pet表达系统

对于全世界许多研究者，Novagen 的pET 系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T7 启动子之下，因此在加入T7 RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到pET 载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入IPTG 诱导表达；也可通过l CE6 感染原始克隆宿主菌来提供T7 RNA聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统( 如tac 、lac 、trc 、pL) 有困难的许多基因已经在pET 系统中稳定克隆和表达。T7 RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50% 。

新开发的T7 驱动表达技术以pETBlue TM 系统为代表。pETBlue 载体包括了pET 用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒DNA操作的方面更为方便。

pETBlue TM 系统：新一代T7 表达载体

pETBlue 载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和T7 驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌tet 启动子的反义方向插到lacZ a - 肽编码区，因此可进行蓝/ 白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的T7 转录和翻译信号使表达成为可能。与标准pET 载体一样，通过转化λDE3 溶原菌并用IPTG 诱导或通过l CE6 感染原始宿主菌生产目标蛋白。

优点

·蓝/ 白斑筛选，便于克隆

·高拷贝数，质粒DNA高产

·以AccepTor TM 载体或perfectly Blunt a 载体形式提供，便于快速PCR 克隆

·目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性

·表达水平与经典pET 载体相同

·用Tuner TM (DE3)pLacI 宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。

PET 系统：大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌

pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点

·是原核蛋白表达引用最多的系统

·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低

·真正的调节表达水平的“变阻器”控制

·提供各种不同融合标签和表达系统配置

·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌

·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物

·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化

阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pETBlue TM 系统

T7 驱动的严紧控制表达、蓝/ 白斑筛选、质粒产量高

新颖的pETBlue TM 系统兼有广受欢迎的蓝/ 白斑筛选载体所具有的通过目测确定重组体和高质粒拷贝数，以及pET 载体严紧控制的高蛋白表达等特点。蓝/ 白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子( tet ) 驱动lacZ a - 肽表达而实现，而目标基因表达由相反方向的T7 启动子驱动。目标序列插入多克隆位点（MCS ）破坏了lacZ a - 肽的表达，在NovaBlue 菌株中当存在x-gal 时产生白菌落表型，而带有非重组载体的菌落变蓝。由于T7 驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于tet 启动子的反义方向，因此实际上没有目标序列的基础表达。相对于pET 载体，pETBlue 质粒上高拷贝PUC 复制起点增加了质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。

如果插入序列相对于T7 lac 启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求，pETBlue 载体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达：用l CE6 （l pL 启动子控制T7 RNA聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组pETBlue 质粒到宿主菌Tuner TM (DE3)pLacI 或Origami TM (DE3)pLacI 中并用IPTG 诱导。这些宿主菌染色体上带有一拷贝lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因，并通过相容的pLacI 质粒提供足够lac 阻遏蛋白，以确保低水平的未诱导表达。Tuner 菌株的lacY状态使整个培养细胞被均一的诱导，并随IPTG 剂量诱导有不同的蛋白表达水平。Origami 菌株能够增强胞质中二硫键形成。

pETBlue-1

pETBlue-1 便于从5' 端编码开放读码框架的插入片段表达未融合的天然蛋白。该载体EcoR V (GA TA TC) 克隆位点位于强T7 基因10 核糖体结合位点（RBS ）附近。含有A TG 起始密码子或5' 端具有一个位置合适的G 核苷酸插入片段成为一个合适的大肠杆菌翻译起始位点。

pETBlue-2

pETBlue-2 提供了载体编码的A TG 起始密码子和多种下游克隆位点。MCS 5' 和3' 端两套各三个重叠平末端酶切位点便于将任何插入片段克隆到读码框中。在载体确定的读码框中，这些酶产生的平末端终止于密码三联体的不同位置。因此只要插入方向正确，任何插入片段可克隆到经过合适平末端酶切割的载体的读码框中。而且，任何不含内部终止密码子的插入片段都可与C- 末端HSV.Tag a 表位和His.Tag a 序列克隆到同一读码框中。

pETBlue TM PCR 克隆试剂盒

方便地将PCR 扩增DNA直接克隆到pETBlue 载体中

除了含有未切割质粒的pETBlue TM 系统，Novagen 还提供可立即插入PCR 产物的pETBlue 载体。已有两种试剂盒：AccepTor TM 载体试剂盒能够插入带单个3' -dA突出的DNA，如非校对DNA聚合酶( 如Taq DNA聚合酶) 的扩增产物；而perfectly Blunt a 克隆试剂盒设计用于克隆任何末端形式的插入片段。

在pETBlue-1 AccepTor 载体中表达插入基因的引物设计：

pETBlue-1 ：用5' 端A TG 开始的正义引物进行扩增，能够确保在大肠杆菌中有效合成蛋白的RBS 和翻译起始位点之间的最适距离。目标序列羧基端引物设计没有限制。

Met---

正义引物5' -A TG XXX ---

反义引物无限制

pET 系统概述

pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平

pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株

质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。

有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA- 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA- 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力lacIq 阻遏蛋白，NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外，Novagen 提供了λDE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的λDE3 溶原菌的另一替代方法是通过l CE6 感染提供T7 RNA聚合酶。虽然不如用IPTG 诱导λDE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

高严紧性T7 lac 启动子

除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，pET 系统中T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通T7 启动子和T7 lac 启动子。T7 lac 启动子在启动子区下游17bp 处含有一个25bp 的lac 操纵序列。该位点结合lac 阻遏蛋白能够有效降低T7 RNA聚合酶的转录，这样提供了在λDE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于lacI 的机制（除了抑制lacUV5 ）。含T7 lac 启动子的pET 质粒还具有它们自己的lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。

在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体/ 宿主菌组合。

控制诱导的表达水平

在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体/ 宿主菌组合控制T7 RNA聚合酶的基础表达提供不同严紧性，pET 系统还根据诱导物（IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。Tuner 和OrigamiB 宿主菌的lacY 突变使这种控制成为可能。

选择pET 载体

所有的pET 载体均来自pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类pET 质粒，即转录载体和翻译载体：

转录载体（包括pET-21 、pET-23 和pET-24 ）表达目标RNA，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）

翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和c 中带有克隆位点，分别对应于BamH I 位点的GGA、GA T 和A TC 三联体。

选择要点

选择用于表达的pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：

·所表达蛋白的用途

·所表达蛋白的已知信息

·克隆策略

pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采PCR 克隆策略时则有不同的考虑。LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

溶解性和细胞定位

考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是

有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白(Trx.Tag ) 融合。新推出的pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白--Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外，trxB 突变株AD494 和BL21 trxB ，或trxB/gor OrigamiTM 和OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（15 -25 ° C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭( 如使用Novagen 的蛋白折迭试剂盒) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。pET-31b （+ ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。

满足不同需要的融合标签

如果融合序列不影响应用，生产带有S.Tag 、T7.Tag a 、His.Tag a 和HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒，GST.Tag 、S.Tag 和T7.Tag 序列可用于亲和纯化。

使用S.Tag 和GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有CBD clos .Tag a 序列的pET-34b （+ ）和35b （+ ））。因为只有正确重新折迭的CBDs 结合到纤维素基质上，CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

Nus.Tag 、Trx.Tag 和GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。Nus.Tag 和Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的Origami 宿主菌相容。

各种融合标签和相应pET 载体见列表。一些pET 载体带有数个串联的融合标签，作为5' 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。pET-30 Ek/LIC 、pET-32 Ek/LIC 、pET-34 Ek/LIC 和pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。pET Ek/LIC 载体Combo 试剂盒包括所有 4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构

型。

pET NusA融合系统43.1

在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白

新推出的pET NusA融合系统设计用于克隆和高水平表达与495aa NusA（Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中4000 个以上蛋白进行可溶性建模，NusA蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同NusA融合蛋白进行的试验中，大于85% 的表达蛋白都是可溶的。pET-43.1 载体含有Nus.Tag 融合伴侣并与trx/gor 突变体Origami 和OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用pET-43.1 载体和这些trx/gor 宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。

优点

·高可溶性的N- 末端Nus.Tag 融合伴侣

·上游His.Tag a 、S.Tag 和可选择的C- 末端HSV.Tag a 、His.Tag 融合标签

·凝血酶和肠激酶切割位点

·多克隆位点位于所有读码框中

·与AD494 和Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭

pET 宿主菌株感受态细胞

所有pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。

（DE3 ）指宿主为λDE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5 启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为pLysS 和pLysE 的宿主菌带有编码T7 溶菌酶（为T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的pET 相容性质粒。带有pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7 RNA聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET 重组体。带有pLacI 的宿主菌产生额外的抑制pETBlue 和pTriEx 载体基础表达的lac 阻遏蛋白。λDE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的质粒。

B834 为BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。

BL21 应用最广的宿主菌来源，具有lon 和ompT 蛋白酶缺陷的优点。

BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷BL21 背景上具有与AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变( trxB ) 。由于trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的质粒。

BLR 为BL21 的recA- 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起DE3 噬菌体丢失的目标质粒。

HMS174 菌株在K-12 背景上提供了recA突变。与BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。

NovaBlue 适合用作初始克隆宿主菌的K-12 菌株，具有高转化效率、蓝/ 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒DNA高产的recA endA突变。由于存在 F 附加体编码的lacI q 阻遏蛋白，NovaBlue 的DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。

Origami 为K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似，Origami （DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高10 倍以上。Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。TrxB 和gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的pET 质粒。

Origami B 宿主菌来源于BL21 lacZY突变株，还带有与原始Origami 菌株相同的TrxB / gor 突变。Origami B 菌株集BL21 、Tuner 和Origami 宿主菌的优点于一体。TrxB 和gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的pET 质粒。

Rosetta 宿主菌从BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG 、AGA、CUA、CCC 和GGA的tRNAs 。这样Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。tRNA基因由它们的天然启动子驱动。在Rosetta （DE3 ）pLysS 和Rosetta （DE3 ）pLacI 中，稀有tRNA基因存在于分别带有T7 溶菌酶和lac 阻遏基因的同一质粒上。

Tuner 菌株为BL21 的lacZY缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。lac 通透酶（lacY）突变使得IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。Tuner （DE3 ）pLacI 菌株与pETBlue 和pTriEx 载体的表达相容。

pET-41b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-41b(+) 编号 名称 北京华越洋VECT--‐540 pET--‐41b(+) pET41b载体基本信息 别名: pET41b, p ET 41b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物: T7或pGEX--‐5‘ 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin 备注: Encodes GST fusion tag; Nterm thrombin cleavage site; Nterm enterokinase c leavage s ite; P shAI b lunt c loning s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET41b载体质粒图谱和多克隆位点信息

Feature N ame Start End T7_terminator 120 1 T7_Terminal_primer 69 87 EK 278 264 S15 353 309 6xHIS 413 396 GST (variant) 1094 444 T7_transl_en_RBS 1119 1103 lacO 1164 1137 T7_promoter 1182 1164 tet (300 --‐ 563) 1218 1481 pBRrevBam_primer 1289 1270 lacI 1564 2655 ROP 3227 3418 pGEX_3_primer 3434 3412 pBR322_origin 4452 3833

pET-SUMO大肠杆菌表达载体说明

pET-SUMO 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4790 pET--‐SUMO pETsumo载体基本信息 载体名称: pET--‐SUMO 质粒类型: 大肠杆菌表达载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 启动子: T7 和 lacO 克隆方法: TA C loning 载体大小: 5643bp 5' 测序引物及序列: T7 F orward 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag(6x)；SUMO T ag 载体抗性: 卡那霉素 筛选标记: --‐--‐ 备注: 宿主菌株BL21(DE3)；IPTG诱导 稳定性: --‐--‐ 组成型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 pETsumo载体质粒图谱和多克隆位点信息

pETsumo载体简介 The Champion pET--‐SUMO Expression System produces the highest levels of soluble protein i n E. c oli. I t u tilizes a s mall u biquitin--‐related m odifier (SUMO) f usion, b elonging t o the growing family of ubiquitin--‐related proteins, to enhance the solubility of expressed fusion proteins. In contrast to ubiquitin, SUMO is involved in the stabilization and localization of proteins in vivo. After expression, the 11 kd SUMO moiety can be cleaved by the highly specific and active SUMO (ULP--‐1) protease at the carboxyl terminal, producing a native protein*. The Champion pET SUMO Protein and Peptide Expression System o ffers: Greatly enhanced solubility with an N--‐terminal SUMO fusionHighly efficient cleavage--‐ produces n ative p rotein o f i nterest w ith S UMO (ULP--‐1) p rotease*Highly s pecific c leavage--‐ eliminates the chance of your protein of interest being internally digested, regardless of its a mino a cid s equenceSignificantly i ncreased s tability w ith S UMO f usion--‐can b e u sed f or small peptide productionT7lac promoter for high--‐level protein expressionN--‐terminal 6xHis t ag f or p rotein d etection a nd p urification. pETsumo载体序列

pET-48b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够

pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG

pET 表达系统

pET 原核表达 pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码

pET-3a(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-3a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5510 pET--‐3a(+) pet3a载体基本信息 别名: pET3a, p et 3a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4640bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐T7 载体抗性: Ampicillin 备注: Same a s p ET9 b ut a mpR; a,b,c,d v ary b y M CS. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet3a载体质粒图谱和多克隆位点信息

pet3a载体简介 The maps for pET--‐3b, pET--‐3c and pET--‐3d are the same as pET--‐3a (shown) with the following exceptions: pET--‐3b is a 4639bp plasmid; subtract 1bp from each site beyond BamH I a t 510. p ET--‐3c i s a 4638bp p lasmid;subtract 2bp f rom e ach s ite b eyond B amH I a t 510. pET--‐3d is a 4637bp plasmid; the BamH I site is in the same reading frame as in pET--‐3c. An Nco I site is substituted for the Nde I site with a net 1bp deletion at position 550 o f p ET--‐3c. A s a r esult, N co I c uts p ET--‐3d a t 546. F or t he r est o f t he s ites,subtract 3bp from each site beyond position 551 in pET--‐3a. Nde I does not cut pET--‐3d. The pET--‐3a--‐d vectors carry an N--‐terminal T7?Tag? sequence and BamH I cloning site. These vectors are the precursors to many pET family vectors; the pET--‐23a--‐d(+) series corresponds to pET--‐3a--‐d but incorporates several additional features. Unique sites are shown on the circle map.Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding s trand t ranscribed b y T7 R NA p olymerase i s s hown a bove.

pET-41a(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-41a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4930 pET--‐41a(+) pET41a载体基本信息 别名: pET41a, p ET 41a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5933 b p 5' 测序引物: pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 3' 测序引物: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin, N--‐EK, N--‐S 载体抗性: 卡那 备注: 载体带有GST蛋白纯化标签，pET41 a,b,c 的差异是在于多克隆位点。 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET41a载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET41a载体简介 pET41系列载体是设计用来克隆和高水平表达蛋白质的载体，载体融合表达一个含有220 个氨基酸的GST标签蛋白纯化片段。pET41a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒 图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在 质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子 是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够 产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. N o. 69337--‐3)的作用下终 止蛋白翻译。 pET--‐41a载体上面含有一个EK蛋白酶切位点，当将目的基因使用载体上面的PshAI限制 性内切酶位点插入进去时，可以通过EK蛋白酶将载体上的融合的所有氨基酸序列包括GST标签序列，全部切除掉。

pET-14b大肠杆菌表达载体说明

pET-14b 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4150 pET--‐14b pET14b载体基本信息 别名: pET14b, p et 14b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4671bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐His, N--‐thrombin 载体抗性: Ampicillin 备注: Hosts: E.coli. R elated v ectors: p BR322. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET14b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET14b载体简介 The p ET--‐14b v ector (Cat. N o. 69660--‐3) c arries a n N--‐terminal H is?Tag? s equence f ollowed b y a thrombin site and three cloning sites. Unique sites are shown on the circle map. Note that thesequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA p olymerase i s s hown b elow. pET14b载体序列 ORIGIN 1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA 61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG 121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT 181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA 241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG 301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC 361 CACACCCGTC CTGTGGATAT CCGGATATAG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA 421 CCCGTTTAGA GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT 481 CAGCTTCCTT TCGGGCTTTG TTAGCAGCCG GATCCTCGAG CATATGGCTG CCGCGCGGCA 541 CCAGGCCGCT GCTGTGATGA TGATGATGAT GGCTGCTGCC CATGGTATAT CTCCTTCTTA 601 AAGTTAAACA AAATTATTTC TAGAGGGAAA CCGTTGTGGT CTCCCTATAG TGAGTCGTAT 661 TAATTTCGCG GGATCGAGAT CTCGATCCTC TACGCCGGAC GCATCGTGGC CGGCATCACC 721 GGCGCCACAG GTGCGGTTGC TGGCGCCTAT ATCGCCGACA TCACCGATGG GGAAGATCGG 781 GCTCGCCACT TCGGGCTCAT GAGCGCTTGT TTCGGCGTGG GTATGGTGGC AGGCCCCGTG 841 GCCGGGGGAC TGTTGGGCGC CATCTCCTTG CATGCACCAT TCCTTGCGGC GGCGGTGCTC 901 AACGGCCTCA ACCTACTACT GGGCTGCTTC CTAATGCAGG AGTCGCATAA GGGAGAGCGT 961 CGACCGATGC CCTTGAGAGC CTTCAACCCA GTCAGCTCCT TCCGGTGGGC GCGGGGCATG 1021 ACTATCGTCG CCGCACTTAT GACTGTCTTC TTTATCATGC AACTCGTAGG ACAGGTGCCG 1081 GCAGCGCTCT GGGTCATTTT CGGCGAGGAC CGCTTTCGCT GGAGCGCGAC GATGATCGGC 1141 CTGTCGCTTG CGGTATTCGG AATCTTGCAC GCCCTCGCTC AAGCCTTCGT CACTGGTCCC 1201 GCCACCAAAC GTTTCGGCGA GAAGCAGGCC ATTATCGCCG GCATGGCGGC CGACGCGCTG 1261 GGCTACGTCT TGCTGGCGTT CGCGACGCGA GGCTGGATGG CCTTCCCCAT TATGATTCTT 1321 CTCGCTTCCG GCGGCATCGG GATGCCCGCG TTGCAGGCCA TGCTGTCCAG GCAGGTAGAT 1381 GACGACCATC AGGGACAGCT TCAAGGATCG CTCGCGGCTC TTACCAGCCT AACTTCGATC 1441 ACTGGACCGC TGATCGTCAC GGCGATTTAT GCCGCCTCGG CGAGCACATG GAACGGGTTG 1501 GCATGGATTG TAGGCGCCGC CCTATACCTT GTCTGCCTCC CCGCGTTGCG TCGCGGTGCA 1561 TGGAGCCGGG CCACCTCGAC CTGAATGGAA GCCGGCGGCA CCTCGCTAAC GGATTCACCA 1621 CTCCAAGAAT TGGAGCCAAT CAATTCTTGC GGAGAACTGT GAATGCGCAA ACCAACCCTT 1681 GGCAGAACAT ATCCATCGCG TCCGCCATCT CCAGCAGCCG CACGCGGCGC ATCTCGGGCA 1741 GCGTTGGGTC CTGGCCACGG GTGCGCATGA TCGTGCTCCT GTCGTTGAGG ACCCGGCTAG 1801 GCTGGCGGGG TTGCCTTACT GGTTAGCAGA ATGAATCACC GATACGCGAG CGAACGTGAA 1861 GCGACTGCTG CTGCAAAACG TCTGCGACCT GAGCAACAAC ATGAATGGTC TTCGGTTTCC 1921 GTGTTTCGTA AAGTCTGGAA ACGCGGAAGT CAGCGCCCTG CACCATTATG TTCCGGATCT 1981 GCATCGCAGG ATGCTGCTGG CTACCCTGTG GAACACCTAC ATCTGTATTA ACGAAGCGCT

pET-37b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-37b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4740 pET--‐37b(+) pET37b载体基本信息 别名: pET37b, p et 37b, p ET--‐37b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Signal, N--‐CBD, N--‐S, N--‐Thrombin, N--‐EK, C--‐His 载体抗性: 卡那 备注: --‐--‐ 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET37b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET37b载体简介 载体含有N端纤维素结合结构域(N--‐CBD), 是分泌性蛋白表达载体。 pET37b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTTAGCAG CCTAGGTATT AATCAATTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGGTG GTGCTCGAGT 181 GCGGCCGCAA GCTTGTCGAC GGAGCTCGAA TTCGGATCCG ATATCGCCAT GGCCAGAGGA 241 GAGTTAGAGC GACCCTCAAT ACCGGAGCCA CCACCGGTAC CCAGATCTGG GCTGTCCATG 301 TGCTGGCGTT CGAATTTAGC AGCAGCGGTT TCTTTCATAC CAATTGCAGT ACTACCGCGT 361 GGCACCAGAC CCGCGGAACC TGGTGCCGTG GGGCTGGTCG TCGGCACGGT GCCCGTGCAG 421 GTGGTGCCGT TGAGCGAGAA CGACGCCGGC GTCGGGTTGG ACCCGGCCCA CGAGCCGTTG 481 AACCCGAACG ACGCCGTGCC GCCGGTCGGG ATGCTGCCGT TCCAGGGCAG GCTGGTGACG 541 GAGACCTGGC CGCCGTTGGT CGAGGCGGTG CCGTTCCACA GCTGCTGGAT ACGCTGGCCT 601 GCGGTGTAGG TCCAGTCGAG CTTCCACGAC GAGACGGGGT CGCCGAGGTT GGTGATCGTG 661 ACGTTGGCGC CGAAGCCGCC GGGCCACTGG TTGGTGACGG CGTAGTCGAC GCGGCAGCCG 721 GGACTAGCGG CCTGGGCGGG CAGCACGACC GTGGCGCCGA CGACGAGCGT CGCCGCCGCG 781 GCGGCGAGCG TCGTGCGCAG AGCGGTGCGG GCGCCGCGGG CCGGGTGGCC GGGTGCGGGC 841 GTGGTACGAG GGTCCATATG TATATCTCCT TCTTAAAGTT AAACAAAATT ATTTCTAGAG 901 GGGAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCCCTA TAGTGAGTCG TATTAATTTC GCGGGATCGA 961 GATCGATCTC GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG 1021 CGGTTGCTGG CGCCTATATC GCCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG 1081 GGCTCATGAG CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA TGGTGGCAGG CCCCGTGGCC GGGGGACTGT 1141 TGGGCGCCAT CTCCTTGCAT GCACCATTCC TTGCGGCGGC GGTGCTCAAC GGCCTCAACC 1201 TACTACTGGG CTGCTTCCTA ATGCAGGAGT CGCATAAGGG AGAGCGTCGA GATCCCGGAC 1261 ACCATCGAAT GGCGCAAAAC CTTTCGCGGT ATGGCATGAT AGCGCCCGGA AGAGAGTCAA 1321 TTCAGGGTGG TGAATGTGAA ACCAGTAACG TTATACGATG TCGCAGAGTA TGCCGGTGTC 1381 TCTTATCAGA CCGTTTCCCG CGTGGTGAAC CAGGCCAGCC ACGTTTCTGC GAAAACGCGG 1441 GAAAAAGTGG AAGCGGCGAT GGCGGAGCTG AATTACATTC CCAACCGCGT GGCACAACAA 1501 CTGGCGGGCA AACAGTCGTT GCTGATTGGC GTTGCCACCT CCAGTCTGGC CCTGCACGCG 1561 CCGTCGCAAA TTGTCGCGGC GATTAAATCT CGCGCCGATC AACTGGGTGC CAGCGTGGTG 1621 GTGTCGATGG TAGAACGAAG CGGCGTCGAA GCCTGTAAAG CGGCGGTGCA CAATCTTCTC 1681 GCGCAACGCG TCAGTGGGCT GATCATTAAC TATCCGCTGG ATGACCAGGA TGCCATTGCT 1741 GTGGAAGCTG CCTGCACTAA TGTTCCGGCG TTATTTCTTG ATGTCTCTGA CCAGACACCC 1801 ATCAACAGTA TTATTTTCTC CCATGAAGAC GGTACGCGAC TGGGCGTGGA GCATCTGGTC 1861 GCATTGGGTC ACCAGCAAAT CGCGCTGTTA GCGGGCCCAT TAAGTTCTGT CTCGGCGCGT

pET-23(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-23(+) 编号 名称 北京华越洋VECT--‐170 pET--‐23(+) pET23载体基本信息 载体名称: pET--‐23a 质粒类型: 大肠杆菌表达载体；蛋白纯化 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 多克隆位点；限制性内切酶 启动子: T7/ l acI 载体大小: 3592 b p 5' 测序引物及序列: T7 F wd: 5'd[TAATACGACTCACTATAGGG]3' 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag （C--‐端） 载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin） 克隆菌株: DH5a 表达菌株: BL21系列 备注: pET--‐23a，b，c仅阅读框（读码框）不同，彼此相差1个 bp。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型（IPTG) 病毒/非病毒: 非病毒 pET23载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET23载体简介 pET--‐23(+) (Cat. No. 69771--‐3) is a transcription vector designed for expression from bacterial translation s ignals c arried w ithin a c loned i nsert. I t t herefore l acks t he r ibosome b inding s ite a nd ATG start codon present on the pET translation vectors. A C--‐terminal His?Tag? sequence is available. U nique s ites a re s hown o n t he c ircle m ap. N ote t hat t he s equence i s n umbered b y t he pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single--‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single--‐stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No.

pET-5a(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-5a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4350 pET--‐5a(+) pet5a载体基本信息 质粒类型: 未知 克隆方法: 多克隆位点 载体大小: 4134 备注: 宿主菌: E.coli. 相关载体: p BR322. 稳定性: 瞬时表达 组成型/诱导型: 诱导表达 病毒/非病毒: 非病毒 pet5a载体质粒图谱和多克隆位点信息 pet5a载体序列 ORIGIN 1 TTCGGATCCG CGACCCATTT GCTGTCCACC AGTCATGCTA GCCATATGTA TATCTCCTTC 61 TTAAAGTTAA ACAAAATTAT TTCTAGAGGG AAACCGTTGT GGTCTCCCTA TAGTGAGTCG 121 TATTAATTTC GCGGGATCGA GATCTCGATC CTCTACGCCG GACGCATCGT GGCCGGCATC 181 ACCGGCGCCA CAGGTGCGGT TGCTGGCGCC TATATCGCCG ACATCACCGA TGGGGAAGAT 241 CGGGCTCGCC ACTTCGGGCT CATGAGCGCT TGTTTCGGCG TGGGTATGGT GGCAGGCCCC 301 GTGGCCGGGG GACTGTTGGG CGCCATCTCC TTGCATGCAC CATTCCTTGC GGCGGCGGTG 361 CTCAACGGCC TCAACCTACT ACTGGGCTGC TTCCTAATGC AGGAGTCGCA TAAGGGAGAG 421 CGTCGACCGA TGCCCTTGAG AGCCTTCAAC CCAGTCAGCT CCTTCCGGTG GGCGCGGGGC 481 ATGACTATCG TCGCCGCACT TATGACTGTC TTCTTTATCA TGCAACTCGT AGGACAGGTG 541 CCGGCAGCGC TCTGGGTCAT TTTCGGCGAG GACCGCTTTC GCTGGAGCGC GACGATGATC 601 GGCCTGTCGC TTGCGGTATT CGGAATCTTG CACGCCCTCG CTCAAGCCTT CGTCACTGGT 661 CCCGCCACCA AACGTTTCGG CGAGAAGCAG GCCATTATCG CCGGCATGGC GGCCGACGCG

pET原核表达手册(中文版) 生物制药 西部药学论坛 - powered by phpwind

查看完整版本: [-- pET原核表达手册(中文版) --] 西部药学论坛-> 生物制药 -> pET原核表达手册(中文版)[打印本页]登录 -> 注册 -> 回复主题 -> 发表主 题 红色法拉利2006-06-01 21:50原核表达手册(中文版) 可以说是原核表达宝典级读物,MERCK公司产品,让你对原核表达有个更深的认识,不错的东东，推荐大家读读 红色法拉利2006-06-01 21:57之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的系列载 体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darm stadt，已有300多年的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。 Novagen公司出品的系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。 T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成m RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。 T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。 从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：-21(+)，-24(+)和 -23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。 根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略： 1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶 （glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白 （thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substance A, NusA）。 2. 转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。 3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。 不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。在重组技术上，Novagen除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式：Ligation-Independent cloning，简称LIC。采用LIC方法的载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。 一般的载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。而coco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和 repE元件与parABC 共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。coco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。 在保证质粒稳定性这一点上除了coco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制，质粒可以更稳定地存在。