pcDNA3.1+-gD稳定转染CHO细胞

pcDNA3.1＋-gD稳定转染CHO细胞

1 pcDNA3.1＋-gD的线性化: pcDNA3.1＋使用说明书推荐了以下几个酶作为线性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107ⅠEam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通过DNAMAN分析gD 序列发现其带有MfeⅡ酶切位点。

2 转染前一天,在60mm的dish中接种8×105个细胞,加入5ml培养基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培养,至转染时要求细胞40%-80%汇合。

3 通过分光光度计测定pcDNA3.1＋-gD的浓度,用不含血清、抗生素、蛋白质的培养基稀释2.5ug的pcDNA3.1＋-gD至总体积150ul，其最小浓度不低于0.1ug/ul,稀释后应颠倒几次EP管以混匀混合物。

4 向混匀的混合物中加入15ul转染试剂(PolyFect Transfection Reagent QIAGEN),用加样器吹打5次。

6 在室温下(20-25℃)孵育混合物5-10分钟。

7 在孵育的同时，吸出dish中的培养基，用PBS液洗涤一次，加入3ml的培养基(含血清，不含抗生素).

8 孵育完成后加入1ml培养基(含血清),用加样器吹打2次，将产物全部加入60mm的dish中，轻轻摇动dish 以混匀。

9 37℃,5%CO2培养，在细胞汇合度不超过50%时加入G418进行筛选。

★转染时转染两组细胞，组一在转染后细胞汇合度不超过50%时（一般是24小时）加入G418进行筛选；组二在转染后待细胞汇合度达到80%时1/4000、1/1000、1/300分别接种于dish中，48小时后加G418筛选。

10 加入G418后，每3天更换一次含有筛选浓度的G418。当有大量细胞死亡（5-7天）时，可以把G418的浓度减半维持筛选（此时可以加入适应性培养基1：4来改善细胞对培养基的同化作用）。

11 筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后，制备细胞悬液，记数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入48孔板中增殖（为了减少实验失误带来的风险建议冻存部分增

殖细胞）。

12 细胞大量扩增后，提取总DNA，做PCR检测目的基因是否存在。

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

整理)慢病毒稳转细胞株步骤

稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天 2、加入2ml全培养基DMEM 3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基

稳定转染细胞株的制备

稳定转染细胞株的制备 带质粒的大肠杆菌的激活和扩增 （1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约 2min,待冰完全融解即可使用。 （2）LB 培养基的制备按照如下配方配制 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 10g/L 用 NaOH 调节该培养基的 pH,使其达到 7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为 0.1mg/ml) （3）LB 固体培养基的制备到 200mlLB 液体培养基加入 3g 琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入 6-7 个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。 （4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到 LB 固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到 10mlLB 液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待 LB 液体培养基变浑浊后，4℃ 冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。 质粒的提取 准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液 （1）取 75ml 扩增变浑浊的 LB 液体培养基置于试管中。 （2）5,000×g 离心 10 分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。 （3）取出质粒提取盒，用 3ml 细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。 （4）加入 3ml 细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育 3 分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入 5ml 中和液混匀 （5）将 Clearing Column(兰色)放入一新的 50ml 离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育 2 分钟，1500×g 离心 5 分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。 （6）将 Binding Column(白色)放入一新的 50ml 离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g 离心 3 分钟，弃去离心液。 （7）在白管中加入 5ml 内毒素清洗液(需加异丙醇)，1500×g 离心 3 分钟，弃去离心液，在白管中再加 20ml 柱洗液(含有乙醇)，1500×g 离心 5 分钟，弃去离心液后，继续1500×g 离心 10 分钟，以保证彻底除去乙醇。 （8）取出白管，在滤纸上轻敲白管顶端的尖嘴，以保证去除试管中的乙醇，并用滤纸擦去白管外壁上的乙醇。 （9）把白管放入一个新的 50ml 离心管中，加入 600μl 无核酸酶的水(要把水加到白管中的 DNA 结合膜上),然后 1500-2000×g 离心 5 分钟 （10）收集离心管中的滤液，并转到 1.5mlEP 管中，密封，-20℃保存。 提取质粒的 DNA 电泳鉴定 （1）制胶取 0.15g 琼脂糖，15ml 1×TAE 混匀，微波炉加热 20 分钟，使之熔化，待自然冷却 60-70℃ 时，加入 0.25μl EB,轻轻混匀。 （2）将冷却至约60℃ 的凝胶倒入准备好的胶床内，厚度约 5mm,室温静置 1h,待胶固化后，置于电泳槽中，样品端位于负极。

细胞转染的详细过程

细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状

2020年整理)慢病毒稳转细胞株步骤

作者：空青山 作品编号：89964445889663Gd53022257782215002 时间：2020.12.13 稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

细胞转染技术原理及应用

细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿 孔法，脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性 低，但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

G418筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。 2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。 3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。6个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到一个具体试验：3x1024孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。 加药时间和维持浓度 1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。 2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的。1/2． . 关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。 筛选时的培养液 加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题： 1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，

病毒转染原理及步骤

病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

细胞转染的步骤

【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿

G筛选稳定表达细胞系 经验总结 Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】

G418筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。 2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。 3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。 加药时间和维持浓度

各种转染试剂中文说明

FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选

重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转 染EMT6细胞株的筛选 作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹 【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。

【关键词】HER2; 真核表达; 转染 ［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.

细胞转染与设计的原则

磷酸钙-DNA共沉淀法 核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。 1、配液 (1)2×HBS 1.63g NaCl 1.19g Hepes 0.023g Na2PO4、2H2O 加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存 (2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌 (3)TE：0.1mmol/L EDTA 1mmol/L Tris-HCL PH8.0 (4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。 (5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L 注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。 2、操作步骤[方法一]： (1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。 (2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。 (3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备 ①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。 ②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。 ③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。 (4)转染受体细胞 ①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。 ②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。 ③置37℃ 5% CO2培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。 ④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。 ⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。 ⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。 ⑦2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。 本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的外源性

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考） （1）24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）； （3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基； （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 （6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 （1）day0：24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基； （3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。） （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜； （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 （6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基； （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性： 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放； 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。 Starttoselectonpuromycin(2ug/mlfinalconcentration)3-4daysposttransfection.Massivecelldeathwillbeevi dentafter36-48hoursselectiononpuromycin.Dependentonthetransfectionefficiency,mosttransfectionwon' testablishsomepuromycin-resistantcoloniesexceptthattheretrovirus-producingcelllinesareusedforgener atingviralvector.Ifthefirstgenerationlentiviralvectorisusedinthetransfection,trytouseMo-MLVenvelopexpre ssingvector,ratherthanVSV/Gexpressingvectorforpackagingviralvectors.Thestablecolonies(trytopoolthe differentpuromycin-resistantcellcoloniestogehter,don'tmakesinglecolonyclone)willbeamplifiedafter10-14 daysselectiononpuromycin.