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pepc酶活的测定

2. 实验试剂：

50mM ATP溶液，50mM磷酸肌酸溶液，0.2mM NaHCO3溶液，160U/ml 磷酸肌酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶溶液（U为酶活力单位），25mM RuBP溶液，5mM NADH，Rubisco提取介质（40mM Tris-HCl缓冲液，pH7.6，内含10mM MgCl2溶液，0.25mM EDTA，5mM谷胱甘肽），反应介质（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.8，内含12mM MgCl2溶液，0.4mM EDTA）。

3实验步骤

3.1 酶粗提液的准备

取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10,000×g离心10min，弃

沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用（王维光，1985；张志良等，2003）。

3.3.2 Rubisco酶活力的测定

按下表配制反应体系：

试剂加入量ml

5mM NADH 0.2

50mM ATP 0.2

酶提取液0.1

50mM磷酸肌酸0.2

0.2mM NaHCO30.2

反应介质1.4

160U/ml磷酸肌酸激酶0.1

160U/ml磷酸甘油酸激酶0.1

160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶0.1

双蒸水0.3

将配制好的反应体系混匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计计上测量340nm处反应体系的OD值，作为零点值。将0.1mlRuBp加入比色杯内，立即计时，每隔20s测一次OD值，共测3min。以零点到第1min 的OD值下降的绝对值计算酶活力。

由于酶提取液中可能存在3-磷酸甘油酸（PGA），会使酶活力的测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBp的对照。对照的反应体系与上述酶的反应体系完全一样，所不同的仅仅是把酶提取液放在最后加，加入后马上测定此反应体系340nm处的OD值，并记录前1min内OD值的变化量。计算酶活力变化时应减去这一变化量。

3.3.3 Rubisco活力的计算

酶活力=（ΔOD N10）/（6.22×2dΔt）

式中：ΔOD为反应最初1min内340nm处OD值变化的绝对值（减去对照液最初1min的变化量）；

6.22为每mmol NADH在340nm处的光密度；N为酶液稀释倍数；2表示每

固定1mol的CO2有2mol的NADH被氧化；d为比色杯光程（cm），Δt表测定时间为1min；酶活力单位为mmolCO2/ml(酶液).min。

注意：RuBp不稳定，最好现配现用。μmol/g fresh weight·h

4 条斑紫菜丝状体和条斑紫菜叶状体磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性差异的研究

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶广泛存在与高等植物、细菌以及藻类中，催化磷酸烯醇式丙酮酸和碳酸氢根形成草酸乙酸，该反应不可逆，是C4植物光合途径中的关键酶，起着固定原初CO2的作用。在细菌中对三羧循环起着调节作用。本实验用偶联法测定酶的活性。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在PEP、

H2CO3、Mg2+存在时，形成草酸乙酸，而草酸乙酸在NADH及苹果酸脱氢酶存在下可生成苹果酸及NAD，NAD形成的速度可在340nm处进行测定，并以OD值下降0.01作为一个酶活性单位（王维光，1985；张志良等，2003）。

4.1器材与试剂

4.1.1实验仪器：

Unico UV-2100 specterometer紫外分光光度计，冷冻高速离心机，秒表，移液枪研钵。

4.1.2实验试剂：

提取缓冲液[0.1M Tris-H2SO4缓冲液，pH8.2，含7mM巯基乙醇（547mg/L），1mM EDTA（292 mg/L），5%的甘油]，洗脱缓冲液[10mM Tris-H2SO4缓冲液，含0.2mM EDTA（58 mg/L），0.2mM二硫苏糖醇（31 mg/L），5%的甘油，pH8.2]，反应缓冲液[50mM Tris-HCl缓冲液，pH9.2]，反应混合液[0.5ml 70mM Mg SO4（17.3mg/L），0.5ml 70mM NaHCO3，1ml 14mM PEP （2.9 mg/L）混合，以上溶液都用反应缓冲液配制。需用时再加入1.5ml内含0.35mg NADH及过量的苹果酸脱氢酶的反应缓冲液]。

4.2实验步骤

4.2.1 酶提取液的准备

取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预

冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10000×g离心10min，弃沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用。

4.2.2 PEPC酶活力的测定

于石英比色杯中加入反应混合液3.5ml，并加入1ml粗酶液混匀后启动反应，立即与分光光度计340nm处按3min，20s间隔读取OD值，以OD值下降0.01作为一个酶活力单位。

UV-B辐射对苜蓿幼叶内Rubisco、H2O2含量及蛋白水解酶活性的影响

[3]Makino A, Mae T, Ohira K.Colorimetric measurement of protein with Coomassie brilliant blue R on sodium dodecyl sul-fate-polycarylamide gel electrophoresis by eluting with for-mamide[J].Agr Biol Chem,1986,50:1911-1912·

2.PEPC

于花后15 d和20 d每品种各处理分别取样15株冬小麦带回实验室,旗叶和穗器官分开,在液氮中迅速冷冻并置于-80℃冰柜用于测定旗叶、颖片和籽粒PEPC活性。酶的提取按Sayre[27]方法进行。酶活性测定采用Blanke[28]的酶偶联法。

[27]Sayre R T, Kennedy R A. Photosynthetic enzyme activities and localization in Mollugo verticillata

populations differing in the leaves of C3and C4cycle operation[J].Plant Physiology,1979,64:293-299. [28]Blanke M M, Ebert G. Phosphoenolpyruvate carboxylase and carbon economy of apple seedlings[J].Journal of Experimental Botany,1992,43:965-968.

JiangD-A (蒋德安), Lu Q(陆庆), Weng X-Y(翁晓燕),etal. Regulation of Rubisco carboxylation activ-

ity and photosynthetic rate by Rubisco activase during leaf senescence in rice.Journal ofZhejiang University (Agriculture and Life Sciences) (浙江大学学报·农业与生命科学版), 2000,26(2): 119-124 ( in Chi-

小麦Rubisco的纯化、鉴定及其活性测定

Rubisco活化酶的分子生物学

1.PEPC酶活的测定

参照Ku等人的方法。在光照条件下，剪取转基因植株和非转基因植株的第五片叶0.1g

左右，快速加入1.5ml蛋白质提取缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2，1mM EDTA，

5mM DTT，5%聚乙烯吡咯烷酮，10%甘油），在冰上研磨至匀浆状，将匀浆液转移至1.5ml

微量离心管中，4℃15 000×g离心15 min，取上清转移到新离心管中，此上清液即为酶粗

提物。在室温条件下检测PEPCase活性，其检测缓冲液为50mM tricine-KOH，pH 8.0，0.1 mM EDTA，1mM DTT，10mM MgCl2，10mMNaHCO3，3U NAD-苹果酸脱氢酶，0.2mMNADH，

1ml反应体系中加入10μl蛋白质提取物，加入2mM PEP后开始计时，记录反应开始时

OD340的值和5min后OD340的值，根据OD340值的变化来计算PEPCase活性。

An improved spectrophotometric assay for ribulosebisphosphate carboxylase

脂肪酶的概述及应用

脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体得提取一、试剂配置１、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用

脂肪酶活检测原理及方法

脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法 1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。 2. 所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称830-03- 5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯 1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯 1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯 1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯 14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司 3. 标准曲线绘制： a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。方法一： b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和 (全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。

SOD酶活性测定方法

SOD酶活性测定所需药品：（1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。（3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。（4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液（5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液（6）石英砂实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂：试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）

脂肪酶活力测定方法及其比较

万方数据

苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法．１．３．３对硝基苯酚法对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积．２３种方法的比较２．１实验仪器和操作难易程度的比较平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２?１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。操作简单［２?１８］（表１）．２．２实验试剂及精确度的比较平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。１７｜．对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［２．１８］（表１）．２．３各种方法的适用范围平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长．因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［１１］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［２］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高。但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［１５］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［１６－１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［２．１８］（表１）．表Ｉ平板法、滴定法及比色法的比较３结论在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性．在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适ｐＨ、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行。从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信．另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义。给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算?４４?酶活．致谢本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助．参考文献：［１］ＧＵＰＴＡＲ，ＧｕｐｔａＮＲａｔｈｉＰ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｐａｓｅｓ：ａｎｏ’ｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—ｇＹ。２００４，６４（６）：７６３—７８１．万方数据

脂肪酶活检测原理及实际方法：

脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法 1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。 2.所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称 830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司 3.标准曲线绘制： a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L): 称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。方法一： b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。

测定酶活方法

Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seeding 方法 1测定土壤及植物水状况（1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。在DAP（开花后的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦化前称重。（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。（3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。 Notice 1RWC计算：RWC=（W f－W d）／（W t－W d）×100% 2WC计算：WC=（W f－W d）／W f×100% W f：叶片鲜重； W d：叶片干重； W t：叶片吸水饱和时的重量。 2酶粗提液的制备为了测定CA T，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟15000g，4℃，离心20min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，离心15min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。 3酶活性的测定所有的分光光度分析都使用Hitachi U-2000型分光光度计。 3.1SOD总活性的测定按照Giannopolitis和Ries（1977）的方法略作修改（Chowdhury和Choudhuri，1985；Zhang et al。，1995）。3ml反应混合液中含63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）和20μL酶液。核黄素应最后添加。将盛有反应混合液的试管放置在两盏4000lux荧光灯下，打开荧光灯，反应开始，照光10min，关闭荧光灯，反应终止，马上测定它在560nm处的吸光度。不照光的反应体系在560nm 处的吸光度作为对照，并将之从A560中减去。不加酶液的反应体系颜色最深，说明NTB被还原量最大。NTB的光还原量与SOD的活性呈反比。SOD酶活性采用抑制NBT光还原50%为一个酶活单位。 Notice：不加酶液的反应体系，以缓冲液代替酶液，其560nm处的吸光度作空白。试剂：63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）试剂：NTB，核黄素，蛋氨酸，EDTA，磷酸缓冲液（pH7.8） 3.2CA T与愈创木酚POD活性按照Chance和Machly的方法测定（1955）。对CA T来说，其活性可以根据反应混合液1min内在240nm处的吸光度随着H2O2的分解而降低程度来确定（ε=39.4M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含50mM磷酸缓冲液（pH7.0），15mMH2O2，0.1ml酶液。加入酶液反应即开始。对POD来说，其活性可以通过测定反应混合液在460nm处的吸光度在1min内因愈创木酚的氧化作用而增加来确定（ε=26.6M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含20mM愈创木酚50μl，10mM磷酸缓冲（pH7.0）2.83ml，0.1ml酶液。加入40mMH2O220μl后反应开始。试剂：H2O2，愈创木酚 3.3AP的活性可以根据反应混合液在290nm处的吸光度在1min内降低程度来确定（ε=2.8mM －1cm－1，Nakano和Aasda，1981）。反应混合液包含0.5mMAsA,0.1mMH2O2,0.1mMEDTA,50mM 磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.15ml酶液。加入H2O2后反应开始。该反应速率可以通过减去未加酶液反应体系的反应速率进行校正。

脂肪酶、淀粉酶测定方法

脂肪酶测定——采用p-NPP法取0.5g样品，加去离子水10mL，40℃水浴浸泡2h，过滤。取滤液1mL于试管中，加入pH8.0缓冲液3mL和1mmol/L p-NPP溶液0.1mL 于40℃下精确反应3min，迅速置于冰上终止反应。在波长405nm处测定吸光度值。对照管酶液用等体积去离子水代替，其余试剂相同。Npp标准曲线Y=0.287x+0.0861 （y：吸光度x：NPP浓度（umol/L））试剂配制： 1mmol/L p-NPP溶液：称取0.0378g pNPP，加入1mL曲拉通-100与5mL异丙醇，用Tris-HCL（pH8.0）定容至100mL。 pH8.0 Tris-HCl：50mL 0.1M tris碱溶液与29.2mL 0.1M HCl溶液混合，加蒸馏水定容至100mL。淀粉酶测定称取六神曲0.5g，研细，用20mL去离子水40℃浸泡1h，过滤。取2只250mL的碘瓶，各加入5%的淀粉液25mL，10mL醋酸钠缓冲液（pH4.5），10mL蒸馏水，摇匀，40℃水浴预热5min。A管中加入滤液5mL，准确反应1h，立即加2mol/L HCl 1mL终止反应，B管中先加入HCl，再加滤液5mL。2只碘瓶分别加入0.05mol/L碘液10mL，0.1mol/L氢氧化钠45mL，边滴边振摇，暗处放置20min，加入1mol/L 硫酸2mL，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。每份样品测定3次。记录消耗硫代硫酸钠的体积，计算得淀粉酶活力。

淀粉酶活力是指1g六神曲粉末在一定条件下(T=40℃，pH=5.0)，1h 内催化可溶性淀粉水解生成葡萄糖的毫克数。计算公式: 淀粉酶活力=［c×(vB－vA)·M·N］/2×m·t 式中:c为硫代硫酸钠的浓度(mol/L)，M为葡萄糖的摩尔质量(g/mol)，N为酶液稀释倍数，V A为样品滴定值(mL)，VB为空白滴定液(mL)，m为六神曲的取样量(g)，t为反应时间(h)，淀粉酶活力单位为mg/(g·h) 。试剂配制 pH4.5醋酸钠缓冲液：18g醋酸钠加9.8mL冰醋酸，定容至1000mL。1mol/L硫酸溶液：量取6mL浓硫酸，倒入适量水中，用水稀释至100mL。 0.1mol/L碘液：取碘13.0g，加碘化钾36g与水50ml溶解后，加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。蛋白酶活力测定称取六神曲1g，研细，加蒸馏水20ml，于40℃水浴放置1h，间断搅拌，过滤，滤液以磷酸钠缓冲液稀释1倍。取1mL稀释液置离心管中，于40℃水浴预热5min，加入预热的酪蛋白1mL，保温10min，立即加入0.4 mol / L 三氯醋酸2 ml，终止反应，继续置水浴中保温20 min，使残余蛋白质沉淀后离心滤过。取1 mL滤液，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5 mL，福林试液1 mL，蒸馏水2 mL，摇匀，置水浴锅中，40 ℃保温显色20 min。以试剂溶液为空白，于763 nm 波长处测定吸光度。在40℃时每1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位。

各种酶活性测定方法

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法（1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，

2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na

各种酶活力测定方法及注意事项

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法

碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL）取 100 μg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/ （mL）

0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法（1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1）式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。（2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。

蛋白酶活力测定方法

酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）

简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml）特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业：本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业：食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产：能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化：提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。

脂肪酶实验方案

脂肪酶实验方案富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6. 0 ,7.0 ,8. 0. 种子培养基( %) :葡萄糖2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0. 1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。脂肪酶高产菌株的筛选：（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。脂肪酶催化对- 棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ- nitrophenol, 在该过程中不断测定其光吸收值的变化。根据单位时间产生ρ- nitrophenol 的量来反应脂肪酶的活力。（本实验采用如下方法：分别向各菌株等量上清液中加入等量过量的对- 棕榈酸硝基苯酯，在反应过程中不断测定其光吸收值的变化，根据吸光值变化幅度确定产酶量大小。） [A液:16.5mmol/L的对硝基苯棕搁酸酯(p一NPP)的异丙醇溶液(冷藏，两周内使用)。B液:含有0.4%Trilonx一100和0.1%阿拉伯树胶的50mmol/L的Tris一HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液1:9混和，取100ul适当浓度的酶液加人900ul的上述混和液中，混匀，37℃反应10min后，用可见分光光度计(410nm)读取A值。在此反应条件下，对硝基苯的消光系数是1.46x105cm3/mol。1个单位的脂肪酶活力定义为每分钟分解p一NPP并释放出1umol对硝基苯所需的酶量。] (ii)平板法：采用三丁酸甘油脂平板鉴定法,鉴定板含2 %的三丁酸甘油脂乳化液和2 %的琼脂粉。取10μl粗酶液加入鉴定板上各小孔(直径0. 20cm) 中,特定温度下放置12h 后,通过水解透明圈的直径大小来测定脂肪酶酶活性大小。菌株产酶条件的优化碳源对产酶的影响；分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、糊精、玉米淀粉、大豆油、橄榄油为碳源(均为2 %) 进行发酵,以平板透明圈法测定其产酶情况。

纤维素酶活力测定方法_张瑞萍

测试与标准纤维素酶活力测定方法张瑞萍南通工学院(226007) 摘　要　用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。叙　词:　测试　纤维素酶　活度中图分类号:　TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1　实验方法 1.1　化学药品、材料纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2　FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3　针织物酶减量率的测定将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重处理前织物干重 ×100% 2　结果与讨论 2.1　显色剂的选择选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖　H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2　最大吸收波长的确定选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。图1　D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3　底物及酶本身含糖量的影响在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4　葡萄糖标准曲线用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印　染(2002No .8) www .cdfn .com .cn

粮食脂肪酶活力、脂肪酸及其组成测定

粮食脂肪酶活力、脂肪酸及其组成测定试验方法脂肪酶活力的测定参考文献(Aizono et al.，1973)的方法。准确称取6.00g糙米粉，加入Tris-HCl (pH7.5)定容至25mL，振荡均匀，置于4℃下浸提1 h，然后于4℃下10000 r/min 冷冻离心15min，过滤。取滤液l.5mL于试管中，依次加入l mL 0.5 mol/L KCl，l mL 5 m mol/L CaCl2，0.5mL Tris-HCl (pH7.5)，然后置于37℃恒温水浴摇床中保温10 min，加入l mL三乙酸甘油酯在37℃恒温水浴摇床中震荡反应l h，沸水浴灭酶10min。以酚酞-乙醇为指示剂，采用0.05 mol/L NaOH滴定至微红，记录滴定所消耗的体积V。脂肪酶活力定义为：在上述反应条件下，每分钟消耗0.05 mol/L NaOH 0.01mL为1个酶活力单位U。酶活力(U) = (V-V0)×l00 / t 其中：V为样品所消耗NaOH的体积(mL)，V0为空白消耗NaOH的体积(mL)，t为反应时间(min)，100为NaOH体积转化为酶活力单位的系数。数据处理以每克绝干糙米中脂肪酶活力进行分析。游离脂肪酸含量的测定参考GB/T15684-1995的方法。准确称取5.00 g糙米粉于250 mL锥形瓶中，加入40 mL无水乙醇在25 ℃恒温振荡10 min，过滤。取25 mL滤液用标准KOH-乙醇溶液滴定。以每100g绝干稻谷消耗的KOH毫克数表示游离脂肪酸的含量。脂肪酸组成的测定样品处理：准确称取糙米粉10.00g置于100mL锥形瓶中，加入20mL氯仿-甲醇溶液(体积比为2：l)，用均质机均质20s，然后用5mL氯仿-甲醇溶液洗涤均质

酶活性测定方法

一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；

脂肪酶

脂肪酶的应用进展综述 09生物技术0902021040 陈莹莹摘要：脂肪酶被认为是工业中很重要的一利酶。本文概述了当前研究中广泛使用的脂肪酶及其固定化产品的应用途径, 包括在食品加工、饲料、纺织、医药、生物柴油和传感器等领域中的应用。脂肪酶应用的主要障碍是其成本高。但技术进步尤其是基因技术的发展有望使成本降低, 脂肪酶在药物合成中的应用在本文中也作了展望。关键词：脂肪酶；性质；生产；来源，应用脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。一、脂肪酶的来源脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。二、脂肪酶的性质脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(V eeraragavan等)。总