactgaaggcgcattgctggctgcgggagttgctccactgctcaccgaaaccggataccctgcccgacgatacaa cgctttatcgacta

载体其它部分序列见Genebank Locus ASAK3121 (plasmid pIN-III-ompA1)

STII signal peptide见Genebank Locus HSTI_ECOLI (p22542)

(三)pMBP-p

Vector size: 6.7kb

Thrombin cut site

AAC AAC CTG GGT ATC GAT ACT ACT GAG AAC TAT CCG CGT GGA TCC GCA GAA

Asn Tyr Pro Arg BamHI EcoRI

TTC AGC GCT AGC CAC CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT

NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His- stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证Gccaccatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaa cgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagactaattcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaac aacctgggtatcgatactactgagaactatccgcgtggatccgcagaattcagcgctagccaccatcatcatcatcattaagctt

HindIII

载体其它部分序列见pMal-p2

Maltose binding protein(E.coli)编码氨基酸序列见Genebank

MBP MW=42KD

(四)pMBP-c

Vector size: 6.6kb

Thrombin cut site

AAC AAC CTG GGT ATC GAT ACT ACT GAG AAC TAT CCG CGT GGA TCC GCA GAA

Asn Tyr Pro Arg BamHI EcoRI

TTC AGC GCT AGC CAC CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT

NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His- stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证Gccaccatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaa cgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagactaattcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaac aacctgggtatcgatactactgagaactatccgcgtggatccgcagaattcagcgctagccaccatcatcatcatcattaagctt

HindIII

载体其它部分序列见pMal-c2

Maltose binding protein(E.coli)编码氨基酸序列见Genebank

MBP MW=42KD

(五)pET-GST

vector size: 3.7kb

多克隆位点:

P3C cut site

PT7 ——CTC GAA GTT CTG TTT CAG GGT CCA GCA GGA

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro BamHI TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC CAC CAT CAT CAT CAT TAA GCTT

EcoRI NheI 6His-tag HindII

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证

XbaI

tctagatcacacaggaaacagtattc atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa atg ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa tcg gac agc atg cca gac tct ctc gaa gtt ctg ttt cag ggt cca gca gga tcc gca gaa ttc agc gct agc cac cat cat cat cat cat taa gctt

HindIII

载体其它部分序列见pUC18(不含pUC18多克隆位点)

Glutathione S-transferase编码氨基酸序列如下(含多克隆位点):MSPILGYMKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFP NLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGA VLDIRYGV SRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYD ALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATF GGGDHPPKSDSMPDS LEVLFQG PAGSAEFSASHHHHHH

248 AMINO ACIDS

MW 28.7KD

(六)pET-Trx

vector size: 3.3kb

多克隆位点:

P3C cut site

PT7 ——CTC GAA GTT CTG TTT CAG GGT CCA GCA GGA

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro BamHI TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC TAA CAT CAT CAT CAT TAA GCTT

EcoRI NheI stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证

XbaI

tctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat atg tctgataaaattattcatctgactgatgattcttttgatactgatgtacttaaggc agatggtgcaatcctggttgatttctgggcacactggtgcggtccgtgcaaaatgatcgctccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcag ggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcacaacccgggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttc aaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggctggctctagcat gccagactctctcgaagttctgtttcagggtccagcaggatccgcagaattcagcgctagctaacatcatcatcatcattaagctt

HindIII

载体其它部分序列见pUC18(不含pUC18多克隆位点)

Thioredoxin mut(His-patch) (E.coli)编码氨基酸序列如下(含多克隆位点):

MSDKII H LTDDSFDTDVLKADGAILVDFWA H WCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNI D H NPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEV AATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSSMPDSLEVLF QGPAGSAEFSAS

133 AMINO ACIDS

MW 14KD

3 个His形成立体His-patch

(七)pET-His

vector size: 2.9kb

多克隆位点:thrombin cut site

PT7 — CTG GTG CCG CGC GGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT

Leu Val Pro Arg BamHI EcoRI

AGC TAA CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT

NheI HindIII

BamHI EcoRI NheI stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证

XbaI

tctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc atg ggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcgg atccgcagaattcagcgctagctaacatcatcatcatcattaagctt

HindIII

载体其它部分序列见pUC18 (不含pUC18多克隆位点)

(八)PTRC-CKS

vector size: 5.2kb

多克隆位点:

P3C cut site

PTrc —CTC GAA GTT CTG TTT CAG GGT CCA GCA GGA

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro BamHI TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC CAC CAT CAT CAT CAT CATTAA GCTT

EcoRI NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His-stop HindIII

mut

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证

XbaI

tctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat atg agttttgtggtcattattcccgcgcgctacgcgtccacgcgtctgcccggtaa accattggttgatattaacggcaaacccatgattgttcatgttcttgaacgcgcgcgtgaatcaggtgccgagcgcatcatcgtggcaaccgatc atgaggatgttgcccgcgccgttgaagccgctggcggtgaagtatgtatgacgcgcgccgatcatcagtcaggaacagaacgtctggcgga agttgtcgaaaaatgcgcattcagcgacgacacggtgatcgttaatgtgcagggtgatgaaccgatgatccctgcgacaatcatccgtcaggtt gctgataacctcgctcagcgtcaggtgggtatggcgactctggcggtgccaatccacaatgcggaagaagcgtttaacccgaatgcggtgaa agtggttctcgacgctgaagggtatgcactgtacttctctcgcgccaccattccttgggatcgtgatcgttttgcagaaggccttgaaaccgttgg cgataacttcctgcgtcatcttggtatttatggctaccgtgcaggctttatccgtcgttacgtcaactggcagccaagtccgttagaacacatcga aacgttagagcagcttcgtgttctgtggtacggcgaaaaaatccatgttgctgttgctcaggaagttcctggcacaggtgtggatacccctgag gacggtagcatgccagactctctcgaagttctgtttcagggtccagcaggatccgcagaattcagcgctagccaccatcatcatcatcattaag ctt

HindIII

载体其它部分序列见pTrcHisB(不含pTrcHisB多克隆位点)

CKS mut(E.coli CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase or CMP-KDO synthetase)编码氨基酸序列如下(含多克隆位点):MSFVVIIPARYASTRLPGKPLVDINGKPMIVHVLERARESGAERIIV ATDHEDV ARA VEAAG GEVCMTRADHQSGTERLAEVVEKCAFSDDTVIVNVQGDEPMIPA TIIRQV ADNLAQRQVG MATLA VPIHNAEEAFNPNA VKVVLDAEGY AL YFSRATIPWDRDRFAEGLETVGDNFLRHL GIYGYRAGFIRRYVNWQPSPLEHIETLEQLRVLWYGEKIHV A V AQEVPGTGVDTPEDGSMP DS LEVLFQG PAGSAEFSASHHHHHH

268 Amino Acids Molecular Weight 29KD

(九)PET-DsbA

vector size: 3.6kb

thrombin cut site

—ATG TAT CCG CGT GGA

Met Tyr Pro Arg BamHI

TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC TAA CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT 3

EcoRI NheI stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下,经DNA双向测序验证)

XbaI

Tctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc atg ggcagctctcatcatcatcatcatcactctagcggtgctcagtacgaagatg gtaaacagtacactaccctggaaaaaccggtagctggcgcgccgcaagtgctggagtttttctcyyycttcagcccgcattcctatcagtttga agaagttctgcatatttctgataatgtgaagaaaaaactgccggaaggcgtgaagatgactaaataccacgtcaacttcatgggtggtgacctg ggcaaagatctgactcaggcatgggctgtggcgatggcgctgggcgtggaagacaaagtgactgttccgctgtttgaaggcgtacagaaaa cccagaccattcgttctgcttctgatatccgcgatgtatttatcaacgcaggtattaaaggtgaagagtacgacgcggcgtggaacagcttcgtg gtgaaatctctggtcgctcagcaggaaaaagctgcagctgacgtgcaattgcgtggcgttccggcgatgtttgttaacggtaaatatcagctga atccgcagggtatggataccagcaatatggatgtttttgttcagcagtatgctgatacagtgaaatatctgtccgagaaaaaaggtgatgaagat gaagatgaagatagcatgtatccgcgtggatccgcagaattcagcgctagctaacatcatcatcatcattaagctt

HindIII

载体其它部分序列见pUC18(不含pUC18多克隆位点)

DsbA mut(E.coli)编码氨基酸序列如下(含多克隆位点):MGSSHHHHHHSSGAQYEDGKQYTTLEKPV AGAPQV;EFFSFFSPHSYQFEEVLHISDNVKK KLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAW A V AMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTI RSAS DIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLV AQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQG MDTSNMDVFVQQY ADTVKYLSEKKGDEDEDEDS MYPRGS AEFSAS

223 Amino Acids

Molecular Weight 24.7KD

克隆载体与表达载体

克隆载体:大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector ):携带插入外源片段的质粒或噬菌体,从而产生更多物质或蛋白质产物。 (这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中,为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件,即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体:有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子。 表达载体( Expression vectors )就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),是目的基因能够表达的载体。如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中,有一 个杂合tac强启动子和终止子,在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点,要求与ATG之间间隔5-13bp),其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 (RBS位点:1974年Shine和Dalgarno首先发现,原核生物,在 mRNAk有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3?10 bp处的由3 —9bp组成的序列。这段序列富含嘌吟核苷酸,刚好与16S rRNA 3,末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体 RNA的识另U与结合位点。根据发现者的名字,命名为 Shine-Dalgarno 序列,简称 S-D 序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3 '端一部分序列互补,因此 S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA勺一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence 是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境, 避免 ribosome 出现 leaky scan ) 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子(T7),调节子(LacZ)等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内 都是低拷贝的,防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了,不管读码框什么的,但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面,而且要表达蛋白,所以就要求你的读码框不能乱了,否则就不能得到你想到的表达产物。 1. 载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细 胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector )。2. 载体的分类 按功能分成:( 1)克隆载体 : 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分:( 1 )原核载体( 2)真核载体( 3)穿梭载体( sbuttle vector )指在两种宿 主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间).

维真生物-如何阅读基因载体图谱

如何阅读基因载体图谱 基因载体是基因工程的核心,也是基因治疗中强有力的生物工具,我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类:病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具,可将遗传物质带入细胞,原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞,进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件: (1)携带外源基因并能包装成病毒颗粒; (2)介导外源基因的转移和表达; (3)对人体不致病; (4)在环境中不会引起增殖和传播。 非病毒载体一般是指质粒DNA。 2、按进入受体细胞的类型分类:原核载体、真核载体、穿梭载体(含原核和真核2个复制子,能在原核和真核细胞中复制,并可以在真核细胞中有效表达)。 3、按功能分类:克隆载体、表达载体 克隆载体:具有克隆载体的基本元件(Ori,Ampr,MCS等),可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段(外源基因)的载体。 表达载体:克隆载体中加入一些与表达调控(具有转录/翻译所必需的DNA顺序)有关的元件即成为表达载体。 载体组成元件 1、复制起始位点Ori:即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。 2、抗生素抗性基因:可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ (1)Ampr:水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。

(2)tetr :可以阻止四环素进入细胞。 (3)camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。 (5)hygr:使潮霉素β失活。 3、多克隆位点:MCS克隆携带外源基因片段,它具有多个限制酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。 4、P/E:启动子/增强子 5、Terms:终止信号 6、加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA作用 示例阅读载体: pENTER载体 1)human ORF + pENTER载体 2) CMV启动子,T7启动子 3) ORF的C端融合了Flag和His tag 4) 多克隆位点,常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常见的)

如何阅读质粒图谱(更新版本)

如何阅读质粒图谱 最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于 大家分享。 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素 #复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 #抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+l ,Kan+ #多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l #P/E 启动子/增强子l #Termsl 终止信号 #加poly(A)信号l 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。 (1)Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 (2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。 (3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(卡那霉素衍生物)失活 (5)hygr 使潮霉素β失活。 第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。 第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号 #启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。 #增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。 #核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。l #转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物 1、4℃,15min、13000转离心(先等离心机降温) 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min(冰上) 4、准备1.5毫升EP管,并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物,震荡离心,-20℃保存。 二、跑MIX检测引物(20ul体系)、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA(日本晴)1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶(50ul体系) DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu(最后加)1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶,用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2,放在55℃水浴锅中10min,每2min摇匀1次,涡旋,短离。 3、将液体冷却到室温,转移到平衡住中,离心10000转,1min30s,倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul,离心10000r,1min30s,倒掉滤液。 5、加入spw700ul,离心10000r,1min,倒掉滤液(重复一次) 6、空转2min,13000r,之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中,30min。 8、加入DD水10ul,静置2min,离心2min,13000r,重复3次,-20℃保存。 五、胶回收产物检测(10ul)体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体(克隆载体)(4ul 体系) 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后,PCR:25℃15min 盖子温度50℃

如何阅读分析质粒图谱

如何阅读分析质粒图谱 日期:2012-04-18来源:未知作者:xilu点击:次 如何阅读分析质粒图谱 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素 1. 复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 2. 抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ 3. 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 4. P/E 启动子/增强子 5. Terms 终止信号 6. 加poly(A)信号可以起到稳定mRNA作用 如何阅读质粒图谱 第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记,因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间,也可以推广到真核生物表达载体的构建,如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增,也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。 1. Ampr水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 2. tetr可以阻止四环素进入细胞。 3. camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。

4. neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活 5. hygr使潮霉素β失活。 第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。 第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号

基因工程原理讲义:基因克隆的质粒载体

第六讲基因克隆的质粒载体 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月

基因克隆的质粒载体 一、导言 1.质粒是一类引人注目的亚细胞有机体 其结构比病毒还要简单,既无蛋白质外壳,也无细胞外生命周期,只能在寄主细胞内增殖,并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。2.质粒的类型多种多样 F质粒:F因子或性质粒(Sex plasmid),它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的 寄主受体细胞中去。 R质粒:通称抗药性因子(Resistant factor, R factor),编码一种或数种抗菌素抗性基因,并能将此抗性转移到缺乏该质粒 的适宜的受体细胞中去。 Col质粒:所谓Col质粒,即是一种产生大肠杆菌素的因子,编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 3.质粒载体 70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。

二、质粒的一般特性 1.质粒DNA(细菌质粒定义) *1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外,所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖 于寄主提供核酸酶及蛋白质。 *2.质粒DNA分子大小 文献中有3种说法:小的仅有103KD,仅能编码2-3种蛋白质; 大的可达105KD,两者相差上百倍。 1Kb~200Kb (Sambrok et al.) 5Kb~400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD *3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系 一般情况下,质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状

所有质粒载体汇总

酿酒酵母表达载体 pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF pY15TEF, pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424,酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109;质粒pGADT7,pGBKT7 ;对照质粒pGBKT7-53 , pGBKT7-lam , pGADT7-T , PCL1,酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,丫187,丫190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZ a A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc , 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33, KM71 , KM71H , GS115, 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62等原核表达载体,包括pET系列,pET-GST, pGEX 系列(含GST标签),pMAL 系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,- p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis 系列,pQE 系列,pTrc99a,pTrcHis系列, pBV220,221,222,pTXB 系列,pLLP-ompA,pIN-III-ompA (分泌型表达系列),pQBI63 (原核表达带荧光)pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPi nPoi nt-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF (+) , pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233- 3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK (+) ,pBlueScript SK (-) pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C,大肠杆菌冷激质粒:pColdI pColdII pColdIII pColdTF原核共表达质粒:pACYCduet-1,pETduet- 1,pCDFduet-1, pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣:pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞:DH5a JM101 JM103

为什么要先构建克隆载体再用表达载体

为什么要先构建克隆载体再用表达载体 构建克隆载体是大量扩增DNA片段,用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作,构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。 为什么要先构建克隆载体,再用表达载体,我猜是因为: ①得到大量的DNA,虽然PCR也可以,但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR,而且每次都要重新提DNA和RNA才行,而且,PCR反应的试剂盒又不便宜,用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂(相对于PCR),成功率不是极高,而且还要筛选,但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌,你就可以保存了,你想什么时候用,摇个菌,就可以制备到大量的DNA。 ②测序需要。你想转表达,你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的,不要以为你设计了个特异性引物,然后跟你mark的长度就可以确定了,这也只是推测,在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许,要拿去测序,而一般送测的序列都是构建到载体上的序列,克隆载体上一般也都带有测序引物,已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。 先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择,如果你的扩增PCR目的条带很亮,而且单一性很好,我建议你可以直接克隆进入表达载体。 很多人选择先构建克隆载体,是因为在扩增基因时目的条带模糊,特异性不好,这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序,增加测序的准确度,从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物,直接送过去测序,往往导致测序信号峰很杂,有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的PCR片段比较容易降解,而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。 先构建克隆载体,一是为了便于测序,确认克隆序列正确,二是为了便于基因PCR片段的保存。 怎么构建克隆载体和表达载体? 首先根据你的实验需要选择相应的载体。 其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点,切记在载体上所选择的酶切位点要和你

质粒图谱的阅读方法

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 质粒图谱的阅读方法 质粒图谱的阅读方法载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 a. 复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。 原核生物 DNA分子中只有一个复制起始点。 而真核生物 DNA分子有多个复制起始位点。 b. 抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+ ,Kan+ c. 多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 d. P/E 启动子/增强子 e. Terms 终止信号 f. 加 poly(A)信号可以起到稳定 mRNA 作用二、如何阅读质粒图谱第一步: 首先看 Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)。 第二步: 再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。 (1) Ampr 水解-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 (2) tetr 可以阻止四环素进入细胞。 (3) camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4) neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使 G418(长那霉素衍生物)失活(5) hygr 使潮霉素失活。 第三步: 1 / 6

看多克隆位点(MCS)。 它具有多个限制酶的单一切点。 便于外源基因的插入。 如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。 决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步: 再看外源 DNA 插入片段大小。 质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。 一般来说,外源DNA 片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。 第五步: 是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体。 克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。 选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号 a. 启动子-促进 DNA 转录的 DNA 顺序,这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。 b. 增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)

如何阅读质粒图谱

一、载体主有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori,即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因:可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ 多 克隆位点:MCS克隆携带外源基因片段 P/E:启动子/增强子 Terms:终止信号 加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) Ori的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记: (1)Ampr:水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 (2)tetr :可以阻止四环素进入细胞。 (3)camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。 (5)hygr:使潮霉素β失活。 第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。 第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆

载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。 相关概念: 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号 启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或 操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子-为真核λ基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子-负增强子,负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。 λ转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT 或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。 三、载体及其分类 载体:即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。 P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子,是用来携带目的 基因片段进入受体细胞的DNA。 载体的分类 按功能分成:(1)克隆载体:都有一个松弛的复制子,能带动 外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严谨型载体)(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件 (ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。

常用pGEX载体图谱

Rosetta系列的表达菌株可以提供T7 RNA聚合酶,它能表达PET系列载体上的外源基因。。。pGEX系列载体上的外源基因不需要T7 RNA聚合酶,普通的大肠杆菌经IPTG诱导即可表达 Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的-35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成,Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区,加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成 蛋白标签: A myc tag is a polypeptide protein tag derived from the c-myc gene product that can be added to a protein using recombinant DNA technology. It can be used for affinity chromatography, then used to separate recombinant, overexpressed protein from wild type protein expressed by the host organism. It can also be used in the isolation of protein complexes with multiple subunits. A myc tag can be used in many different assays that require recognition by an antibody. If there is no antibody against the studied protein, adding a myc-tag allows one to follow the protein with an antibody against the Myc epitope. Examples are cellular localization studies by immunofluorescence or detection by Western blotting. The peptide sequence of the myc-tag is (in 1- and 3-letter codes, respectively): N-EQKLISEEDL-C, N-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-C, where N stands for Amino-terminus and C stands for Carboxy terminus. The tag is approximately 1202 Daltons in atomic mass and has 10 amino acids. It can be fused to the C-terminus and the N-terminus of a protein. It is advisable not to fuse the tag directly behind the signal peptide of a secretory protein, since it can interfere with translocation into the secretory pathway. A monoclonal antibody against the myc epitope, named 9E10, is available from the non-commercial Developmental Studies Hybridoma Bank

(整理)克隆载体与表达载体

一部分:概念解析 二部分:问题解答 克隆载体:大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector ):携带插入外源片段的质粒或噬菌体,从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中,为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件,即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体:有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子。 表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中,有一个杂合tac强启动子和终止子,在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点,要求与ATG之间间隔 5-13bp),其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 (RBS位点:1974年Shine和Dalgarno首先发现,原核生物,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3,末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字,命名为Shine-Dalgarno序列,简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补,因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境,避免ribosome出现leaky scan) 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子(T7),调节子(LacZ)等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的,防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了,不管读码框什么的,但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面,而且要表达蛋白,所以就要求你的读码框不能乱了,否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。 2. 载体的分类 按功能分成:(1)克隆载体: 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs

质粒载体分类及阅读

质粒载体分类及阅读 一.九种表达载体 Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体 pTZ19R DNA pUC57 DNA PMD18T PQE30 pUC18 pUC19 pTrcHisA pTrxFus pRSET-A pRSET-B pVAX1 PBR322 pbv220 pBluescript II KS (+) L4440 pCAMBIA-1301 pMAL-p2X pGD926 三.PET系列表达载体 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression System 33b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? p ET Expression Systems Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems plus Competent Cells Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET GST Fusion Systems 41 and 42 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Vector DNA Protein Purification ? Purification Systems ? Strep?Tactin Resins and Purification Kits 四.PGEX系列表达载体 T EcoR pGEX-1 I/BAP pGEX-2T pGEX-2TK pGEX-3X

基因克隆的质粒载体

基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒,其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因,并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞,使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一.质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子(图4-1)。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状,但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型: 1.当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共价闭合环形DNA(cccDNA),这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型; 2.如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构,另一条链出现有一至数个缺口时,称之为开环DNA(ocDNA),此即OC构型; 3.若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后,发生双链断裂形成线性分子(IDNA),通称L构型(见图4-2)。 在琼脂糖凝胶电泳中,不同构型的同一种质粒DNA,尽管分子量相同,仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA,其后依次是L DNA和OC DNA(图4-3)。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子,都必定包括如下三种共同的组成部分,即复制基因(replicator)、选择性记和克隆位点。 二.质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%~3%左右,但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。

认识质粒图谱

一、如何阅读质粒图谱 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori,即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。 而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因:可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ 多l克隆位点:MCS克隆携带外源基因片段 P/E:启动子/增强子 Terms:终止信号 加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) Ori的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记: (1)Ampr:水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 (2)tetr :可以阻止四环素进入细胞。 (3)camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。 (5)hygr:使潮霉素β失活。 第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点,便于外源基因的插入。 如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。 第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。 二、相关概念: 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号 启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子-为真核l基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子-负增强子,负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。 l转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA 的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。 三、载体及其分类 载体:即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前,载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素: (1)复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 (2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ (3)多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 (4)P/E 启动子/增强子 (5)Terms 终止信号 (6)加poly(A)信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点: 【1】构建DNA 重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型: (1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选

质粒。 (2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。(3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。 综上所述,选用质粒(最常用)做载体的5点要求: (1)选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载 体); (2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。 (3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地; (4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。 (5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。 无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割,获得线性载体分子,以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步:首先看Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)

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