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埃博霉的生物合成阎家麒

埃博霉素的生物合成

(2009-02-17 14:30:32)

阎家麒

（福建紫杉园生物有限公司，福建明溪365200）

摘要：

埃博霉素是由黏细菌纤维堆囊菌产生的次级代谢产物。与紫杉醇相似，它们可以抑制微管解聚，使细胞有丝分裂终止在G2-M 期。在p-糖蛋白表达型的多药耐药性肿瘤细胞系中维持很大的毒性，而且比紫杉醇有更好的水溶性。全合成埃博霉素虽然可以实现，但是与发酵方法相比尚无经济

可行性。本文介绍了埃博霉素生物合成基因簇的克隆和异源表达，同时也对Red/ET 重组技术的特

点以及在埃博霉素生物合成中的应用进行了详细阐述。

关键词：埃博霉素（埃坡霉素，埃坡西龙）；生物合成；埃博霉素基因簇；埃博霉素D 内酰胺衍生

物；Red/ET 重组技术

埃博霉素（埃坡霉素，埃坡西龙，epothilones）是由黏细菌纤维素堆囊菌分泌的结

构为16 元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物，是一种具有

类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定作用的新抗肿瘤药物（图1）。

Fig.1 epothilones

作者简介：阎家麒(1939-), 男，教授，专业方向：基因工程制药，天然产物有机合成。

Tel: 158******** E-mail: yanjq66@https://www.wendangku.net/doc/b213022391.html,

1 埃博霉素的发现

埃博霉素A 和B 是在20 世纪90 年代由H?fle 及其同事最先从南非Zambesi 河岸

的泥土中找到一种黏细菌纤维素堆囊菌Sorangium cellulosum(Myxococcales) 菌株So

ce90，从其培养物中分离提取了一种抗真菌活性的化合物并对其进行性质研究[1,2]。首

先用光谱和X－射线衍射晶体学方法测定了埃博霉素的结构排布, 该化合物是依据它

的结构亚单位，epotide, thiazol 和ketone 命名的（图2）。Fig.2 The naming of epothilones

1995 年前后，Bollag 等人发现埃博霉素是一种具有类似紫杉醇的促微管蛋白聚合

特性、结构新颖的抗肿瘤化合物。这一结果立即引起许多有机化学家、生物学家、药

学家及临床医生的极大关注，在国际上迅速开展了对埃博霉素的多角度研究。

2 埃博霉素化学生物学

埃博霉素外观为无色油状，可在乙酸乙酯中形成粉末状结晶。上述埃博霉素A、B、

C、D、E 5 种分子结构仅存微小差别。埃博霉素总共有7 个手性中心和一个大环，包

括含有噻唑的侧链与一个环氧化物。

2.1 微管聚合与解聚

微管（microtubule）存在于几乎所有的真核细胞中，是有丝分裂期纺锤体、纤毛及

鞭毛基体的主要成分。微管为中空柱状结构，外径约24nm，壁厚约5nm，其长度因细

胞种类和功能不同而异。微管由α、β微管蛋白（tubulin）形成的异二聚体（heterodimer）

为基本结构单位组装而成，α和β微管蛋白均为球蛋白，直径约5nm，α、β微管蛋

白头尾相接交替排列成原丝（protofilament）。13 根原丝沿微管纵轴环状排列而成筒状。

α、β微管蛋白二聚体是有极性的，即α微管蛋白总是位于一侧，β微管蛋白位于另

一侧。因此，由α、β微管蛋白二聚体为组装单位形成的多聚体也存在极性，即一端

为α微管蛋白（正极），另一端为β微管蛋白（负极）。微管的这种极性在其组装和执

行功能过程中发挥着重要作用。细胞提取物在37℃、无Ca2+存在、加入GTP 的条件下，

微管可自发形成，当温度降低，则微管解聚[3]。

2.2 以微管或微管蛋白为靶点的药物及其结合位点

埃博霉素、紫杉醇、长春碱（vinblastin）和秋水仙碱(colchicines)都是作用于微管

蛋白的天然药物，但它们的结合位点和作用机制不同。

与紫杉醇结合位点相互作用的药物包括埃博霉素及其衍生物等。这些是另一类抗

有丝分裂抗肿瘤药物，具有促进微管的聚合与稳定性的作用。实验研究表明，埃博霉

素具有与紫杉醇相类似的稳定微管活性，其作用机制主要是，埃博霉素在低温、无GTP

或微管偶联蛋白（MAPs）和在Ca2+存在的条件下与β微管蛋白N 端第31 位氨基酸和

第217~231 位氨基酸结合，促进微管蛋白聚合，装配成微管，抑制其解聚，从而导致

微管束排列异常，形成星状体，使纺锤体失去正常功能，导致染色体分离受阻，细胞

核不能分裂，使得细胞有丝分裂终止在G2-M 期，从而引起细胞毒性

导致细胞死亡[4]。

有研究认为，埃博霉素A 和B 是[3H]紫杉醇连接的竞争抑制剂，与紫杉醇具有几

乎相同的IC50 值，埃博霉素在结合到微管上时，占有不同的但可能是重叠的结合位点。

是紫杉醇结合到微管蛋白聚合物的竞争性抑制剂。

与紫杉醇比较，埃博霉素水溶性好，注射、口服均可；结构简单，有利于化学合

成及衍生化；在P-糖蛋白表达型的多药耐药性（MDR）细胞中也维持很大的细胞毒性，

约为紫杉醇的2000~5000 倍[5]。

3 埃博霉素的全合成

与紫杉醇比较，埃博霉素的化学结构相对简单，所以化学合成埃博霉素及其衍生

物成为近年来生物有机化学家们关注的热点。埃博霉素是一种结构复杂的天然产物，

天然产物的有机合成可谓是20 世纪后十年对有机化学巨大挑战。埃博霉素一问世，有

数十条全合成路线相继报道。其中，卓有成效的是Nicolaou 、Danishefsky 和Schinzer

等三个小组[6-8]。

从1993 年发现至今（2007 年10 月），有关埃博霉素研究报告的文

献量约有500

多篇。国外报道全合成埃博霉素的方法路线不下30 余种。但是，具有商业价值的全合

成方法必须具备合成步骤短、最长线性片段少、总产率高这 3 个优势。在上述三个研

究小组的全合成方法中，Danishefsky 大环羟醛缩合方法、Nicolaou 大环内酯化方法、

Schinzer 烯烃复分解方法、Nicolaou 烯烃复分解方法和Danishefsky 烯烃复分解方法具

有一定的可行性。如表1

Tab. 1 Synthesis of Nicolaou, Schinzer and Danishefsky groups Synthesis Total Steps Longest Linear Overall yield Sequence(LLS) along LLS

Danishefsky Macroaldol 37 24 2.6%

Nicolaou Macrolactonization 27 20 4.3%

Schinzer RCM 33 17 1.1%

Nicolaou RCM 15 9 6.6%

Danishefsky RCM 25 22 0.8%

埃博霉素全合成工作亦于上世纪末在我国展开[9,10]，这在探索埃博霉素大规模制备

的可行性上，具有很重要的意义。全合成埃博霉素步骤冗长，产率颇

低，现有文献提

供的方法目前尚无工业化实用意义。

4 埃博霉素生物合成

4.1 诱变育种

以纤维素堆囊菌培养方法进行埃博霉素的大规模生产是理想的途径。但是目前微生

物发酵方法生产埃博霉素的产量都很低。1996 年Hofle 等人的经典报道[2]，以Sorangum

cellulosum Soce90 为生产菌株，埃博霉素A 和B 产率分别为22 和11mg/L。遗憾的是，

该结果没有被后来的研究者们所证实。近10 年中，在生物合成埃博霉素的研究上又有

新的进展，如李越中等[11]对成团生长的纤维堆囊菌液体均衡生长的驯化，采用适合埃

博霉素 A 产生的地瓜淀粉、水解乳蛋白等的选定以及综合地消除产物代谢积累的混合

树脂添加方法等步骤，使得埃博霉素 A 的产量达到62.7mg/L 的水平。但是该方法需要

重复传代驯化，在100 代时方可达到上述产率水平，每传1 代至少12 天，100 代则需

1200 天（3 年多），即使在此期间不发生菌种退化、变异等问题，这样冗长的生产周期

显然不适合大规模生产。邱荣国[12]采用定向诱变筛选方法，获得了一种以埃博霉素D

为主要代谢产物的新菌株S. celulosum BGS4。获得的新菌株由于缺乏EpoK氧化酶功能，

在其他条件相同的情况下，该类菌株只产生埃博霉素C 和D，而不产生埃博霉素A 和

B。这一诱变菌株可通过一次或者多次的基因诱变及定向筛选（产物鉴定）而获得。美

国施贵宝公司将So ce90 菌株经过UV 诱变继之以随机选择产生So ce90B2 菌株，然后

再用亚硝基胍（NTG）诱变，得到高产菌株（SC16408）[13]。传统的生物发酵仍然聚焦

在采用诱变的方法获得高产菌株，优化发酵条件和纯化工艺。

目前，通过纤维堆囊菌发酵合成埃博霉素的手段仍然存在很大的局限性。首先纤维

堆囊菌的分离和纯化工作繁琐，生产周期较长。此外，从发酵液中分离、提纯产物的

方法有待进一步优化。目前，埃博霉素传统的工业菌株育种技术仍然具有实用价值。

4.2 埃博霉素的异源表达

在埃博霉素异源表达的研究方面，美国Kosan 生物技术公司建立了

埃博霉素来源菌

株的基因文库，构建了含有埃博霉素合成酶基因的载体。他们将埃博霉素基因转入到

和纤维堆囊菌同目的黄色黏球菌（Myxococcus xanthus）中，表达出了埃博霉素A 和B[14]。

埃博霉素C 和D 在原始菌—纤维堆囊菌中不易获得。由于黏球菌和纤维堆囊菌同源性

高，这种异源表达有效地避免了产物对宿主细胞的内毒素作用。并且黏细菌代时短（约

为5h，纤维堆囊菌一般为16h），易于遗传操作，埃博霉素生物合成基因酶在该宿主中

异源表达具有一点优势。通过优化发酵条件以后，该工程菌M. xanthus K111-40-1 发酵

合成埃博霉素D 的平均产量可以高达23mg/L[15,16]。这种方法得到的埃博霉素D 已经进

入临床试验。现在他们又将埃博霉素基因转入到了大肠杆菌（Escherichia coli）[17]中。

虽然大肠杆菌表达需要外添加前体，而且最终产量很低，但是它为组合文库的发展提

供了一个手段，异源表达可以克服纤维堆囊菌生长迟缓、发酵困难的缺点，为大规模

生产埃博霉素提供了一种新的方法。

4.3 Red/ET 同源重组技术在埃博霉素生物合成中的应用

Red/ET 重组技术是本世纪基因工程的创新技术，极大地促进了分子生物学的发展。

Red/ET 重组技术具有同源序列短（40~60bp）、重组效率高的特点，在DNA 靶标分子

的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作，无需使用限制性内切酶和连接酶。

此外，这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上，目的基因既可来源于细菌

人工染色体也可以是基因组DNA。该技术成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手

段。

张友明等[18]采用Red/ET 同源重组技术和异质宿主菌，使埃博霉素的全长基因簇完

整地缝合在一起，并转化到新的宿主菌中，解决了埃博霉素大全长基因簇的克隆和原

始生产菌发酵产率低、发酵周期长等问题。

埃博霉素生物合成主要是由I 型聚酮合酶（PKS）催化完成的[19], 埃博霉素的复合

酶系统中同时含有PKS 和NRPS(非核糖体肽合成酶)模块，包括1 个负载模块，1 个非

核糖体肽合成酶模块，8 个聚酮合酶模块和 1 个能把脱氧埃博霉素转变成环氧埃博霉素

的P450 环氧酶。整个基因簇中有7 个转录方向一致的基因（EpoA, EpoB, EpoC, EpoD,

EpoE, EpoF 和EpoK)，9 个模块和46 个结构域。埃博霉素生物合酶全长约56kb，埃博

霉素生物合酶依照转录顺序依次是：epoA(149-kD, 编码1 个负载模块) epoB

(158kD, 1 个NRPS 模块) epoC(193kD,1 个PKS 模块2) epoD(765kD，4 个

PKS 模块3-6) epoE(405kD, 2 个PKS 模块7 和8) epoF(257kD,1 个PKS 模

块9 加 1 个硫酯酶) epoK(47kD,1 个细胞色素P450)，同时由于epoA/epoB,

epoC/epoD 中存在基因的重叠现象，推测epoA/epoB, epoC/epoD 可能共转录。而在

epoB/epoC(147bp), epoE/epoF(15bp)和epoF/epoK(115bp) 基因之间短小的间区序列中没

有发现转录终止子，这表明所有这些基因可能是由一个异常大的操纵子（≥56kb）构成。

根据同位素13C 标记实验结果和合成酶全基因簇功能的推测，埃博霉素的生物合成包括

5 个阶段：①聚酮链的引发：在酰基转移酶的作用下，活化载体蛋白，形成活化中心。

②链合成的起始和噻唑环的形成：在epoA 和epoP 模板的共同作用下催化乙酰基和半

胱氨酸，缩合形成埃博霉素合成的特殊起始物—2-甲基噻唑五元杂环。③链的延伸和转

移：埃博霉素骨架每经过一个模块就有一个二碳单元结合到聚酮链上，并加以适当的

修饰。在延伸阶段，埃博霉素骨架依次经过epoC（1 个PKS 模块）、epoD（4 个PKS

模块）、epoE（2 个PKS 模块）和epoF（1 个PKS 模块），共经过了8 个模块，形成了

埃博霉素的16 元骨架。④链合成的终止释放和环化：在进行到epoF 的末端的时候，

16 元环的骨架从活化位点转移到epoF 末端区域中硫酯酶的丝氨酸位点上，终止了链的

合成。在环化酶的作用下，自身分子内环化，解离形成16 元大环内酯类化合物。⑤产

物的后修饰:埃博霉素基因序列中的P450(epoK)是由420 个氨基酸组成，氨基酸序列与

细胞色素P450 氧化酶的同源性很高，它催化埃博霉素C12-C13 之间的环氧化，使埃博

霉素C 和D 环氧化成为埃博霉素A 和B。突变该基因，可以使埃博霉素的合成停留在

C 和

D 上 (图3)。

Fig 3 Epothilone biosynthesis. Modular organization of the epothilone polyketide synthas(PKS).

Functional domains of each of the epothilone PKS modules are shown. Stepwise synthesis of

epothilones begins at EpoA and ends with the cyclization by the TE domain in EpoF to yield either

epothilones Cand D or the hypothetical molecule containing the OH group at C-13. Abreviations:

KS, β-ketoacyl ACP synthase; Ksy, β-ketoacyl ACP synthasecontaining a tyrosine substitition of

the active-site cysteine; AT, acyltransferase; DH, dehydratase; ER, enoylreductase; KR, ketoreductase;

MT, mrthyltransferase; ACP, acyl carrier protein; TE, thioesterase; C, condensation; A, adenylation;

PCP, peptidyl carrierprotein.

采用Red/ET 重组技术是基于同源重组的一种对大的DNA 分子（BAC/PAV/PI 和科

斯质粒）和细菌染色体进行修饰的主要方法。

埃博霉素全长基因簇的构建包括如下步骤[18]：

（1）埃博霉素基因簇的分离及科斯质粒epo14 和epo35 的构建。从黏细菌纤维堆囊

菌中提取染色体DNA,经Sau3AI 消化，电泳回收40-50kb 片段,BamHI 酶切科斯质粒，

用连接酶连接后电转化大肠杆菌DH10B,获得含有埃博霉素基因簇的科斯质粒文库，利

用P32 同位素标记的探针，筛选5 个含有埃博霉素基因簇阳性克隆，其中两个较大的克

隆即上游的epo14 和下游的 epo35。

（2）把分散在epo14 和epo35 中的埃博霉素基因簇组合在一起，在科斯质粒中引入

SpeI 限制性位切位点，选择性地标记和P15 起始位点。首先，设计引物epo14-F 和

epo14-R，利用PCR 从质粒p-15A-cm-neo-zen 扩增出带有氯霉素基因和P15A 启动子的

寡核苷酸片段(2109bp)，由于引物中带有同源科斯质粒epo14 骨架两侧相同的45 个碱

基，扩增的片段两侧就具有了45 个碱基的同源臂，利用Red/ET 同源重组技术，以扩

增的片段同源替换epo14 骨架，就构成了修饰的含有埃博霉素基因

簇的上游的科斯质粒

p15A-epo14（图4）。然后，设计引物epo35-F 和epo35-R，扩增出含有卡拉霉素基因和

Zeocin 抗性基因及P15A 起始位点的寡核苷酸片段（2715bp），扩展到片段带有epo35

骨架和重叠基因两端45 个碱基的同源臂，利用Red/ET 同源重组技术，以扩增的片段

同源替换epo35 骨架和重叠基因，就构成了修饰的含有埃博霉素的下游科斯质粒

p-15A-epo35 图4）。

Fig 4 Modification of cosmid epo14 and epo35 with epothilone gene cluster

（3）带有全长埃博霉素基因簇的重组质粒p15A-epo-km-zeo-cm 的构建。将修饰后

的科斯质粒epo14 和epo35 用限制性内切酶SpeI 进行切割，然后用T4 DNA 连接酶进

行连接，连接产物电转大肠杆菌GB2005, 通过卡拉霉素、zeocin 和氯霉素三种抗生素

联合筛选，并用菌落PCR 进行鉴定，获得含有全长的埃博霉素基因簇的重组质粒

p15A-epo-km-zeo-cm（图5）, 该全长的埃博霉素基因簇加入了p15A

的强启动子，有

利于高效表达。

Fig 5 Construction of recombinant plasmid p-15A-epo-km-zeo-cm with epothilone

gene cluster

（4）重组表达质粒p15A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT 的构建。利用Red/ET 基因

重组技术在转座酶Tpase 后面加入Blasticidin 抗性基因（BSD）及oriT 形成

Tpase-BSD-oriT 组件，将其及一端转座位点（IR）插入到缝合后的埃博霉素基因的3'

端，同源替换p15A-epo-km-zeo-cm 中的km-zeo-cm 组件，同时在epoA 基因的前面插

入 Tn5 强启动子并带入另一端转座位点（IR）。然后，PCR 扩增neo 抗性基因，利用

Red/ET 同源重组技术插入到epoA 的前面，就获得了埃博霉素全长基因簇的重组表达

质粒p15A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT。

（5）重组表达质粒p15A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT（图6），转入异质宿主菌

—黄色黏球菌（Myxococcus xanthus）1622。利用卡拉霉素抗性和菌

落PCR 筛选到阳型

的转化子，同时利用转座子诱导的同源重组将外源基因整合到宿主菌的染色体上，获

得能稳定的高效异质表达埃博霉素的新型工程菌株。采用黄色黏球菌为异质宿主菌，

是因为黄色黏球菌的遗传背景最为清楚，能表达埃博霉素基因来生产埃博霉素，而且

可以利用基因工程技术进行改造。其次，黄色黏球菌1622 比纤维堆囊菌由更短的倍增

时间（5h）,可以提高装置的容积产率。

Fig. 6 Plasmid used for expression of epothilone gene cluster 11

表达产物的HPLC 检测如图7 所示，转入重组表达质粒的假单胞菌工程菌的HPLC

图谱上具有同原始菌对应的峰1，峰2 和峰3（埃博霉素产物），但野生的假单胞菌则

没有产生对应的峰1-3，而且假单胞菌工程菌的峰1 和峰3 的峰值比原始菌株对应的峰

要大。说明缝合在一起的全长埃博霉素基因簇在异质表达宿主菌假单胞菌中获得了高

效的表达。

Fig.7 HPLC analysis of expressed epothilone product

纤维堆囊菌具有独特的生物学特征，高产菌株选育的研究结果发现，现阶段采用

基因工程方法获得的工程菌往往产率并不理想，最高产率：埃博霉素B 约为2.5mg/L,

埃博霉素D 为23mg/L[15]。而采用传统理化诱变方法选育的菌株，却能获得更高的埃博

霉素产率。作者以Sorangium cellulosum So ce 90 为出发菌株，采用UV 和NTG 诱变育

种，得到了So ce YM-0880 和So ce YM-0881 两株埃博霉素B 高产菌株，发酵产率达

到100mg/L, 与美国施贵宝公司生产埃博霉素 B 的SC16408 和SC16449 的菌株[13]生产

能力相当。

5 埃博霉素衍生物的半合成

对细胞毒性的大量研究结果证实，埃博霉素类似物中的抗肿瘤活性比较认为：

埃博霉素B 内酰胺衍生物＞埃博霉素D＞埃博霉素B＞埃博霉素F＞埃博霉素A＞紫杉

醇[20]。事实上，目前已经上市的和进入II、III 期临床试验5 种埃博霉素类似物中有3

种属于埃博霉素衍生物，即Ixabepilone、ZK-EPO 和BMS-310705。

在抗肿瘤活性筛选

中不断发现新的埃博霉素衍生物，如26-fluoroepothilone B[21], 12,13-desoxyepothilone

B[22] , pyridine epothilones[23]和12-Aza-epothilones [24]等, 其中有些已经进入了I 期或II

期临床试验。

作者采用半合成方法制得埃博霉素的一个新的衍生物——埃博霉素D 内酰胺衍生

物(Aza-Epothilone D)[25,26]，即以微生物发酵得到的埃博霉素 D 作为起始材料，与催化

量的四（三苯基膦）合钯（O）合叠氮化钠作用，在45℃，反应1h，使埃博霉素D 大

环开环，趋于形成π-烯丙基钯络合物，得到一种单一的非对映异构体，即氮酸，氮酸

经三苯基膦处理，生产氨基酸化合物，最后用1-羟基苯并三氮唑（HOBt）-EDCI 和固

体碳酸氢钠促进氨基酸环化反应，得到埃博霉素D 内酰胺衍生物（图8）。埃博霉素D

内酰胺衍生物合理规避了专利壁垒，创制具有自主知识产权的埃博霉素新类似物。在

埃博霉素系列衍生物细胞毒性和抗肿瘤实验中，发现埃博霉素 D 内酰胺衍生物是埃博

霉素家族中抗肿瘤活性较高的一个化合物，极有优势开发出一种高效的后选抗癌新药

[26]。

Fig. 8 Pd(o)-catalyzed nucleophilic substitution reaction to the regio- and

stereoselective semisynthesis of aza-epothilone D

6 埃博霉素新药临床研究

目前，美国正在进行新药I、II 期临床试验并取得预期效果的埃博霉素系列物为埃

博霉素B、埃博霉素D（KOS 862）、BMS-310705、KOS-1584、甲基硫代埃博霉素、

ZK-EPO、ABJ879 和Fludelone(图9)。

Fig. 9 Epothilones in the phase I, II trials

Ixabepilone（商品名“伊沙匹隆”，Ixempra）由美国施贵宝公司开发，于2007 年

10 月16 日获得FDA 批准在美国上市，该药用于乳腺癌的治疗[27]，本品为注射剂。这

是迄今第一个上市的埃博霉素衍生物（图10）。

Fig. 10 FDA approved Ixempra(Ixabepilone), a semi-synthesis