紫杉醇产生菌分离的研究
?研究报告?
紫杉醇产生菌分离的研究3
周东坡,平文祥,孙剑秋,周晓辉,刘晓兰,杨德柱,张建平,郑喜群
(齐齐哈尔大学生命科学与工程学院,黑龙江齐齐哈尔 161006)
摘 要 报道了1993年从东北红豆杉树(Tax us cuspidata Sieb.et Zucc)的枝条与树皮中分离获得了20余种内生真菌,并经代谢产物的薄层层析(TLC)技术的筛选与高效液相色谱仪(HPLC)的验证,有3株真菌(HQ33,HQ48, HQ54)均是紫杉醇的产生菌。其发酵液中紫杉醇的含量为51.06～125.70μg/L。
关键词 内生真菌;紫杉醇;东北红豆杉
中图分类号 Q939.5 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2001)01-0018-02
自Wani et al.(1971)从短叶红豆杉(Tax us bre2 vif olia Nutt.)的树皮中抽提分离出紫杉醇(Taxol),并发现其具有抗癌作用以来,人们又陆续发现它的独特抗癌机理并可治疗多种癌症(Schiff et al.1979, Slichenmyer et al.1991,Woo et al.1996,Jones et al. 1996,Pulkkinen et al.1996)。因此,人们开始大量地从红豆杉的树皮与枝叶等提取紫杉醇以满足医药市场的需求。由于红豆杉树在世界范围内属珍稀植物,而且其不同部位的紫杉醇含量均很低(Vidensk, 1990),故靠伐树提取紫杉醇必然严重地破坏自然资源,危及生态平衡(吴洁等,1996)。Stierle(1993)与Strobel(1993)首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌Taxom yces andreanae,其Taxol含量为24～50ng/L,为人们展示了一个可能生产Taxol的诱人的新途径。邱德有等(1994)也报道了从云南红豆杉(Tax us yunnanensis Cheng et L.k.Fu)的树皮中分离到一种内生真菌可产Taxol (只做了TLC,未报道其含量);Strobel(1996),Li& Strobel(1996)等又报道了从红豆杉树与其他植物中分离到了多种可产Taxol的内生真菌,证明了其生物多样性,产量范围为95～1081ng/L,最高者可达μg级,距生产水平还有一定差距。我们经采样分离当年就获得了3株可产Taxol的内生真菌,培养分析其Taxol含量可达51.06～125.7μg/L,后经几年来的生物工程手段选育,该菌种的产量水平现又提高了几倍。现将Taxol产生菌的分离方法与测试结果,简单报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本的采集 以黑龙江省东宁、绥棱、穆棱林业局的百年以上东北红豆杉(T.cuspi data Sieb. et Zucc)做为采样对象,按不同生态区域、不同方位、不同性别、不同部位及粗细大小不等的树干的树皮、韧皮部和小枝等分别取样,妥善处理后运回实验室。
1.1.2 培养基 分离用培养基:PDA(中国科学院微生物研究所《菌种保藏手册》编写组,1980)、S27 (Stierle et al.,1993)固体培养基;发酵用培养基:S27 (Stierle et al.,1993)液体培养基。
1.1.3 有关溶液 萃取液:氯仿与甲醇混合液(10∶1,体积与体积比);展开剂:氯仿与甲醇混合液(7∶1,体积与体积比);显色剂:含1%香草醛的浓硫酸溶液(重量与体积比)。
1.1.4 紫杉醇的标准品 购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 内生真菌的分离 将东北红豆杉树皮和韧皮部用无菌剪刀剪成1cm×1cm的小块,枝条剪成1～1.5cm的小段;稍粗的木段再用无菌刀劈成片,经80%的酒精表面消毒5～15min,或用0.1%的升汞溶液处理1～5min,然后用无菌水冲洗,分别栽种于含有东北红豆杉树枝浸汁的PDA固体培养基和S27固体培养基平皿上,放置于25℃恒温箱中培养,待长出菌落后,按无菌操作程序挑出,经扩培后用无菌水适度稀释,再通过固体平皿分离单菌落,经几次分离纯化,将最后分离获得的单菌落转接于上述固体斜面管中恒温培养,之后低温保藏备用。
1.2.2 菌株的培养及其发酵产物的萃取 ①菌株的液体培养:将上述分离到的内生真菌经无红豆杉枝叶浸汁的培养基连续传代10代,再做2次活化培养,分别转接于盛有无红豆杉浸汁的S27液体培养基的三角瓶中,28℃恒温振荡培养14d。②发酵产物的萃取:收集培养物先经3000r/min离心15min,并将沉淀物捣碎后重新与上清液混合,再经3500r/ min离心12min,保留上清液,用等体积的氯仿与甲醇混合液(CHCl32MeOH,10∶1,体积与体积比)萃取,收集有机相,然后置30℃下鼓风干燥或旋转蒸发器中,将蒸发后的萃取物溶于少量的氯仿中保存。
③柱层析提纯:将上述萃取物用CHCl3溶出后,上
收稿日期:2000-05-12
作者简介:周东坡,男,教授,博导。现从事食品与医药微生物遗传和微生物工程的教学与科研工作。
3黑龙江省自然科学基金资助项目(93-C-11);黑龙江省重大攻关课题(G96C20-4-1)
81微生物学杂志2001年3月第21卷第1期 JOURNAL OF MICROBIOLO GY Mar.2001Vol.21No.1
60～100目的硅胶柱,做进一步提纯分离。
1.2.3 Taxol产生能力确证 ①薄层层析分析:将上述各分离到的内生真菌的培养物反复萃取或又经柱层析获得的产物干燥后,用乙腈溶解,点于10～40μm粒度的硅胶薄层层析板上,进行层析。使用氯仿2甲醇(7∶1,体积与体积比)为展开剂展开。层析后立即用含有1%香草醛的浓硫酸喷雾显色,观察其特异蓝色是否出现。②高效液相色谱(HPLC)分析:在卫生部重点开放实验室哈尔滨医科大学临床药学药物研究所完成。用Sigma公司产的Taxol 标准品做对照,将上述各菌柱层析产物溶解后进样,根据标准品换算出发酵液中Taxol的含量。
2 结果与讨论
2.1 本实验中先后分离得到2000株左右的真菌,经初步鉴定分属20余种。由于采样经过认真处理,表面严格消毒并无菌操作,从东北红豆杉树中分离又经纯化而获得形态稳定一致的真菌,故均可确认为东北红豆杉的内生真菌。
2.2 上述真菌经发酵培养后,其发酵液的萃取抽提物经TLC显色后,有3株真菌(HQ33,HQ48, HQ54)能产生Taxol特征性蓝色斑点,而且其Rf值均与Taxol的标准品相同
(见图1),表明这3
株内生
真菌可产生Taxol;对这3株菌的代谢产物柱层析后做HPLC分析,结果均有与Taxol标准品保留时间一致的峰出现(见图2),经计算其产量范围为51.06～125.70μg/L。
2.3 因为这些菌株均经无红豆杉枝叶浸汁的培养基连续传10代后再进行发酵培养(发酵培养基中也无该浸汁),所以其Taxol完全是来自于菌体的代谢产物,而与原树木毫无关系。菌株的产Taxol水平远高于Taxom yces andreanae(Stierle et al.1993),也图1 紫杉醇产生菌发酵液提取物薄层层析图
图2 紫杉醇标准品(A)及紫杉醇产生菌发酵液 提取物(B)的HPLC图谱
高于Strobel等近期的报道(Strobel et al.1996)。
经4年来的选育改造,菌株的产量水平又提高了几倍。相信经过生物工程的多种手段继续选育,其产量提高的潜力还是很大的,用微生物发酵法工厂化生产Taxol的前景还是乐观的。
2.4 将分离得到的3株Taxol产生菌与Tax2 om yces andreanae相比较,菌丝体白色,均具有粗细2种菌丝,高度分枝,有隔膜,未见锁状联合与桶孔隔膜,可形成菌核。生长迅速,在几种不同的培养基中3～5d均可长满平皿,可形成孢子,但粗细菌丝的直径均大于后者,形成的色素也有明显差异。本文报导的这3株内生真菌的分类地位,有待进一步研究报道。
参 考 文 献
[1] 中国科学院微生物研究所《菌种保藏手册》编写组.菌种保藏手
册[M].北京:科学出版社,1980,114.
[2] 吴洁,魏永平.红豆杉血流成河[N].科技日报,1996,3.30.
[3] 邱德有,黄美娟,方晓华等.一种云南红豆杉内生真菌的分离
[J],真菌学报,1994,13(4):314～316.
[4] Jones WB,Schneider J,Shapiro F et al.,Treatment of resistant
gestational chorlocarcinoma with Taxol:A report of two cases[J].
Gynecol Oncol,1996,61(1):126～130.
[5] Li J Y,Strobel G,sidhu R,et al.,Endophytic taxol2producing fungi
from bald cypress,Taxodi um distichum[J].Microbiology,1996, 42:2223～2226.
[6] Pulkkinen J O,Elomaa L,Joensuu H et al.,Paclitaxel2induced
apoptotic changes followed by time2lapse video microscopy in cell lines established from head and neck cancer[J].J Canc Res and Clin Oncol,1996,122(4):214～218.
[7] Schiff P B,Fant J,Horwitz S B,Promotion of microtubule assem2
bly in vitro by taxol[J].Nature,1979,277:665～667.
[8] Slichenmyer W J&Hoff D D V,Taxol:A new and effective anti2
cancer drug[J].Anti2Cancer Drugs,1991,2(6):519～530. [9] Stierle A,Strobel G,Stierle D,Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae.an endophytec fungus of pacific yew[S].Science, 1993,260:214～216.
[10]Strobel G A,Stierle A,Hess W M,Taxol tormation in yew2Taxus
[J].Plant Sci,1993,92:1～12.
[11]Strobel G,Stierle A,Taxomyces andreanae,A Proposed new taxon
for a Bulbilliferous Hyphomycete associated with pacific yew (Tax us brevif olia),1993.
[12]Strobel G A,Hess W M,Ford E et al.,Taxol from fungal endo2
phytes and issue of biodiversity[J].J Ind Microb,1996,17:417～423.
[13]Vidensk N,Lim P,Campbell A et al.,Taxol content in bark,
Wood,Root,Leaf,twig and seedling from several Taxus species [J].J Nat prod,1990,53:1609～1610.
[14]Wani M C,Taylor H L,Wall M E et al.,Plant antitumor agents
VI.The isolation and structure of taxol,a novel antileukemic and antitumor agent from Tax ux brevif olia[J].J Am Chem Soc, 1971,93:2325～2327.
[15]Woo H L,Swenerton K D&Hoskins P J,Taxol is active in plat2
inum2resistant endometrial adenocarcinoma[J].Ain J Clin Oncol, 1996,19(3):290～291.
(下转32页)
91
1期 周东坡等:紫杉醇产生菌分离的研究
能自养的硫杆菌细胞表面的累积。形成金属硫化物。其重量为细胞干重的25%。
2.1.3 氧化还原作用 氧化还原分别是金属价态的增加或减少。常规下氧化还原反应需要有代谢作用的细胞参加(但有些金属离子还原也不一定由活细胞完成,也可能是被动发生的)。氧化还原作用聚集金起举足轻重的作用。
2.1.4 甲基化和脱甲基化作用 由特定的细菌用以转运其生活环境中金属的一种方式。使溶液和土壤中的某些金属变成气态。
2.2 被动发生的聚金作用
2.2.1 胞外络合作用 当细菌细胞产生某些物质并分泌到胞外时,有些物质具有络合金属的能力。它们可以是鳌合剂。鳌合剂的产生需要活性代谢的细胞或产生聚合物有关酶的存在,一经形成后,这些物质聚金是被动发生的。
2.2.2 金键合到细胞壁上 金连接到细胞壁上可有3种作用机制:即离子交换反应、沉淀作用和络合作用。蜡状芽孢杆菌孢子具有键合金的细胞壁结构。细胞壁聚集金的性质和能力与细胞壁的化学成分和结构有关。其细胞壁有一层很厚的网状的肽聚糖结构,是细胞壁表面存在的磷壁酸质和糖醛酸磷壁酸质在接到网状的肽聚糖上。磷壁酸质的磷酸二脂和糖醛酸磷壁酸质的羧基使细胞壁带负电荷,具有离子交换的性质,能够与溶液中带正电荷的金离子进行交换反应。这就是细胞壁聚集金的主要作用机制。
3 讨 论
被动发生的聚金作用不但在生物矿化过程中起举足轻重的作用,而且在处理含重金属及放射性金属的工业废液中,也具有重要的实用价值。因这些工业废液的组成成分相当复杂,如溶液的成分、含量以及p H值等波动很大,活细菌很难适应这种变化。若采用死细胞体制备其衍生物,可克服使用活细胞固有的不利条件。今后可开发更多有效的生物吸附剂,如从细胞制备衍生物来处理金属废液,既降低成本,又可减少对环境的污染,在保护人类和动植物的健康和回收贵重金属资源等方面有潜在的经济效益和社会效益。
参 考 文 献
[1] 汤显春等.金矿床区蜡状芽孢杆菌孢子数与金矿化关系[J].微
生物学杂志,1999,19(4):17～21.
[2] News and Views.Biomineralization bacteria and the midas touch
[J].Nature,1992,375:6377.
[3] 汤显春等.广西四川金矿床区土壤样品中蜡状芽孢杆菌的分离
和鉴定[J].华中师范大学学报,1999,33(2):271～277.
[4] Strandberg G.w.er.al.Ia Enbironmental Speciation and Monitor2
ing Neceds for Trace Metal2containing Substance form Energy Re2 lated Processes,u.s.Department of commerce,National Bureau of standards,Washington.D.c,1981,27.
STU DY ON BIO2MINERAL IZATION—THE G OLD ACCUMU LATION R OL E OF Bacillus cereus
Tang Xianchun et al.
(Wuhan Inst.of Virology,Academia Sinica,Wuhan430071)
Abstract Bio2mineralization(The gold accumulation principle of Bacillus cereus)is discussed.Biotic activities had great influ2 ence on mineral efflorescence,filtering,and deposition.G old accumulation by B.cereus was mostly associated with chemical com po2 sition and structural function of its cell https://www.wendangku.net/doc/b710917741.html,monly,its cell wall had a thick netty structure composed of peptidoglycans,polysac2 charides,nucleic acids,and protein structure.Moreover,at the surface there are teichoic acids,and teichuronic acids linked to the netty peptidoglycan.Due to phosphate diester of teichoic acid and carboxyl group of teichuronic acid,the cell wall has negative charges and the character of ion exchange.It could exchange with positive metal ions in the solution.The process is the mechanism that primarily leads the gold accumulation by B.cereus.
K eyw ords Bio2mineralization,cell wall of B acillus cereus,gold accumulation.
(上接19页)
ISOLATION OF TAX OL PR OD UCING FUNGI
Zhou Dongpo et al.
(Coll.of Life Sci.&Tech.Qiqihar Univ.Qiqihar161006)
Abstract More than20different endophytic fungal species were isolated from bark,twig and small limbs of Tax us cuspidata Sieb.et Zucc in1993.Three s pecies(HQ33,HQ48,and HQ54)of these endophytic fungi demonstrated producing anticancer drug of Taxol,measured by thin layer chromatography(TLC)and high performance liquid chromatography(HPLC).The content of tax2 ol in the fungal fermentation solution was from51.06to125.70μg/L.
K eyw ords Endophytic fungi,taxol,Tax us cuspidata Sieb.et Zucc,TLC,HPLC.
23微 生 物 学 杂 志 21卷
紫杉醇提炼步骤
紫杉醇规模生产工艺及方案（1500吨/年规模） 一、项目规模生产工艺方案 1、紫杉醇概述紫杉醇具有复杂的化学结构，母核部分是一个复杂的四环体系，有许多的功能基团和立体化学特征，化学名称为：5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯，分子由3个主环构成二萜核，上连1个苯异丝氨酸侧链，分子中有11个手性中心和多个取代基团，分子式为C47H51NO14，相对分子质量853.92，元素百分比（%）C：66.41，H:6.02，N:1.64，O:26.23。紫杉醇结构式为：紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。甲醇制3mg/ml 的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每咸的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外（﹥90%），经肾清除只占总清除的1%~8%。 红豆杉浸膏
1.1操作过程： （1）浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 （2）浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。（3）萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 （4）干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为-0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 1.2紫杉醇粗制工艺步骤 1.2.1操作过程 （1）配料、装柱：将紫杉醇浸膏约100kg按物料、重量比1：1的比例加入100-200目的硅胶搅拌均匀，真空干燥，装柱。 （2）一次层析、浓缩：配制不同极性的淋洗液（乙酸乙酯：正已烷
第6章紫杉醇生产工艺
第六章紫杉醇的生产工艺 6.1 概述 6.1.1 紫杉醇类药物 1、紫杉醇 紫杉醇（Paclitaxel，Taxol?）的化学名称为5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,13α-五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-[(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯] ，英文化学名称为13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-benmethyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate。 紫杉醇具有复杂的化学结构，属三环二萜类化合物，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成（图6－1）。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式为C47H51NO14，分子量为853.92，元素百分比为C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。紫杉醇难溶于水，易溶于甲醇、二氯甲烷和乙氰等有机溶剂。 图6－1 紫杉醇的化学结构 2、多烯紫杉醇 多烯紫杉醇（多西他赛，Docetaxel，Taxotere?，图6－2）是在开展紫杉醇半合成研究过程中发现的一种紫杉醇类似物，两者仅在母环10位和侧链上3'位上的取代基略有不同。多烯紫杉醇的化学名称是5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,10β,13α-六羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2′R,3′S) -N-叔丁氧羰基-3′-苯基异丝氨酸酯]·三水合物，英文化学名称为-13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-tertbutyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,10β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate 。分子式为C43H53NO14·3H2O，相对分子质量为861.9。 1985年，法国罗纳普朗克乐安公司（Rhone-Poulenc Rorer）公司和法国国家自然科学研究中心（CNRS）以10-DAB作为母环骨架，通过半合成方法成功地合成出多烯紫杉醇，目
紫杉醇的合成
苏州大学研究生考试答卷封面 考试科目: 有机合成考试得分 院别: 材料与化学化工学部专业: 分析化学 学生姓名: 饶海英学号: 20114209033 授课教师: 考试日期: 2012 年 1 月8 日 天然抗癌药物紫杉醇的合成进展 摘要:本文对多烯紫杉醇的合成的各种合成方法进行了综述。 关键词:多烯紫杉醇合成抗癌 多烯紫杉醇(daxotere) 商品名为多西她赛(Docetaxel) , 化学名为[ 2aR-( 2aα, 4β, 4aβ, 6β,9α, ( aR3, βS3) , 11α, 12α, 12aα, 12bα) ] -β- [ [ (1, 1 2二甲基乙氧基)羰基]氨基] -α-羟基苯丙酸[ 12b-乙酰氧-12 -苯甲酰氧-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9,10, 11, 12, 12a, 12b -十二氢-4, 6, 11-三羟基-4a, 8,13, 13 -四甲基-5-氧代-7, 11-亚甲基-1H-环癸五烯并-[ 3, 4 ]苯并[ 1, 2-b ]氧杂丁环-9-基]酯,就是法国罗纳普朗克·乐安公司开发的半合成紫杉醇的衍生物,它对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。其作用机制就是通过与肿瘤细胞微管蛋白结合, 加强微管蛋白的聚合、抑制微管解聚,最终形成稳定的非功能性微管束, 从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂与增殖[1-3] 。 商业化生产的紫杉醇类抗癌药物大多采用半合成方法,这就是现阶段最具经济性与可操作性的合成方法。多烯紫杉醇的半合成方法就是利用从红豆杉属植物的针叶中提取的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (10-DAB ) ,通过选择性保护部分羟基, 然后在10-DAB C13位的羟基上连接合成的手性侧链, 再去掉保护基团得到。其中以多烯紫杉醇C13位侧链的合成以及该侧链与选择性保护的母核10-DAB进行酯化反应最为重要[4-5] 。 紫杉醇的构效关系已经被众多学者所研究与总结。具有游离羟基的C13位侧链,C2与C4位的酯基,C4、C5位四元含氧环及紫杉烷的刚性环结构对抗癌活性都起着很重要的作用。 1988年,Potier等从欧洲紫杉(Taxus baccata)中分离得到10-去乙酰巴卡亭(Baccatin) Ⅲ( DAB),DAB 已被成功地用来半合成紫杉醇,并已工业化生产[6]。半
抗癌药物紫杉醇研究进展 于凯
广西大学课程论文 论文标题：抗癌药物紫杉醇研究进展 课程名称：发酵生理学 学生姓名：于凯 学号：1108391006 专业：生物工程 学院：生命科学与技术学院 导师姓名：何勇强 学期：2011-2012/上 任课老师：庞宗文
抗癌药物紫杉醇研究展望 于凯 （生命科学与技术学院生物工程专业2011级；学号：1108391006） 摘要：紫杉醇是从红豆杉属植物中提取分离的一种次级代谢产物，是治疗乳腺癌、卵巢癌的特效新药。作为一种广谱、高效、低毒的抗癌药物，市场上紫杉醇供不应求。目前，有望通过化学合成、内生真菌发酵、植物组织培养、微生物发酵等方法工业化生产紫杉醇，达到缓解红豆杉资源短缺、市场药源紧张等现状。本文通过对红豆杉、紫杉醇发现、作用机理、生产现状等介绍，着重分析各种生产方法的利弊，并对紫杉醇的研究的市场前景作出展望。 关键字：红豆杉；紫杉醇；抗癌作用；研究展望 1红豆杉简介 红豆杉为红豆杉科红豆杉属，是一种濒临灭绝的天然抗癌植物，由于在自然条件下生长缓慢，再生能力差，所以很长时间以来，世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林基地。中国已将其列为一级珍稀濒危保护植物，联合国也明令禁止采伐。 红豆杉在全球共有十一种，分布于北半球温带至亚热带地区。全球资源总量及其有限，且常常散生分布于天然林中。目前我国共有四种和一个变种，即云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种）[1]。东北红豆杉主要分布在分布于中国的东北三省，在中国境内的红豆杉中，东北红豆杉紫杉醇含量最高，可达万分之三。 另外，我国还引种了曼地亚红豆杉，是于20世纪90年代中期从加拿大引种而来，原产于美国、加拿大，是一种天然杂交品种，其母本为东北红豆杉，父本为欧洲红豆杉。引种的曼地亚红豆杉生物特性稳定，没有发生变异，紫杉醇含量接近甚至高于原产地。 2 紫杉醇简介 2.1 紫杉醇的发现
紫杉醇提取工艺原理及操作技术
紫杉醇提取工艺原理及操作技术 紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。紫杉醇常规的提取工艺各个生产环节需控制在低温下操作，保证产品活性。各个工时段应尽快完成，可选水浴加热提取罐(含溶剂回收装置)，旋转真空浓缩机组(低温浓缩，1-2秒完成)，层析柱(精制分离)，板式真空干燥箱(低温干燥、速度快)。 紫杉醇提取操作过程 (1)浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 (2)浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。 (3)萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯(按物料：醋酸乙酯=1：1)，萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在 45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 (4)干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为 -0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 甲醇制3mg/ml的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每次的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外(﹥90%)，经肾清除只占总清除的1%~8%。 莱特莱德膜分离技术有限公司致力于膜分离和脱盐浓缩技术以及冷冻浓缩分离技术推广与工艺设备开发。通过多年的努力，已具备丰富的工程经验，为客户提供从小试、中试、工业化设备的工艺设计到设备生产、安装调试等一系列服务，能够提供整体解决方案和交钥匙工程，并成功应用于冶金、环保、制药、化工、食品等领域，赢得了客户和业内的良好口碑。
紫杉醇的提取和性能
紫杉醇的提取与性能 姓名:高海艳 学号:51151300057 专业:种子植物分类学
紫杉醇的提取与性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇(T axol)就是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1](结构如图一所示),就是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)与东北红豆杉(Taxus cuspidata)的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用,主要用于治疗卵巢癌与乳腺癌[2],被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉(Taxus cuspidata)幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材,幼苗的紫杉醇含量高低依次则就是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外,对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究,结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉,再次为红豆杉;而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]: 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取 液—液萃取 己烷沉淀
2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]: 1 紫杉醇就是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌与部分头颈癌与肺癌的治疗[12]。 2、紫杉醇作用于癌症的机制: 1979年,美国爱因斯坦医学院的分子药理学家Horwitz 博士阐明了紫杉醇独特的抗肿瘤作用机制:紫杉醇可使微管蛋白与组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂与防止诱导细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到抗癌作用(如下图所示)[7-11]。
紫杉醇的分离工艺
⒉紫杉醇的分离工艺 红豆杉针叶、树皮、根的采集 原料的干燥及研磨 初级萃取 次级萃取 水相（含键合相）有机相 色谱纯化 纯品紫杉醇 图11-4紫杉醇分离纯化工艺 紫杉醇的分离纯化工作开展较早，最早的分离巩义市1966年采用400根试管的逆流分配色谱法，从12g太平洋红豆杉树皮中提取了少量紫杉醇，历时两年，这种工艺十分琐碎，收率极低。随着相关科学技术的不断发展，分离工艺也获得了很大的改进。一般来说，紫杉醇的分离工艺可以分为粗提和纯化两个阶段，分离纯化过程可用图11-4表示。 ⒊紫杉醇粗提工艺 粗提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标产物，所得到的物料在进行后续的提纯直至获得纯品。粗提过程中初级萃取和次级萃取所采用的溶剂不同可以导致除去杂质不同，不同时期研究者对这两个过程的研究结果列于表11-5中。 目前用于提取紫杉醇的最普遍的初级萃取剂是乙醇（甲醇）和水，采用95:5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间35～60min；采用纯甲醇，所需萃取时间则为16～48h。在大多数情况下还需对甲醇初级萃取物进行次级萃取。一般是在初级萃取物中加入二氯甲烷和水的混合物，即液-液萃取，该方法可以有效地除去萃取液中50％（质量比）的非紫杉醇烷类物质。如果采用一个较为复杂的分离体系，发现所有的紫杉醇都在氯仿相中。 次级萃取除了可采用各种有机溶剂进行液-液萃取外，还可以采用固相浸取法和超临界流体萃取法。这两种方法的共同特点是有机溶剂用量少，减少了环境的污染。若用枝叶为原料，由于枝叶特别是枝叶中含有许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇的提取分离难度。这要求首先在甲醇粗提取物中加入低极性溶剂如正已烷以除去此物质，该法可除去红豆杉枝叶中多达72%的可溶于正已烷的杂质。 五、正相色谱过程为核心的紫杉醇分离纯化工艺
提取紫杉醇初分离工艺的研究
紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FA D批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍 存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性 等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。 关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文献 报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时，选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇 最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分 离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的 ，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫杉醇。 1 材料方法 1.1 材料 红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固 相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目），青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。 DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙 仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。 1.2 方法 1.2.1 液-液萃取称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比为 1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃 水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压蒸出回收，所得固相物溶解 于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。 1.2.2 固相萃取固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。 依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中
从紫杉植物中提取紫杉醇的简化方法
从紫杉植物中提取紫杉醇的简化方法 红豆杉Taxus又名紫杉，也称赤柏松，生于海拔1000～1200m处的山地，是世界上公认的濒临灭绝天然珍稀植物，从其根、皮、茎、叶中提取的紫杉醇taxol是目前世界上最有效的抗癌药物之一。全球每年大约需要1500～2500kg紫杉醇，而1 kg树皮仅能提取50～100mg。 10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ又称10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ，10-deacetylbaccatinⅢ，10-DABⅢ为有抑制肿瘤作用的紫杉烷二萜类化合物。Bissery等报道，可利用10-DABⅢ合成具有比紫杉醇更高抗癌活性的多烯他赛docetaxel。紫杉醇主要存在于树杆和树皮中，10-DABⅢ主要存在于树叶中，其含量大大高于紫杉醇的含量。 红豆杉是国家珍稀保护植物，生长缓慢，如果直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，不仅资源有限，而且不利于资源保护。以10-DABⅢ为原料采用酶催化半合成工艺方法来制备紫杉醇，可大大简化合成过程，使紫杉醇骨架修饰所需步骤更少，操作更简单，提高了紫杉醇合成的选择性和生产率，进而为在更大规模上进行紫杉醇生产提供了技术支持，最终使紫杉醇的化学合成半合成的产业化有了实现的可能。 目前文献报道从各种紫杉植物中提取紫杉醇的方法，均需经过繁冗的分离过程。本实验采用了一种适合于以各种紫杉植物树叶或树枝做原料，通过极性梯度溶剂萃取的方法逐步脱除大量不相干杂质，得到合成紫杉醇的前体10-DABⅢ的方法，然后通过反相层析柱加成，即可获得抗癌活性成分紫杉醇； 材料与方法 1 材料与仪器 南方红豆杉Taxus mairei枝叶取自浙江宁海红豆杉种植基地，8年树龄。10-DABⅢ对照品为Sigma公司产品，纯度98％；所用甲醇；乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、氯仿、正己烷、石油醚、乙腈等均为分析纯试剂。JJ一1精密增力电动搅拌仪，江苏金坛市江南仪器厂；SENCO R一201旋转蒸发仪，上海申顺生物科技有限公司；玻璃硅胶柱为2cm×40cm，杭州常盛科教器具厂；UV一2802PC／PCS型分光光度计，UNICO上海仪器有限公司；Sigma一3K18低温离心机4℃，转速18000rmin；LabAlliance高效液相色谱仪美国SSI公司。 2 实验方法 取南方红豆杉枝叶研磨成细粉，于燥保存。称取100g红豆杉细粉，45℃烘干，石油醚预处理，5L甲醇冷浸，辅以搅拌，超声40min，反复2次。浸渍液过滤，减压浓缩至100mL。加入75 mL正己烷萃取分液，重复操作2～3次。弃去正己烷层，萃余液旋干溶剂，制成浸膏。加入氯仿与水的混合液1：1反复提取。氯仿层减压浓缩至10～15mL上柱，用硅胶正相色谱柱分离。分段收集洗脱液，紫外监测，收集有效段合并浓缩，在甲醇／水中重结晶。 3 分析测试方法 采用反相高效液相色谱RP―HPLC方法检测。分析柱为Kromasil C18柱250mm×4.6 mm，5μm，流动相为乙腈-水30：70，流速为2.0 mLmin，每次进样体积为10μl，进样间隙用纯乙腈对柱子进行梯度冲洗。紫杉醇最大吸收波长为227nm，检测器测定波长为232nm，温度30℃，相关数据计算均采用峰面积归一化法。 结果 1 预处理 由于红豆杉枝叶中含有大量蜡质、植物色素诸如叶绿素等低极性杂质，故在提取前应首先加入低极性溶剂如正己烷、石油醚浸泡脱脂，以除去大量存在的此类非极性杂质，简化后续操作。该法可除去红豆杉枝叶中多达72％的极性比10-DABⅢ小且可溶于正己烷的杂质。 2 有机溶剂粗提 目前用于紫杉烷类物质提取的最普通的初级萃取剂是乙醇甲醇和水，Xu等采用的是体积比95：5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间为35~60min；而Hoke等和Powell等都选择的是纯甲醇，所需萃取时间为16～48h。将南方红豆杉枝叶的细粉在45℃烘干，甲醇浸渍，搅拌过夜。在搅拌的不同时间内其提取出的10-DABⅢ的含量。可以看出，有机溶剂粗提时的浸渍搅拌时间应以12h左右为佳。
紫杉醇
第七章 7.4 紫杉醇的生产工艺 7.4.1 概述 紫杉醇（Paclitaxel，Taxol?，图1），最早是由美国化学家Wani 和Wall于1971年从太平洋红豆杉的树皮中提取到的一种具有抗肿瘤活性的物质。它具有独特的抗癌机制，其作用位点为有丝分裂和细胞周期中至关重要的微管蛋白。紫杉醇能促进微管蛋白聚合而形成稳定的微管，并抑制微管的解聚，从而抑制了细胞的有丝分裂，最终导致癌细胞的死亡。紫杉醇1992年12月被美国FDA批准用于治疗晚期卵巢癌。1994年，批准用于治疗转移性乳腺癌，1997年FDA批准使用紫杉醇治疗爱滋病关联的Kaposi's恶性肿瘤；1998年和1999年，FDA又分别批准半合成紫杉醇与顺铂联合使用作为治疗晚期卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药。紫杉醇是近几年国际公认的疗效确切的重要的抗肿瘤药物之一。 -五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-a,13b,7a,4a,2b,20-环氧-1b紫杉醇具有复杂的化学结构，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式C47H51NO14，分子量853.92，元素百分比C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。化学名：5 [(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯] 紫杉醇的来源最初以天然提取为主，主要是从由红豆杉属植物的树皮中分离得到。红豆杉植物是生长极为缓慢的乔木或灌木，其树皮中紫杉醇的含量平均为万分之一点五，从中提取紫杉醇的收率大约为万分之一，这样制取1 kg紫杉醇就需树皮10吨，这种生产紫杉醇的方法严重破坏资源和环境。目前，包括我国在内的许多国家都已经禁止或严格限制用这种方法来生产紫杉醇。为解决紫杉醇的大量供应问题，人们曾探索通过组织和细胞培养、化学合成等方法制取紫杉醇。其中，化学合成是人们首先想到的解决紫杉醇药源问题的一条途径。这里的化学合成又有全合成和半合成之分。 如前所述，紫杉醇的分子结构十分复杂，分子中有众多的功能基团和立体化学特征，如此复杂的结构堪称是对化学合成的一个挑战。1994年，紫杉醇的全合成在实验室获得成功[1，2]。到目前为止，文献报道的紫杉醇的全合成路线共有3条，即1994年由Holton和Nicolaou研究组几乎同时完成的2条路线以及1996年Danishefsky小组报道的路线。紫杉醇的全合成中，反应步骤多达20—25步，大量使用手性试剂，反应条件极难控制，制备成本昂贵，虽然具有重要的理论意义，但不适合大规模工业生产。 为了避免合成紫杉醇复杂的母环部分，人们探索了半合成的制备方法。研究发现，红豆杉植物中除紫杉醇外，还有大量母环结构与紫杉醇类似的化合物，其中，最重要的是巴卡亭
紫杉醇的提取工艺设计研究方案
紫杉醇提取纯化方法的研究进展 紫杉醇是最早从红豆杉属植物中分离出来的三环二菇类化合物，是继阿霉素和顺铂之后最热点的抗癌新药。紫杉醇具有复杂的化学结构，分子由3个主环构成二菇核，分子中有11个手性中心和多个取代基团，母环部分是一个复杂的四 环体系，有许多功能基团和立体化学特征。分子式C 47H 51 NO 14 ，分子量853.92。 同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白 聚合,促进微管装配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌细胞纺锤体的形成,阻止 有丝分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,从而起到抗癌的作用。迄今为止紫杉醇是唯一促进微管聚合的新型抗癌药。这一新的发现引起了各国医药界的极大兴趣。现在已有包括我国在内的十多个国家批准了紫杉醇类药物的正式生产。目前有关紫杉醇研究的几个主要问题是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的临床应用(水不溶性问题的解决);紫杉醇的构效关系;紫杉醇的抗癌机理。紫杉醇的抗癌机理 1971年,Wani等报道了紫杉醇在一些实验体系中具有抗癌活性。1978 年,Schiff等发现紫杉醇在极低的浓度下(0.25μM)可以完全抑制Hela细胞的分裂,而且在对细胞4小时的培养过程中,对DNA、RNA和蛋白质的合成没有明显影响。
紫杉醇
紫杉醇 【中文名称】：紫杉醇 【英文名称】：Paclitaxel 【定义】：从紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中提出的一种化合物。是微管的特异性稳定剂，可促进微管的装配和保持微管稳定。 【所属】：属于萜类，双萜生物碱 【分子式为】：C47H51NO14，分子量：853.90 【结构式】： 【理化性质】：从甲醇析出针状结晶或无定形粉末；熔点213～216℃(分解)； [α]D20-49°(甲醇)；UV最大吸收(甲醇)：227，273nm(ε29800， 1700)；为白色结晶粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮 等有机溶剂 【结构特点】：含有酯键，对碱不稳定；含有环氧丙烷环，具有抗癌活性；含有的N原子处于酰胺状态，不显碱性；紫杉醇结构中无苷键，对酸 相对稳定；紫杉醇可与MnO2发生氧化反应，且不易还原。 【高效分离纯化紫杉醇的方法】 包括：ａ、萃取，以红豆杉为原料获得含有紫杉醇的提取物；ｂ、去除胶质，除去提取物中的胶质杂质；ｃ、分离纯化。 紫杉醇生产工艺如下： 红豆杉树皮粉碎（越细越好），８５％～９５％酒精，３５－５５℃热回流浸提三次，５０－７０℃真空减压浓缩至热测比重１．１～１．２
ｇ／ｍｌ，氯仿萃取，萃取液浓缩成膏状，得紫杉醇含量１％氯仿膏，将紫杉醇含量１％氯仿膏加氯仿溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，氯仿－甲醇梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量５～８％半成品，将紫杉醇含量５～８％半成品加丙酮溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，丙酮－石油醚梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量２０～２５％半成品，用丙酮－石油醚系统结晶３～４次，抽滤，５０℃真空减压干燥，得紫杉醇含量７５～８０％半成品，１６Ｍｐａ压力层析分离，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，目标段浓缩物丙酮－石油醚结晶，抽滤，干燥，得紫杉醇含量≥９９．５％成品； 去除胶质的过程为：高压硅胶层析柱层析去除胶质，同时将紫杉烷化合物分离为紫杉醇、三尖杉宁碱、７－表紫杉醇３部分。 【药理作用】 ①作用机理微管在维持正常细胞功能，包括有丝分裂过程中染色体的移动、细胞形成的调控、激素分泌和细胞受体的固定等具有重要作用。微管蛋白是微管形成的重要基础。紫杉醇就是作用于微管月踢缺管蛋白系统，可促进微管蛋白装配成微管，并抑制微管的解聚，从而导致微管束的排列异常，形成星状体，使仿锤体失去正常功能，导致瘤细胞死亡闭。 ②药效学紫杉醇主要影响L一1210细胞的周期移行，使细胞阻碍断在q期和M期[51。使瘤细胞不能分裂变大，井出现多核细胞，阻断有丝分裂。 ③药效学紫杉醇静脉给药后广泛分布于各组织中，其中肝、脾、肺及大肠中放射性较高小肠、脂肪及骨髓中次之，脑及肌肉中放射性较低。给药后12h尿排泄多于粪中排泄量，给药后72h尿粪中的总排泄量占给药量的74%，.. 胆汁中排泄量在给药后3h即占给药量的59.4%，.. 终末半衰期平均为5.3-17.4ho ④量效关系紫杉醇存在个体差异，AUC波动范围较大[6,7]，在 4.367 一 16.0128mg几.h之间，疗效与剂量无多大关系，而疗效与用药后的即刻浓度(Cmax)有一定关系。提示为了改善病人的疗效而进行血浓度测定，并根据监测结果指导合理用药是必要的。
紫杉醇载体的研究进展
紫杉醇载体的研究进展 （20150932140 张焕乐） 摘要：紫杉醇作为一种抗肿瘤的化疗药物，在卵巢癌、乳腺癌等方面有良好的治疗作用，但其水溶性差，毒副作用大，临床使用受到限制。本文通过查阅文献，总结了一些紫杉醇脂质纳米粒、脂质体、微球、自微乳、胶束、凝胶等载体的新剂型，这些新剂型的研究为今后的临床应用提供了依据。 关键词：紫杉醇脂质纳米粒脂质体微球 紫杉醇（paclitaxel，PTX）是红豆杉属植物中提取的一种具有抗癌活性的二萜类化合物。能抑制微管蛋白解聚，保持其稳定，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂，最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。基于紫杉醇对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高的活性，人们开始将紫杉醇应用于抗肿瘤治疗的研究，并于1992年获得批准上市。目前，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈部癌症以及难治愈的前列腺癌等的都有良好的治疗作用[1,2]。 紫杉醇药代动力学非线性，在整个6h或24h滴注过程中血药浓度增加，输液一旦停止，血药浓度即开始下降；紫杉醇会出现严重的急性过敏反应，少量病人出现明显的心血管不良反应，包括心肌梗塞、房颤、轻度充血性心衰、室性和室上性心动过速、室性心律不齐等，此外几乎所有病人全部脱发，1.4%-30%的病人发生3或4级粘膜炎，最主要的是轻度恶心、呕吐和局部静脉炎(4%-64%)。年龄、以往的治疗或接受紫杉醇的总累积剂量似乎对该药的耐受性无影响[3]。 随着近年药物代谢动力学的发展，人们通过将紫杉醇依附于脂质纳米粒、脂质体、微球、自微乳、胶束、凝胶、水溶性前体药物、混悬剂、纳米晶等载体制备成新的剂型，研究紫杉醇在体内代谢的情况，取得良好效果。现就依据近几年的文献报道，将部分紫衫醇载体的研究情况总结如下。 1.紫衫醇脂质纳米粒 纳米粒是一种粒径在10 ～1000 nm 的固态胶体颗粒，包括纳米囊、纳米球、纳米脂质体、纳米胶束、纳米乳、纳米凝胶等多种类型。具有物理稳定性好、粒径小、被动靶向等诸多优点，可改变药物在体内的药动学特征，增加药物在靶器官的分布，利于药物吸收和提高生物利用度，从而提高疗效、减轻毒副作用。 由美国生物科学公司研制的新型紫杉醇制剂ABI-007（Abraxane，Capxol），以人血白蛋白作为共聚物形成紫杉醇白蛋白纳米悬浮液。ABI-007 将紫杉醇和人血白蛋白经高压振动技术制成纳米微粒紫杉醇冻干粉剂，由于无助溶剂Cremophor EL，滴注时间缩短，用药前不需要考虑做预防过敏反应的预处理治疗[4]。脂质纳米粒作为抗癌药物载体，能增加与肿瘤组织的亲和性，增加药物被肿瘤细胞的摄取量，降低用药剂量，提高疗效和降低不良反应。刘丹等[5]利用体外释放度实验研究紫杉醇脂质纳米粒溶液与市售普通紫杉醇注射液释放速度，结果脂质纳米粒溶液明显降低，且在初始突释阶段（0.5h内）的释放量比普通制剂高。 2.紫杉醇脂质体 脂质体是利用磷脂将药物包裹，从而实现药物的缓慢释放，降低药物毒性，提高细胞亲和性和靶向性的目的。根据功能、靶向的手段等不同，脂质体也衍生出很多不同的类型，如长循环脂质体、p H 敏感脂质体、免疫脂质体、磁靶向脂质体等，不断向多功能化和精细靶向方向发展。紫杉醇多是由于靶向性不强，导致药物在正常组织的蓄积，从而对正常细胞产生损害。因此，提高药物对肿瘤细胞的靶向性，能够降低紫杉醇的毒性作用。崔红丽等[6]的临床结果表明，紫杉醇脂质体与紫杉醇治疗效果相当，但前者相关毒性及某些过敏反应的
紫杉醇
紫杉醇 1.紫杉醇的发现和历史 2.紫杉醇的化学结构 3.紫杉醇的提取分离方法 4.紫杉醇的合成研究 5.常见的几种紫杉醇药物 6.个人感想 1.紫杉醇的发现和历史 紫杉醇是红豆杉科红豆杉属植物的次生代谢产物，这类植物主要分布于北半球的温带至亚热带地区，全世界共有11种。最初，紫杉醇是从短叶紫杉（Taxus brevi folia）的树皮中分离获得的，在它的抗癌作用被发现之前，林木工人通常把它砍了当柴烧或者用来做篱笆。早在1856年德国科学家Lucas·H开始对Taxus baccata Linn(浆果红豆杉)进行化学研究，并从其叶片中提取出粉状碱性成分Taxine,但在随后的100多年里没有多大的研究进展。直到20世纪60年代，随着光谱技术的飞速发展，科学家才开始对红豆杉属的植物有了比较深入的研究。20世纪初，人们发现美国西部山区的一个有一片红豆杉林的小城镇中的居民很长寿，他们的寿命最短的在95岁以上，绝大多数的人寿命超过100岁，而且百岁老人随处可见。科学家到那里考察发现当地居民除了两个与其他地方居民不同的生活习惯外，其余的都差不多。一是当地居民喜欢采摘山林中的红豆杉树叶泡茶喝；二是经常去红豆杉林中散步或运动。这种现象引起了科学家对红豆杉的研究兴趣，他们从红豆杉树皮中提取出一种对许多类型的肿瘤细胞有细胞毒作用的提取物——紫杉醇。后来研究表明其化学结构为紫杉烷类中的一种四环二萜类化合物【1】。 1962年8月，在美国农业部任职的植物学家Barclay响应由美国国立癌症研究所（National Cancer Institute ,NCI）发起的植物提取物抗癌活性成分筛选研究,收集了7Kg太平洋紫杉的树皮寄回了NCI。这些样品后来经NCI北卡罗莱纳州“研究三角学院”（Research Triangle Institute ,RTI）分馏实验室的美国化学家Wani博士和Wall博士。他们分离提取得到紫杉醇的粗提物，在筛选实验中他们发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高的抑制活性，有强烈的KB细胞毒作用及抗小鼠肉瘤和抗白血病活性。1966年9月，他们分离出了一个有活性得到纯化合物，并确定了其分子式为C47H51NO14，但是得率很低，只有万分之零点四。1967年6月，Wall将这个化合物命名为紫杉醇（taxol），-ol表示醇类（因为他们确信其有一个醇羟基），而tax-指它来自taxus。1971年，Wani和Wall与杜克大学（Duke University）的化学教授Mcphail合作，研究分析并确定其结构。1971年5月，他们在美国化学会杂志（Journal of the American Chemical Society ,JACS）上报道了这个初显抗
紫杉醇提取工艺优化研究
紫杉醇提取工艺优化研究 赵万年 S1315004 立体依据 紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是Wani等[1]于1971年首次从短叶红豆杉(Taxus Bravifolia Nutt.)中分离得到的一种复杂的次生代谢产物，属二萜类化合物。其抗癌机理独特[2]，活性广谱高效，是目前所发现的惟一一种具有促进微管双聚体装配成微管, 使微管稳定, 从而阻碍细胞分裂, 将癌细胞停止在G2晚期或M期，最终导致癌细胞死亡[3]，抑制肿瘤生长的作用。由于紫杉醇的作用机理独特、疗效显著，因此已用于转移性卵巢癌、乳腺癌等的治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 虽然现在开发了多种紫杉醇的制备方法，利用半合成、全合成、生物合成、真菌发酵、植物组织细胞培养等技术手段获得紫杉醇的研究工作也取得了较大的进展［4-6］，但是要实现这些技术的工艺扩大和工业放大生产还存在一些问题，而从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此目前从植物中直接提取分离仍是紫杉醇的主要制备方法。但是，紫杉醇在植物中的含量非常低(含量最高的红豆杉树皮也只有万分之几)[7]，且类似物多，具有热敏性，产物在中间过程中易于分解、变性，不同产地、不同季节的植物资源成分相差甚远，因此分离提取工作难度很大。 目前紫杉醇的提取纯化工艺有溶剂萃取法、固相萃取法、制备色谱法、膜分离法、超临界萃取法、离子交换法、键合物解离法、药理作用靶点法和化学反应法[8-10]。这些工艺各有优缺点，其中溶剂萃取法和制备色谱法是最简单、最常用的方法，也已经成功应用于工业生产，但仍需改进。本课题以乙醇为提取溶剂，探求从南方红豆杉树叶中浸取紫杉醇的最佳提取条件，旨在为南方红豆杉这一药用植物资源的开发与利用提供试验依据。 研究目标 采用乙醇浸提方法，考查粉碎度、乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间
紫杉醇研究进展
紫杉醇的研究进展 1.概述 紫杉醇是从紫杉(Taxus brevifolia)树皮中所提得，是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物。1971年由Wani 等首先从短叶红豆杉中提取分离出来。于1992年12月紫杉醇被FDA批准上市，目前紫杉醇已成为世界公认的强活性广谱抗癌药物。然而由于这种天然化合物资源极其有限，严重的限制了其研究和应用的进度。同时尖锐的供需矛盾也在医学、化学和植物组织培养领域中引起了一场非同寻常的广泛研究，以增加这种化合物的来源和寻找高效、低毒、来源丰富的紫杉醇类似物。已成为目前全球销售量排名第一的抗肿瘤药物。它的作用方式和药理及临床特性均具有独特之处,被称癌症化疗上的新突破。 紫杉醇，英文名称Paclitaxel，别名泰素，紫素，特素，化学名称5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]，分子量853.92，分子式C47H51NO14。熔点为213~216℃。紫杉醇具有高度亲脂性,不溶于水,血浆蛋白结合率89%~98%,终末半衰期平均值为 5.3~l7.4h, 主要经肝脏代谢,肾脏清除仅5%。[1] 结构式如下： 2紫杉醇的药用植物资源及药源植物中有效含量研究 红豆杉为红豆杉科植物,也称紫杉,全世界约有11种,主要分布于北半球,我国有4种1变种,主要分布于甘肃、陕西、安徽、湖北、湖南、广西、贵州、四川、云南等省区[2-3]。研究表明[4],植物中紫杉醇含量在万分之二以下,极其低微。短叶红豆杉树皮中紫杉醇含量最高,其次为中间红豆杉树皮;东亚产四种红豆杉中,云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量最高东北红豆杉和美丽红豆杉次之,短叶醇含量则
从天然植物中提取紫杉醇原料的最新工艺
Patent No. U.S. 6,759,539 Assignee: Chaichem Pharmaceuticals International, Laval, Canada Title or Subject: Process for Isolation and Purification of Paclitaxel from Natural Sources This is the first of three patents covering paclitaxel 10a that is a naturally occurring compound found in the bark of yew trees and has been shown to be useful in treating various cancer tumours. The amount of 10a obtained from the bark is low, and hence, large amounts of biomass and solvents are needed to obtain reasonable quantities. Synthetic procedures are under investigation. This patent, covering 10a and its derivatives, describes an improved process to extract 10a from twigs and needles of coniferous trees of the genus T axus. An earlier process from the same company to extract 10a involves several chromatography stages and recrystallisations, and it is not particularly amenable to large-scale production. The new procedure involves an initial aqueous extraction step to remove soluble impurities from the biomass. This is then followed by extraction of 10a with methanol, followed by its isolation by chromatography and crystallisation. The various stages of the process are summarised below: A porous bag containing twigs and needles of the tree is immersed in distilled water for 3 h at room temperature, the water is drained from the bag of biomass, and MeOH is added to the biomass in the tank at room temperature, the extract is collected and the solution concentrated by distilling off the MeOH, the crude solid is precipitated by addition of aqueous NaCl solution, collected by filtration, and then dried, the solid is dissolved in Me2CO, leaving resins and pigments, hexane is added to the solution to produce an oil that is collected and purified by low-pressure column chromatography at least once, the purified oil is dissolved in acetone and cooled to give crystals of 10a, and these may be recrystallised to improve the purity. --------------------------------------------------------------------------------