显微制片

植物制片的方法及准备

一、植物制片的基本要求与主要制片方法

植物内部结构不能用大而厚的组织块置于显微镜下观察，必须进行制作切片，才能供显微镜下观察应用。

石蜡（或徒手）切片，是将植物切成薄的材料，按下列主要步骤与要求制成永存切片。

1.采样：材料的选择与分割

2.杀生、固定与器皿清洗

3.冲洗（有的不经此步）

4.脱水（各级酒精）

5.透明

6.渗透（例如浸蜡）

7.包埋（石蜡包埋）

8.切片（切片机或徒手切片）

9.粘片

10.烘片

11.脱包埋剂（石蜡）

12.经各级酒精（脱水）

13.染色

14.分色

15.脱水

16.透明

17.封藏成永存片

从上述主要环节来看，首先将材料加以处理（1、2、3项），第二步进行制片基础的处理工作（4、5、6、7项），在保证质量完成这两类工作基础上，方可顺利完成切片工作（包括8、9、10项），也就是说切出符合规格的薄片来，然后再对组织进行染色、脱水、透明等一系列工作，才可制成透明清晰、染色鲜艳、适合显微镜观察摄影，并作教学、科研长期保存的永存片。其详细制片过程与方法，在以后章节内加以介绍。

通常制片分两大类型。

二、溶液的配制

（一）各级酒精浓度的配制在植物制片中常用各级酒精，一般以95%酒精来配制，为节约起见，避免用无水酒精来配制各级酒精（表1一2）。

在实验中使用酒精量较大，每次以量筒量液花费时间多，可在500ml细口瓶有玻璃塞的瓶上贴一条宽1cm与瓶等长的白色纸条，仅在第一次用量筒量酒精与蒸馆水的用量处划上刻度，以后每当瓶内溶液用完，即以纸条上刻度分别倒入酒精和蒸馆水的各用量即可。

（二）低浓度溶液配制制片中染色液绝大多数为此类溶液。如1%番红水溶液，即为番红1g溶于l00mL的蒸馏水中；又如0.5%曙红（伊红）酒精溶液为0.5g曙红溶于l00mL的95%酒精中。

其他如重量百分比浓度、摩尔浓度、克当量浓度等溶液的配制，在附录5中介绍。（

中药鉴定常用的鉴定方法有：来源（原植物、动物和矿物）鉴定法、性状鉴定法、显微鉴定法及理化鉴定法等。

显微鉴定法是利用显微技术对中药进行显微分析，以确定其品种和质量的一种鉴定方法。显微鉴定主要包括组织鉴定和粉末鉴定，利用显微镜来观察药材的组织构造、细胞形状及内含物的特征、矿物的光学特性，和用显微化学方法，确定细胞壁及细胞内含物的性质或某些品种有效成分在组织中的分布等，用以鉴别药材的真伪与纯

度甚至品质。

（一）显微制片方法

显微鉴定时可根据检品的不同情况制作相应的制片，包括横切片或纵切片、表面制片、粉末制片、解离组织片、花粉粒与孢子制片、磨片制片、含粉末药材的制剂显微纸片等。

制作解离组织片时，解离液选择原则为：如样品中薄壁组织占大部分，木化组织少或分散存在，可用氢氧化钾法；如果样品坚硬，木化组织较多或集成较大群束，可用硝铬酸法或氯酸钾法。

（二）植物细胞壁和内含物的鉴别

（1）细胞壁性质的鉴别：

①木质化细胞壁加间苯三酚试液显红色或紫红色。

②木栓化或角质化细胞壁加苏丹Ш显橘红色至红色。

③纤堆素细胞壁加氯化锌碘试液显蓝色或紫色。

④硅质化细胞壁加硫酸无变化。

（2）细胞内含物性质的鉴别：

①淀粉拉加碘试液显蓝色或紫色。

②糊粉粒加碘试液显棕色或黄棕色。医学`教育网搜集整理加硝酸汞试液显砖红色。

③脂肪油、挥发油或树脂加苏丹Ш试液显橘红色、红色或紫红色。

④菊糖加10%α-萘酚乙醇溶液，再加硫酸显紫红色并很快溶解。

⑤黏液加钌红试液显红色。

⑥草酸钙结晶加稀醋酸不溶解，加稀盐酸溶解而无气泡发生。加硫酸逐渐溶解，析出结晶。

⑦碳酸钙结晶（钟乳体）加稀盐酸溶解，同时有气泡发生。

⑧硅质加硫酸不溶解。

（三）显微测量

（四）显微常数测定

常见的显微常数主要有用于叶类鉴别的气孔数、气孔指数、栅表比、脉岛数和脉端数等。

（五）显微临时制片常用封藏试液

显微鉴定所用试剂包括水、稀甘油、甘油醋酸试液及水合氯醛试液。

（六）扫描电子显微镜和偏光显微镜的应用

扫描电镜已广泛应用于生物样品表面及其断面立体形貌的观察。医学`教育网搜集整理偏光显微镜主要用于观

察和分析矿物类中药的光学性质

(一)显微制片方法

1、横切面或纵切片制片完整药材，选取要观察的部位，软化后切成10~20μm薄片，根据不同观察对象，滴加试液。

2、表面制片切取或撕去表皮

3、粉末制片

4、解离组织片将供试品切成长约5mm，直径约2mm的段或厚约1mm的片，如薄壁组织占大部分，木化组织少可用氢氧化钾法;如质地坚硬，木化组织较多或集成较大群束，可用硝铬酸法或氯酸钾法。

5、花粉粒与孢子制片

6、磨片制片坚硬的矿物药、动物药。1~2mm

7、含粉末药材的制剂显微制片

(二)植物细胞壁和内含物的鉴别

1、细胞壁性质的鉴别：木质化细胞壁：间苯三酚，显红色或紫红色;木栓化(角质化)细胞壁：苏丹Ⅲ号，加热后显红色;纤维素细胞壁：氯化锌碘试液，显蓝色或紫色;硅质化细胞壁：硫酸无变化

2、细胞内含物的鉴定

淀粉粒：加碘试液，蓝色或紫色。用甘油醋酸处理后，未糊化的淀粉粒有偏光，糊化的无偏光。

糊粉粒：加碘显棕色，加硝酸汞，显砖红色。

脂肪油：加苏丹Ⅲ号，显橘红色、红色或紫色。加90%乙醇脂肪油不溶解，挥发油溶解。

菊糖：加10%а-萘酚乙醇液，再加硫酸，现紫红色并很快溶解。

粘液：加钌红试液，显红色。

草酸钙结晶：1、加稀醋酸不溶解，加盐酸溶解。2、加硫酸，逐渐溶解，然后又析出针状结晶。

碳酸钙结晶：加稀盐酸溶解并有气泡产生。

硅质块：加硫酸不溶解(五)显微临时制片常用的封藏液

水、稀甘油：用来观察淀粉粒、油滴、树脂等细胞内含物及细胞壁的颜色

甘油醋酸试液：常用封藏剂，使淀粉粒不膨胀变性，特别适于观察淀粉粒和显微测量。

水合氯醛试液：常用的透化剂。方便观察细胞的形状和组织构造以及细胞内含有的各种晶体。

显微制片首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免膺象、变形和失真，因此须将生物材料做固定处理；制片必须薄而透明，才能在光学显微镜下成象，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。需长期保存的制片，还应进行脱水和封固。

显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4大类。

切片法光学显微镜的切片厚度在2～25微米之间，一般动植物材料的切片以厚10微米左右为合适。切片法根据包埋剂的不同而有所不同。最常用的是石蜡切片法，它适用于一般生物材料。棉胶切片法，把生物材料经棉胶包埋后切片。适用于特别坚硬的材料或特别柔软而体积大的材料（如完整的大脑）。冰冻切片法，将生物材料在一定的介质中冰冻固化后切片。适用于研究活体标本或作组织化学的研究。乙二醇甲基丙烯酸脂法（简称GMA 法），适用于制作1～3微米厚的切片。石蜡切片法包括固定、包埋、切片、染色、脱水和封固等步骤。关键是把生物材料用石蜡包埋，以石蜡为支持物，把浸在蜡块中的生物材料切成理想的薄片。操作过程为：固定→水洗→从低浓度逐级到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→二甲苯脱蜡→逐级从高浓度到低浓度酒精处理，最后过渡到水→染色→逐级从低浓度到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→树脂胶封固。其中的基本步骤在各种制片技术中都是相同的。

固定用物理的或化学的方法将生物材料迅速杀死、使蛋白质变性和凝固，达到保持细胞的形状和内部结构的目的。物理固定法常用冷冻处理或火焰烘烤。化学固定法，主要是把生物材料迅速浸泡在固定剂中。固定剂常是含有几种化合物的混合液，既有强烈凝固蛋白质的化合物，也有非凝固性的化合物，它们对蛋白质起交联和稳定作用，即所谓“鞣化作用”。已有的一些比较理想的固定剂，大多以最初设计者命名（表1）。

脱水和透明固定之后，一般须用水冲洗材料移去多余的固定液。为了使材料能为石蜡所浸透，必须将水移去，换成能溶解石蜡的有机溶剂，如二甲苯等。在制片中常用的脱水剂是乙醇（酒精），将浸在水中的材料依次移入从低浓度到高浓度的乙醇中，最后移到纯乙醇中完成脱水。然后将脱水后的材料移入二甲苯中。

浸透和包埋在温箱中用溶化的石蜡取代二甲苯。使材料逐步为纯石蜡所浸透，然后将材料连同熔化的石蜡，倒入小纸盒中，在室温下或在冷水中使包埋有材料的蜡块迅速凝固。浸透和包埋的目的是使材料藉石蜡的支持能被切成薄片。

切片将包埋好的材料用切片机切成薄片。切片机有轮转式切片机（图1）和滑行式切片机（图2）两种。切片机一般用专门的钢刀。

包埋材料的蜡块边缘要整齐，使被切下的蜡片前后能自然地连接，形成蜡带，有利于制备连续切片。切片后，将蜡带或单个蜡片贴在载玻片上。

染色先将已粘贴有蜡片或蜡带的载玻片，在染色缸中经二甲苯脱蜡，再经过一系列从高浓度到低浓度的酒精而过渡到水中，即可染色。生物染料种类繁多，用途各异，可区分为碱性染料和酸性染料两大类。碱性染料为一种色碱盐，可染细胞核，如苏木精、甲基绿和番红等。酸性染料为一种色酸盐，可染细胞质或核以外的其他成分，如伊红、橘红G和固绿等。碱性染料和酸性染料混合后称中性染料，也称复合染料，如芮氏染色剂和姬姆萨染色剂等。染色可只用一种染料，但通常采用复染，例如：先染碱性染料显示核，再染酸性染料显示其他结构。染色的深浅，随材料的不同和浸染时间的长短而不同，因此要达到合适的程度常需要进行分色，即先过度染色，再使其褪色，当达到合适的程度后即中止。显微制片中采用何种染色方法，需根据材料和目的来选择（表2）。

表1 显微制片中常用的一些固定剂

表2 动、植物显微制片中几种常用的染色方法

上述染色方法都是用于经固定而被杀死的材料，在研究生活状态的生物材料或鉴定细胞的活性时，则用活体染色法。活体染色需用无毒性的活体染料，并能使特异的细胞结构着色。例如：中性红可以显示活细胞的液泡而詹纳斯绿可以显示线粒体等。

封固染色之后一般都要用封固剂和盖玻片把材料封固起来。只有像血液、细菌等需用油浸镜观察的制片才可不加盖玻片。封固剂应有较高的折射率和固化后不易碎裂的特点，常用的封固剂是加拿大树脂。

整体封片法用于单细胞、微小生物体或分散的器官的整装制片方法。此法也需要经过固定、染色、脱水、透明和封固各个步骤。材料常用洋红。代氏苏木精等单一染色法，但也可复染。整体封片法中常用冬青油、丁香油一类香精油作为透明剂，以代替二甲苯，这样可避免标本脆裂，较厚的标本在封固时，要在盖玻片下垫以适当大小的碎玻璃或玻璃丝以免压坏。

涂片法把易于分散的生物标本涂布在载玻片上的制片方法。此法的永久制片需经固定、染色，脱水等步骤，适用于细菌、血液、花粉母细胞和精子等细小而分散的材料。血液涂片便是一例。

压片法将天然的、易于分散的组织或经过处理后易于分散的组织，如动物的精母细胞、果蝇的唾液腺、植物的花粉母细胞和根尖细胞等放在载玻片上、再加盖玻片，用力压碎组织，使细胞或细胞内的结构铺展成一层的制片方法。压片法常用于观察染色体，通常用醋酸洋红、地衣红和石炭酸复红染色。