微生物检测方法USP

<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查

简介：

下述方法能够对在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌进行定量计数。

该检查主要是为了确定某种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。当以此为目的时，按照下面给出的规定进行，包括所需的样品数量以及按照下文规定的要求对结果进行描述。

此方法不适用于用活微生物作为活性成分的产品。

若使用了其他的微生物程序，包括自动方法，则应提供其等同于药典方法的证明。

一般程序

为了避免外来微生物的影响，必须在设定的条件下进行微生物检查。为避免此污染所采取的预防措施必须不影响所要进行检查的微生物。

如果待测样品具有抗微生物活性，则在可能的情况下，移除或中和这种抗微生物活性。如果因此而是用了钝化剂，则必须证明其有效性及对微生物无毒性。

如果在处理样品时使用了表面活性剂，必须证明其对微生物无毒性及与证明其所使用的钝化剂的兼容性。

计数方法

用薄膜过滤法和平皿计数法。最大机率法（MPN）一般来说最不准确的微生物计数方法。但是对于生物负荷非常小的确定的产品来说可能是最适合的方法。

对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素。所选择的方法必须能够用足够的样品来判断出其是否符合标准规定。必须证明所选择的方法的适用性。

生长促进试验、计数方法的适用性和阴性对照

一般原则

必须证明检测方法能够从携带微生物的样品中检测出此微生物。如果在检测

过程中有了改变或会影响检测结果的产品的改变，则必须证明其适用性。

测试菌株的准备

用标准化的测试菌株的稳定混悬液或用下述规定的方法准备测试菌株。使用菌种培养维护技术（菌种系统），以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物不大于5个片段。按照表1中所描述的方法分别对细菌和真菌的测试菌株进行培养。

用PH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH 7.2 磷酸盐缓冲液来配制测试混悬液；制备A. brasiliensis 孢子混悬液，可加入0.05%的聚山梨酯80。在2小时内使用该混悬液或如果在2°－8°储存则在24小时内使用。作为一种替代的方法，可以配制并稀释植物细胞A. brasiliensis或B. subtilis de 新鲜混悬液，配制一份孢子的稳定混悬液，然后用适量的此孢子混悬液进行接种。此稳定的孢子混悬液可在2°－8°在验证过的一段时间内保存。

阴性对照

为了确认检测条件，用稀释剂代替样品溶液进行阴性对照。阴性对照必须没有微生物生长。在检测“产品检测”项下描述的产品时也需要进行阴性对照，阴性对照失败需进行调查。

培养基生长促进

对每一批准备好的培养基和每一批由脱水培养基或原料制成的培养基进行检测。在大豆酪蛋白消化肉汤和大豆酪蛋白消化琼脂部分/培养皿上接种表1中规定的少量微生物（不大于100CFU），每种培养基使用单独的部分/培养皿。在沙氏葡萄糖琼脂培养皿中接种表1中规定的少量微生物（不大于100CFU），每种培养基使用单独的部分/培养皿。根据表1中的规定进行培养。

表1.检测微生物的准备和使用

对于固体培养基，由一个大于2的因子和由标准化接种物计算值得到的增长必须相同。对于新制备的接种物，微生物的生长情况应该和之前一批经过检测并验证的培养基的情况相比较。如果与之前一批经过检测并验证的培养基的情况相比较，微生物的生长情况是明显可见的，那么液体培养基亦适用。

产品中计数方法的适用性

制备样品

制备样品的方法取决于待测品的物理性质。如果以下程序均不能达到令人满意的效果，则应开发其他替代的程序。

水溶性待测样品：在PH7.0的氯化钠-蛋白胨溶液、PH7.2的磷酸盐缓冲液或大

豆酪蛋白消化肉汤中溶解或稀释（通常准备1：10的稀释液）待测样品，将PH 值调节至6-8。如果需要进一步稀释，应使用相同的稀释剂。

不溶于水的非脂肪性样品：在PH7.2磷酸盐缓冲液，PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或大豆酪蛋白酶消化肉汤中制备待测品混悬液（通常按1：10稀释），可加入例如1g/L的聚山梨酯这一类表面活性剂来帮助亲水性差的物质形成悬液。如果需要调节PH到6-8。如果需要，可用同样的稀释剂进一步稀释。

脂肪性产品：用经过除菌过滤后的肉豆蔻酸异丙酯溶解样品，或将样品与最小需要量的无菌聚山梨酯80或其他加热后的无菌的无抑制性的表面活性剂混合，如果需要加热，温度应不超过40°，对特殊的产品，应不超过45°。小心混合，如果需要在水浴中保持此温度。加入足够量的用预热过的稀释剂进行1:10稀释后的待测样品。小心混合，直至形成乳状液。用含有适量无菌聚山梨酯80或其他非抑制性的表面活性剂的稀释剂进行连续的十倍稀释。

气溶胶中的液体或固体：在无菌条件下将待测样品转移至薄膜过滤器或无菌的容器中以进行进一步的取样。使用全部或者每个容器中计算出的剂量作为样品。透皮贴剂：移除透皮贴剂的保护层，将其放置在无菌的玻璃或塑料盘中，有粘性的一面向上，用一层能透气的盖住透皮贴剂的粘性表面以防其粘在一起，然后将贴剂转移到适量的含有像聚山梨酯80和/或卵磷脂等钝化剂的稀释剂中，大力振摇至少30分钟。

接种和稀释

向按上述方法制备的样品及对照中（无待测样品）加入适量的微生物混悬液以得到不大于100CFU的接种物。接种物的体积应不大于稀释的待测样品的体积的1%。

为了证明待测样品中可接受的微生物的回收率，必须用样品的最低可能稀释因子进行检测。如果由于抗微生物活性或者溶解性差而无法用样品的最低可能稀释因子进行检测，则必须寻求其他合适的方案。若不能避免对样品生长的抑制，在中和、稀释或过滤后应加入等分的微生物混悬液。

中和/移除抗微生物活性

按照“接种和稀释”的规定进行稀释的样品中微生物的回收率及按照“产品中微生物的回收率”进行培养，与对照中微生物的回收率进行比较：如果生长被抑制（由于因子大于2而降低），则变更该计数检测方法的程序以保障结果的有效性。变更的程序可包括，例如：

（1）增加稀释剂或培养基的体积；

（2）将特定的或一般的中和剂混入稀释剂中；

（3）薄膜过滤；上述措施结合。

中和剂：中和剂用中和样品中的抗微生物活性（见表1）。最好在灭菌前将其加入到所使用的稀释剂或培养基中。如果使用了中和剂，必须做一个有中和剂无样品的空白来证明中和剂的有效性及其对微生物无毒性。

表2. 干扰物质的中和剂/方法

如果没有合适的中和方法，可以假设已接种微生物的分离失败是由于产品的微生物活性。这些信息表明样品不容易被给出的微生物污染。但是，有可能这种产品只抑制了一些在此指定的微生物，但不抑制一些不包含在测试菌株内或不具有代表性的微生物。因此，使用与微生物生长和规定的可接受标准相兼容的最大稀释因子进行检测。

产品中微生物的回收率

对列出的每种微生物，应分别进行试验。只对加入测试菌株的微生物进行计数。薄膜过滤：使用标称孔径不大于0.45μm，这种过滤器材质的选择是基于细菌保留效率不被待测样品的组分影响这样的理念。对列出的所有微生物，使用一个薄膜过滤器。

将按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的适量样品（大约1g样品，如果测定的CFU较多的话，可减少样品数量）移入到薄膜过滤器内，立即过滤，用适量的稀释剂冲洗薄膜过滤器。

测定需气菌总数（TAMC）时，将薄膜过滤器移到大豆酪蛋白消化琼脂表面上。测定霉菌及酵母菌总数（TYMC）时，将薄膜过滤器移到沙氏葡萄糖琼脂表面上。按表1的规定进行培养，然后计数。

平皿计数法：平皿计数法对每中培养基至少用2个培养皿进行培养，结果取其平均数。

注皿法：用直径为9cm的皮氏培养皿，加入1ml按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的样品及15-20ml大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，这两种培养基均在不大于45°的条件下保存。如果使用更大的皮氏培养皿，琼脂培养基的数量也要相应的增加。对每种表1中列出的微生物，至少分别需要2个皮氏培养皿。

按照表1中的规定进行培养，用每个培养基计算的平均值，计算原始接种物中的CFU数。

表面分布法：用直径为9cm的皮氏培养皿，在45°时向每个培养基中加入15-20ml大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，使其凝固。如果使用更大的皮氏培养皿，琼脂培养基的数量也要相应的增加。干燥培养基，例如在层流柜中会培养器中。对每种表1中列出的微生物，至少分别需要2个皮氏培养皿。将经过测量的不少于0.1ml的按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的样品分布在培养基表面。按照“注皿法”的规定进行培养基计数。

最大机率法（MPN）：最大机率法的精确性和准确度均小于薄膜过滤法和平皿计数法。霉菌的计数结果尤为不可靠。由于这种原因，在没有其他可靠的方法情

况下，则在TAMC计数中可使用最大机率法。如果对使用这种方法给出了合理说明，则按照以下规定进行。

按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法，对样品连续进行3次10倍稀释。对每个等级的稀释， 1g或1ml等分3份分别接种到3个盛有9-10ml大豆酪蛋白酶消化肉汤的试管中。如果需要，可向培养基中加入像聚山梨酯80一类的表面活性剂，或如抗微生物剂一类的钝化剂。因此，进行三个等级的稀释，共需要接种9支试管。

在30-35℃的条件下培养所有试管，不超过3天。若由于产品的性质导致测试结果的难以辨别或不确定，则在相同的肉汤或大豆酪蛋白酶消化琼脂进行传代培养，在相同温度及相同的条件下培养1-2天，并以传代培养的结果作为检测结果。根据表3，确定待测样品每克或每毫升中微生物最大几率值。

表3. 微生物最大几率值

结果和说明

当核实薄膜过滤法和平皿计数法的适用性时，样品中测试微生物的平均值通过一个大于2的因子后，应与按照“接种和稀释”项下的要求所做的对照的值一致。当核实最大机率法的适用性时，接种物的计算值必须在对照所得结果的95%置信区间内。

如果用上述的任一方法对微生物进行检测，检测结果无法达到规定的标准，可以使用与标准最接近的方法和实验条件来检测样品。

样品的检测

样品使用量

除另有规定外，取10g或10ml待测样品。对于气溶胶中的固体或液体，取10个单位容量。对于透皮贴剂，取10剂。

对于下述活性物质使用的样品量会减少：每个单位剂量（如片、粒、支）小于或等于1mg，或每克或每ml（对于某些无法用单位剂量来衡量的制剂）中药物活性物质的含量小于1mg。在上述情况中，所使用的待测样品量应不少于10个单位剂量或取用10g或10ml样品。

对于用作活性成分的物质，如果样品量已被限制或批量很小（例如小于1000ml或1000g），测试取样量应为批量的1%，除非另有规定或给出合理的理由或是被批准可以使用更少用量的样品。

对于批量少于200个实体的样品（例如用作临床试验的产品），样品量可以减少至2个单位，如果批量少于100个实体，样品量可减少至1个单位。

对未包装的物料或已包装制剂以最小包装单位随机抽取样品。为得到规定的取样量，混合足够数量的最小包装单元来取得样品。

样品检测

薄膜过滤

使用可以移动到培养基内的过滤器。根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，将适量的样品分别移入两个薄膜过滤器中，立即过滤。用的适宜的程序清洗过滤器。

测定TAMC时，将一个薄膜过滤器移到大豆酪蛋白消化琼脂的表面。测定TYMC

时，将另一个薄膜移到沙氏葡萄糖琼脂表面。盛有大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿在30°-35°培养3-5天，盛有沙氏葡萄糖琼脂的培养皿在20°-25°培养5-7天。计算每克或每ml样品中的CFU数。

此处有一段有关透皮贴剂的检测方法没有翻译出。

平皿计数法

注皿法：根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，对每种培养基的每个稀释等级至少准备两个皮氏培养皿。盛有大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿在30°-35°培养3-5天，盛有沙氏葡萄糖琼脂的培养皿在20°-25°培养5-7天。根据需要稀释的等级以及TAMC需要显示的最大菌落数为250、TYMC需要显示的最大菌落数为50等来选择培养皿。用每个培养基的算数平均值来计算每克或每ml样品中的CFU数。

表面分布法：根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，对每种培养基的每个稀释等级至少准备两个皮氏培养皿。按照“注皿法”项下的描述进行培养和计算CFU数。

最大机率法：

根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法。所有试管均在30°-35°培养3-5天。如果需要的话用适宜的程序进行传代培养。记录每个稀释等级的试管中微生物的生长情况。根据表3来确定每克或每ml样品中微生物的最可能数量。

结果说明

大豆酪蛋白酶消化琼脂中的CFU数就视为需气菌总数（TAMC）；若在此培养基中检测到真菌的菌落，则也视为TAMC的一部分。沙氏葡萄糖琼脂中的CFU数就视为酵母菌/霉菌总数（TYMC）；若在此培养基中检测到细菌的菌落，则也视为TYMC 的一部分。当由于细菌的生长致使TYMC超出了可接受标准时，就需要用到含有抗生素的沙氏葡萄糖琼脂。用MPN方法计算出的值为TAMC。

微生物质量可接受标准描述如下：

—101CFU：最大可接受值=20；

—102CFU：最大可接受值=200；

—103CFU：最大可接受值=2000，等等。

推荐使用的溶液及培养基会在<62>控制菌的检测中列出。

<62>非无菌产品微生物检测：控制菌的检测

简介

下述的检测方法是用来限制或确定没有按所描述的条件可检测到的控制菌存在。

这些方法最初是用来确定一种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。当用作此种目的时，请按下述说明程序进行，包括需要的样品数及按照下述的要求对检测结果进行说明。

其他的微生物程序包括自动的方法，有可能会被用到，这需要证明这些方法等效于药典的方法。

一般程序

按照“<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述对样品进行处理。如果待测样品有抗菌活性，需要按照“<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”的要求除去或中和这种抗菌活性。

如果在准备样品时使用了表面活性剂，那么就需要按照“<61>非非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”.的要求证明这些表面活性剂对微生物是没有毒性的，以及他们与所使用的钝化剂是可以兼容的。

培养基的生长促进和抑制特性、检测的适用性及阴性控制必须证明使用的检测方法能够从待测样品中检测出微生物的存在。如果检测方法有改变或引入了会影响检测结果的样品，则需要证明方法的适用性。

检测菌株的准备

使用下述的标准化的检测菌株。使用菌种培养保养技术（菌种系统），以使用于培养的微生物从原始主菌种中移除的片段不大于5个片段，。

需氧微生物

用大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂分别培养每种检测菌株，在30°-35°培养18-24小时。用沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤在20°-25°单独培养白色念珠菌菌株2-3天。

用PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2的磷酸盐缓冲液制备检测混悬液。在2小时内使用该混悬液，如果在2-8℃贮存的话，在24小时内使用。

梭状芽孢杆菌

用产芽胞梭状芽胞杆菌，例如ATCC11437(NBRC14293，NCIMB12343，CIP100651)或ATCC19404(NCTC532或 CIP79.3)或NBRC14293。在30°-35°无氧条件下，用梭状芽胞杆菌强化培养基培养梭状芽孢杆菌检测菌株24-48小时。作为一个可供选择的方法，准备及稀释一个新的用作接种的稳定的Cl.sporogenes 植物细胞混悬液。在验证过的周期内这个稳定的混悬液可以在2°-8°保存。

阴性对照

为了证实检测条件，用选定的稀释剂代替样品进行阴性对照，阴性对照必须无微生物生长。在检测“样品检测”项下描述的样品时也需要进行阴性对照。失败的阴性对照需要进行调查。

培养基的生长促进和抑制特性

测试每一批现成的培养基及每一批用脱水培养基或原料制成的培养基。照表1的描述来验证相关培养基的特性。

表1.培养基生长促进、抑制及指示特性

表2.6.13.1—培养基生长促进、抑制及指示特性

液体培养基促生长特性试验

用适当的培养基接种少量的（不超过100CFU）适当的微生物，在规定温度下培养，培养时间不大于规定的最短培养时间。清晰可见的微生物的生长情况应与先前试验所观察到的结果及已批准批次的培养基得到的结果是一致的。

固体培养基促生长特性试验：

用表面分布法（<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查中的平皿计数法），每个培养基接种少量的（不超过100CFU）适当的微生物，在规定温度下培养，培养时间不大于规定的最短培养时间。清晰可见的微生物的生长情况应与先前用已批准批次的培养基试验所观察到的结果是一致的。

液体或固体培养基生长抑制特性试验：

用适当的培养基接种至少100CFU适当的微生物，在规定的温度下培养，培养时间不少于规定的最长培养时间，应观察不到所测试的微生物的生长情况。指示特性试验：

用表面展开法用适当的培养基接种少量（不超过100CFU）适当的微生物，在规定的温度下培养在规定范围内的一段时间，菌落的外观及指示反应应与先前用已批准批次的培养基试验得到的结果是一致的。

检测方法的适用性

按照“样品检测”项下所描述的相应方法对样品进行处理，混合时在规定的生长培养基内加入测试菌株，分别培养每个测试菌株。在已接种的测试准备时加入不多于100CFU的微生物。

按照“样品检测”项下的相应内容进行试验，培养时间为规定的最短培养时间。

控制菌必须用“样品检测”项下描述的指示反应来进行检测。

任何抗菌性都导致需要对检测程序进行修改（见<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查中中和/移除抗微生物活性项下的规定）。

如果用规定的方法无法中和待测样品的抗菌活性，那就假设这种微生物在样品中不存在。

样品检测

耐胆汁的革兰氏阴性菌

样品准备和预培养：照“<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”中所述，取不少于1g的被检测样品进行1:10的稀释，用大豆酪蛋白消化肉汤为稀释剂，混合并在

20°-25°培养一段时间至使细菌复活，但不致繁殖（通常为2小时，但不大于5小时）。

不存在的检测：除另有规定外，取按“样品准备和预培养”处理后相当于1g样品的体积，接种到肠道菌浓缩肉汤-莫塞尔中。在30°-35°培养24-48小时。用紫红胆盐葡萄糖琼脂在30°-35°传代培养18-24小时。

如果没有菌落生长表示产品符合试验标准。

定量检查

选择和传代培养：将适量按“样品准备和预培养”所述制备样品和/或分别将含有0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml及0.001ml）待测样品的稀释溶液接种到肠道菌浓缩肉汤-莫塞尔，在30°-35°培养24-48小时。再用紫红胆盐葡萄

糖琼脂在30°-35°传代培养18-24小时。

说明：有菌落生长为阳性结果。记录显示阳性结果的最小样品数量及显示阴性结果的最大样品数量，根据表2确定细菌的可能数量。

表2. 结果说明

大肠埃希菌

样品准备和预培养：照“<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于1g的被检测样品进行1：10的稀释，取10ml或相当于1g或1ml 的数量接种到适量的（照“检测方法适用性”项下的描述确定）的大豆酪蛋白消化肉汤上，混合，在30°-35°培养18-24h。

选择和继代培养：振摇容器，将1ml大豆酪蛋白消化肉汤加入到100ml 麦康基肉汤中，在42°-44°培养24-48h。再用盛有麦康基琼脂的培养皿在30°-35°传代培养18-72小时。

说明：有菌落生长表示有大肠埃希菌存在的可能，这可以通过鉴别试验确定。

如果没有菌落生长或鉴别试验呈阴性表示产品符合试验标准。

沙门氏菌

样品准备和预培养：照“<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于10g或10ml的样品接种到一定数量（根据“检测方法适用性”项下的描述确定）的大豆酪蛋白消化肉汤上，混合，在30°-35°培养18-24h。

选择和继代培养：将0.1ml大豆酪蛋白消化肉汤到10ml绿沙门氏菌浓缩肉

汤中，在30°-35°培养18-24h。用戊醛糖、赖氨酸和脱氧胆酸琼脂在30°- 35°传代培养18-48h。

说明：发育良好的、有或没有黑色中心的红色菌落都表示沙门氏菌存在的可能性，这可以通过鉴别试验确定。

如果所描述的这种类型的菌落不存在或鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。

绿脓杆菌

样品准备和预培养：照<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于1g的被检测样品进行1：10的稀释，取10ml或相当于1g或1ml 的数量接种到一定数量（根据“检测方法适用性”项下的描述确定）的大豆酪蛋白消化肉汤上，混合。当检测透皮贴剂时，用无菌过滤膜过滤相当于1剂待测样品容量的样品（见<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查中制备样品项下透皮贴剂的描述），接种到100ml大豆酪蛋白消化肉汤上，在30°-35°培养18-24h。

选择和继代培养：用溴棕三甲铵琼脂在30°-35°传代培养18-72h。

说明：有菌落生长表示有绿脓杆菌存在的可能性，这可以通过鉴别试验确定。

如果没有所描述的菌落生长或核实性的鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。

金黄色葡萄球菌

样品准备和预培养：照“<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于1g的被检测样品进行1：10的稀释，取10ml或相当于1g或1ml 的数量接种到一定数量（根据“检测方法适用性”项下的描述确定）的大豆酪蛋白消化肉汤上，混匀。当检测透皮贴剂时，用无菌过滤膜过滤相当于1剂待测样品容量的样品（见<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查中制备样品项下透皮贴剂的描述），接种到100ml大豆酪蛋白消化肉汤上，在30°-35°培养18-24h。

选择和继代培养：用甘露醇盐琼脂在30°-35°传代培养18-72h。

说明：如果有被黄色区域包围的黄色或白色菌落生长则表示有金黄色葡萄球菌存在的可能性，通过鉴别试验确定。

如果没有所描述的菌落生长或核实性的鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。

梭状芽胞杆菌

样品准备和预培养：照“<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于2g或2ml的被检测样品进行1：10的稀释(最小总体积为20ml)，将样品分为2份，每份最少应为10ml。一份在80℃加热 10分钟后迅速冷却，一份不加热。

选择和继代培养：两份样品各取10ml或相当于1g或1ml的数量接种到一定数量（根据“检测方法适用性”项下的描述确定）的梭状芽胞杆菌强化培养基上。在无氧条件下以30°-35°培养48h。培养结束后，用哥伦比亚琼脂在无氧条件下以30°-35°传代培养48-72h。

说明：出现无氧生长的对过氧化氢酶显阴性反应的杆状菌（有或无内孢子）表示有梭状芽胞杆菌存在。通过鉴别试验确定。

如果没有所描述的菌落生长或核实性的鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。

白色念珠菌

样品准备和预培养：照“<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取10ml或不少于相当于1g或1ml样品量的样品接种到100ml沙氏葡萄糖肉汤上，，混合，在30°-35°培养3-5天。

选择和继代培养：用沙氏葡萄糖琼脂在30°-35°传代培养24-48h。

说明：出现白色菌落表示有白色念珠菌存在的可能，这通过鉴别试验确定。

如果没有所描述的菌落生长或核实性的鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。

推荐的溶液和培养基

注：该部分给出了一些信息

以下溶液和培养基在检测药典对其规定的微生物污染时是令人满意的。在证明其适用性后也可以使用其他的培养基。

备用缓冲溶液：取34g磷酸二氢钾，置1000ml 容量瓶中，用500ml纯化水

溶解，用氢氧化钠调节PH至7.2±0.2，再加纯化水至刻度线，混匀。分装于适宜的容器中，灭菌。在2-8℃存放。

PH为7.2的磷酸盐缓冲液：用备用缓冲溶液与纯化水混合（体积比1：800 ），灭菌。

以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。

调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为7.3±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。

常见的微生物检测方法

常见的微生物检测 方法

摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同

时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：

食品微生物检测方法的研究进展

食品微生物快速检测方法的研究进展 【摘要】本文从食品安全与卫生的角度出发，介绍了分子生物学方法中的核酸探针检测法、基因芯片检测法、PCR技术检测法的检测原理及优缺点、在食品微生物检测中的应用。 【关键词】食品微生物、快速、检测、分子生物学 随着世界食品开发、生产、销售的迅速发展与人们生活水平的不断提高，研究和建立食品微生物快速检测方法以加强对食品卫生安全的监测越来越受到各国科学家的重视，其关键是及时、准确地检测出食品中的微生物。传统的检测方法准确性、灵敏性均较高，但有涉及的实验较多、操作繁琐、效率低等缺点。近年来，微生物的快速检测和自动化研究进展声速，主要包括微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等方面及其它们的结合应用。本文主要介绍分子生物学方法中的核酸探针检测法、基因芯片检测法和PCR技术检测法 分子生物学方法 随着微生物学、生物化学和分子生物化学的飞速发展，对微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针和聚合酶链反应，以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于信源性病原菌的检测。 1 核酸探针法 细胞核酸DNA 和RNA 是唯一一类可以传递遗传信息的大分子，而每一种病原体都有独特的核酸片段，核酸探针是带有将已知核苷酸DNA或RNA片段用同位素或其它方法标记的基因特异片段，它主要利用碱基配对原理，使互补的2条核酸单链形成双链。 根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针或RNA探针；根据选用基因的不同又可分为两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。 美国GENE-TRAK公司研制出了脱氧核糖核酸杂交筛选比色法，主要利用特异的基因探针对沙门菌、李斯特菌和大肠杆菌的rRNA进行检测。检测步骤如下：先设计出与细菌rRNA互补的基因探针，待检样经过增菌培养后，溶解细菌并加入带有标记的探针进行液相杂交：如果待检样中存在靶细菌rRNA、荧光素标记的检测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸末端捕获将与目标rRNA序列杂交；此后，把包被多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸的固相载体测杆插入杂交溶液中，利用多聚脱氧腺嘌呤核苷酸与多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸间的碱基配对将杂交核酸捕获于固体载体中，并将固相载体真培养于过氧化酶-抗荧光素接合剂中，使探针上的荧光素与结合剂结合；最后，将固相载体置于酶底物-色原溶液中，使过氧化酶与底物反应，在450nm处测量吸光度值，以确定样品中是否存在靶细菌。 总的来说，核酸探针技术是一种理想的快速检测技术，它最大优势是特异性和敏感性，而且兼备组织化学染色的可见性和定位性，主要用于食品致病性病原微生物的检测。但是也存在一定问题，如每检测一种菌就需要制备一种探针，而且目前尚未建立所有菌种的探针；要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养；对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测出，所以该技术还有待进一步发展。 2基因芯片技术 基因芯片的基本原理是将各种寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。

微生物检验方法验证方案

微生物限度检查方法（平皿法） 验证方案 目录 一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 2．验证方法步骤 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.2验证试验操作 3.3试验结果 4．验证结果评价分析

5．附件 微生物限度检查方法（平皿法）验证文件一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 1验证方案的起草

2．验证方案的审核与批准 验证方案审核人：审核日期：年月日验证方案批准人：批准日期：年月日三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 1.1 验证目的 为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。 1.2 原理 通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。 2．验证方法步骤 2.1验证前的准备进行微生物限度检查方法（平皿法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。 2.2验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。 2.3试验结果可接受标准用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化工作台、生物安全柜、

微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)

微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株

铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将

微生物检验(完整版)

微生物检验（完整版） 名解 微生物：是一群个体微小结构简单肉眼不能看见的微小生物的总称 种：亲缘关系较近的微生物群体在进化发育阶段上有一定的共同形态和生理特征 微生物学：生物学的一个分支是研究微生物在一定条件下的形态结构生理生化遗传变异特性及微生物的进化分类生态等生命活动规律以及微生物之间与人类动植物自然界互相关系的一门科学 抗生素：是由某些微生物在代谢过程中产生的能抑制或杀灭某些其他微生物和肿瘤细胞的微量生物活性物质 细菌素：是某些细菌菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质 条件致病菌：正常菌群在宿主体内具有相对稳定性一般不致病 消毒：指杀死物体上的病原微生物但不一定能杀死细菌芽孢的方法 灭菌：指杀灭物体上所有的微生物的方法 防腐：指防止或抑制微生物生长繁殖的方法 无菌：指没有货的微生物的存在 质粒：是细菌染色体外的遗传物质也是环状闭合的双联DNA分子比染色体小存在于细胞质中可自主复制 突变：是指细菌遗传物质的机构发生突然而稳定的改变所致的变异现象可遗传给后代 基因转移：外源性物质由供体菌转入受体细胞内的过程 基因重组：供体菌的基因进入受体菌细胞并在其中自行复制与表达或矛受体菌DNA整合在一起的过程 病毒：是一类个体微小结构简单只含一种核酸只能在活的易感细胞内以复制方式增殖的

非细胞型微生物 复制周期：病毒的增殖被人为分成吸附穿入脱壳生物合成装配成熟与释放七个步骤的完整过程 缺陷病毒：是指因病毒基因组不完整或因基因某一点改变而不能进行正常增殖的病毒 顿挫感染：病毒进入宿主细胞若细胞缺乏病毒复制所需的酶能量和必要成分等则病毒无法合成自身成分不能够装配和释放子代病毒的现象 干扰现象：两种病毒感染同一种细胞时可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象 人工自动免疫：是将疫苗等免疫原接种于人体刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答使机体获得特异性免疫力 人工被动免疫：是指注射含某种病毒特异性中和抗体的免疫血清等一系列细胞因子是机体立即获得特异性免疫 干扰素：是由病毒或干扰素诱生剂作用于中性粒细胞成纤维细胞或免疫细胞产生的一种糖蛋白 致病性：一定种类的病原微生物在一定的条件下能在特殊的宿主体内引起特定疾病的能力半数致死量：在规定时间内通过一定途径能使一定体重或年龄的某种动物半数死亡或感染需要的最小病原体数量或毒素量 急性感染：发作突然病程较短一般是数天或数周 局部感染：病原体侵入机体后局限就在一定部位生长繁殖引起病变的一种感染类型 毒血症：致病菌侵入宿主体后只在机体局部生长繁殖病菌不进入血液循环但其产生的外毒素入血引起特殊的毒性症状 败血症：致病菌侵入血流后在其中大量繁殖并产生毒性产物引起全身性毒性症状 内毒素血症：革兰阴性菌侵入血流并在其中大量繁殖崩解后释放出大量毒素也可有病灶

食品中有害微生物快速检测方法概述

(一)、概述 食用被微生物污染的食品而导致的疾病，称作食源性疾病。导致这类疾病的微生物叫食源性致病菌。随着人们居住和卫生条件的不断改善，以及抗生素的滥用，人类对病菌的抵抗能力却在不断下降，食源性疾病一直呈上升的趋势。因此，对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性，常规的检验大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是否受到此微生物的污染，这些方法需要一定的培养时间，少则2～3天，多至数周，才能确定。而现行有效的一些快速检测方法不仅可以大大缩短检测时间提高微生物检出率并可用于微生物计数、早期诊断、鉴定等方面，以做到快速、简便、准确。快速方法包括了微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等领域。 （二）、常见、常用的快速、简便的检测微生物数量的方法如下： 1、活细胞计数的改进方法 （1）、旋转平皿计数方法 （2）、疏水性栅格滤膜法（HGMF）或等格法（isogrid method） （3）、血膜系统（Pertrifilm） （4）、酶底物技术（ColiComplete） （5）、直接外荧光滤过技术（DEFT） （6）、“即用胶”系统（SimPlate） 2、用于估计微生物数量的新方法 （1）、阻抗法 （2）、A TP生物发光技术 3、其他方法 （1）、微量量热法 （2）、接触酶测定仪 （3）、放射测定法 （三）、食品中沙门氏菌的快速筛检方法 1、沙门氏菌显色培养基法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法 4、自动传导法 （四）、大肠杆菌O157：H7快速检测方法 大肠杆菌O157：H7肠出血性大肠杆菌的主要血清型，自1982年在美国被分离并命名以来，陆续发现本菌与轻度腹泻、溶血性尿毒综合症、出血性肠炎、婴儿猝死综合症等多种人类病症密切相关，是食源性疾病的一种重要致病菌。E.coli O157：H7属于肠杆菌科埃希氏菌属，为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛。近年来作为食品卫生及流行病学的研究热点，E.coli O157：H7的分离和鉴定方法已取得了较大进展。利用其生化特征、免疫原性建立的方法以及现代分子生物学技术的应用，可以从多方面对E.coli O157：H7进行检测。 1、E.coli O157：H7鉴别培养基及显色培养基 2、免疫学检测方法 3、分子生物学方法 （五）、金黄色葡萄球菌的快速检测方法 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈普通串状排列无芽孢，无鞭毛，不能运动。该菌在自然界中分布广泛，如空气、水、土壤、饲料和一些物品上，是最常见的化脓性球菌之一，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌食物中毒是其肠毒引起的，目前已确认的肠毒素至少有A,B,C1,C2,C3,D,E和F8个型。由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的中毒爆发事件，近年来

《食品微生物检测技术》A卷

农产品质量检测专业及绿色食品生产与经营专业2015级《食品微生物检测技术》课程期末考试卷 （A卷） 一、名词解释（总分10分，每题2分） 1．菌落 2．菌落总数 3．培养基 4．乳酸菌 5．大肠菌群 二、填空题（总分20分，每空1分） 1．与食品工业密切相关的乳酸菌主要为乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属中的等。采用法，检测酸奶中的各种乳酸菌可以获得满意结果。 2．我国卫生部颁布的食品微生物指标主要有、和三项。 3．在菌体形态观察中，需进行制片后才能进行显微镜下观察，观察细菌时采用的制片方法是，观察真菌采取的制片方法是。 4．微生物生长需要的营养要素有、、、、生长因子和能源。 5．根据细菌的生长曲线，可将细菌的生长分为、、、 四个时期，作为研究材料应取的细菌最合适。 6．一般培养基的制备主要程序可分为：称量、、调节pH、过滤、、加塞包扎、 和无菌检查等步骤。 7．无菌室的熏蒸消毒，主要采用熏蒸消毒法，测定无菌室无菌程度一般采用法。 三、单项选择题（总分20分，每题1分，将答案写在下面） 1——5：6——10： 11——15：16——20： 1.紫外线的杀菌机理可能是（） A.紫外线的高热作用 B.紫外线的辐射作用 C.紫外线凝固细菌蛋白质 D.紫外线干扰细菌DNA复制与转录

2.革兰氏染色的关键操作步骤是（） A.结晶紫染色 B.碘液固定 C.酒精脱色 D.复染 3.热力灭菌法分干热和湿热灭菌两类，并在同一温度下湿热灭菌效力较干热要强这是因为（） A.可迅速提高温度 B.湿热有一定潜热、穿透力大，促进菌体蛋白凝固 C.迅速破坏细菌的酶系统 D.促进糖类分解 4.关于金黄色葡萄球菌的描述不正确的是（）。 A.球状菌 B.G+ C.在血平板上形成的菌落为黑色D能产生凝固酶 5.GB/T4789.2-2010菌落总数检验方法是（）。 A.平板涂抹法 B.显微镜检查法 C.平板菌落计数法 D.菌落计数器法 6.检测金黄色葡萄球菌所用的增菌液是（） A.7.5%氯化钠肉汤 B.普通肉汤 C.蛋白胨水 D.TTB 7.在测定菌落总数时，首先将食品样品作成（）倍递增稀释液。 A.1：5 B.1：10 C.1：15 D.1：20 8.奶粉检验取样前，操作人员应（） A.用95％的酒精棉球擦手 B.用75％的酒精棉球擦手和容器口周圈 C.用65％的酒精棉球擦容器口周围 D.用酒精灯烤容器口周围 9.某微生物在有氧和无氧时均可以生长并可以利用氧，它属于（）。 A.微好氧菌 B.好氧菌 C.厌氧菌 D.兼性厌氧菌 10.一般培养基高压蒸汽灭菌的条件是：（） A.121℃/15-30min B.115℃/15-30min C.130℃/15-30min D.65℃/15-30min 11.采用湿热高压蒸汽灭菌，（）是影响灭菌质量的关键。

什么是微生物检验

什么是食品微生物检验 吴崇食质12级1班学号：20122629 微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50 亿个细菌。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广

常见的微生物检测办法

精心整理 摘要： 微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 体积，是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重

量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 取一 5为（ 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母

（activity dry yeast,ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。 比浊法： 微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸 公司的紫外 OD600 或数法 血球计数板法: 血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，

食品微生物检测方法简易流程

各检测项目简易步骤 1、4789.2-2016菌总：PCA36℃48h 2、4789.3-2003大肠：LST管 36℃24h—→EMB 36℃24h 3、4789.3-2016大肠：（法一）LST管 36℃24h-48h—→BGLB管 36℃48h （法二）VRBA 36℃18h-24h—→BGLB管 36℃24h~48h 4、4789.4-2016沙门：25g+225 BPW 36℃8h-18h→1+10TTB 42℃18-24h→BS 36℃40-48h→生化鉴定18-24-48h→多价血清鉴定→报告。 1+10SC 36℃18-24h HE/XLD 36℃18-24h 5、4789.5-2012志贺：25g+225 SHI 41.5℃厌氧16-20h—→XLD、MAC/贺显 36℃20-48h—→TSI、NA斜面36℃20-24h—→生化鉴定、血清学分型。 6、4789.10-2016金葡： 定性：25g+225 7.5% 36℃18-24h—→BP36℃24-48h（血平板18-24h）—→镜检，BHI、NA36℃18-24h—→血浆凝固酶试验6h—报告。 平板：0.3 0.3 0.4 涂布BP平板 36℃24-48h—→计数，血平板36℃18-24h，镜检，BHI、NA36℃18-24h—→血浆凝固酶试验6h—报告。 MPN：3梯度各3个1mL于7.5%管36℃18-24h—→划线BP 36℃24-48h—→鉴定—→查MPN表，报告。 7、4789.15-2016霉菌酵母：（法一） RBA 28℃ 5d 8、4789.26-2013商业无菌：36℃、冰箱2-5℃ 10d 9、4789.30-2016单增： 定性：25g+225 LB1 30℃24h→0.1+10LB2 30℃24h→李显、PALCAM 36℃24-48h→木糖、鼠李糖36℃24h，TSA-YE 36℃18-24h→镜检，动力试验，生化鉴定24-48h 平板：（稀释液LPB或LB）0.3 0.3 0.4 李显36℃24-48h—→计数，木糖、鼠李糖36℃24h，TSA-YE 36℃18-24h→镜检，动力试验，生化鉴定24-48h MPN：25g+225LB 1（稀释液LPB或LB）1+10LB 1 管 30℃24h—→0.1+10LB 2 30℃24h—→各管1环划线李显 36℃24-48h—→鉴定，查MPN表报告。 10、4789.35-2016乳酸：双歧+乳杆：MRS 36℃厌氧72h。 嗜热+乳杆：MC 36℃72h+MRS 36℃厌氧72h。 双歧+嗜热：改良MRS 36℃厌氧72h + MC 36℃72h

非无菌产品微生物检查：微生物计数法

非无菌产品微生物检查：微生物计数法 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 微生物计数试验应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物的无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。 计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。 供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，同时所选方法的供试品用量应保证试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。

微生物检测手段及注意事项

微生物检测手段及注意事项

微生物检测手段及注意事项 微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文对生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而

测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 1. 微生物计量法 1.1 体积测量法 又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10 mL）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5 min）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

化妆品微生物检验方法

一、总则 1.范围 本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。 本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。 2.仪器和设备 2.1 天平。 2.2 高压灭菌器。 2.3 振荡器。 2.4 三角瓶，250mL。 2.5 玻璃珠。 2.6 琉璃棒。 2.7 刻度吸管，1mL、10mL。 2.8 研钵或均质器。 2.9 恒温水浴箱。 3.培养基和试剂 3.1 生理盐水 成分： 氯化钠8.5g 蒸馏水加至1000mL 溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90 mL，103.43kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌。

3.2 SCDLP液体培养基 成分： 酪蛋白胨17g 大豆蛋白胨3g 氯化钠5g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖1g 吐温80 7g 蒸馏水1000mL 制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.2～7.3分装，103.43 kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。 注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。 3.3 灭菌液体石蜡。 3.4 灭菌吐温80。 4.样品的采集及注意事项 4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。包装量小于20g的样品，采样量可适当增加样品包装数量。 4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。 4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。 4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。

食品微生物检测方法

食品微生物检测方法 范围 本标准规定了食品微生物检测方法 1 菌落总数 1.1 培养基和试剂 ⑴、营养琼脂培养基：按GB/T4789.28-2003中4.7规定 成分: 蛋白胨10克、牛肉膏3克、氯化钠5克、琼脂15～20克、蒸馏水1000ml 制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液2ml校正PH至7.2-7.4.加入琼脂,加热煮沸,使用权琼脂溶化.分装烧讧,121℃高压灭菌15分钟. 注:此培养基可供一般细菌培养之用,注平板或制成斜面.如用于菌落计数,琼脂量为 1.5%;如作成平板或斜面,则应为2%. ⑵磷酸盐缓冲液:按GB/T4789.28-2003中3.22规定. 成分：磷酸二氢钾34克、1mol/l氢氧化钠溶液175ml、蒸馏水825ml 、PH7.2 制法: 先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中,用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后,再用蒸馏水稀释至1000 ml. 稀释液: 取储存液1.25 ml ,用蒸馏水稀释至1000 ml,或每管10ml,121℃高压灭菌15分钟. ⑶明胶磷酸盐缓冲液 成分:明胶2克、磷酸氢二钠4克、蒸馏水1000ml、PH6.2 制法:加热溶解,校正PH,121℃高压灭菌15分钟. ⑷0.85%灭菌生理盐水 ⑸75%乙醇 1.2 设备和材料 ⑴冰箱：0~4℃ ⑵恒温培养箱36℃±1℃ ⑶恒温水浴锅46±1℃ ⑷均质器或灭菌乳钵 ⑸架盘药物天平：0~500克，精确至0.5克. ⑹菌落计数器. ⑺大镜4× ⑻灭菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)

⑼灭菌锥形瓶:500ml ⑽灭菌玻璃珠:直径约5mm ⑾灭菌培养皿直径约90mm ⑿灭菌试管16mm×160mm ⒀灭菌刀、剪子、镊子等。 1.3 检验程序（菌落总数的检验程序见图1） 1.4 操作步骤 ⑴检样稀释及培养 a. 以无菌操作将检样25克(ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000r/min～10000r/min的速度处理1min,做成1：10的均匀稀释液。 b. 用1ml的灭菌吸管吸取1：10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。

微生物检测标准

微生物取样方法、微生物检测标准 举例一： 一、空气采样及检验方法 1培养基：普通营养琼脂平板，按GB4789.28中3.7条配制 2采样（空气沉降法） 2.1布点：面积小于30平方米的车间，设一对角线，在线上取3点，即中心一点，两端在距墙1米处各取一点；面积大于30平方米的车间，设东、西、南、北、中5个点，其中东、西、南、北点均距墙1米。 2.2采样高度：与地面垂直高度80-150厘米。 2.3采样方法；用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。 3培养：于37℃培养24小时。 4检测频率：每周 空气质量标准： 生车间、熟车间、成品车间：低于100个 半成品库、成品库：低于10个 二、设备的采样与检验方法 根据生产过程所要求的重点卫生部位，实验室对其进行涂抹采样，进行细菌总数检验。 1采样方法 1.1涂抹法（适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面） 取经过灭菌的铝片框（框内面积为50平方厘米）放在需检查的部位上，用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分，擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。 1.2贴纸法（适用于表面不平坦的设备和工器具接处面） 将无菌规格纸（5×5厘米，纸质要薄而软）用无菌生理盐水泡湿后，于需测部分分别贴上两张，两张纸面积共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。 2检验方法 2.1细菌总数的检验 将上述样液充分振摇，根据卫生情况，相应地做10倍递增稀释，选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养，培养基用普通营养琼脂，每个稀释度作2个平皿，每个平皿注入1毫升样液，于37℃培养24小时后计菌落数。 结果计算 表面细菌总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数/30×2 2.2致病菌的检验 沙门氏菌，参照GB4789.4进行 金黄色葡球菌，参照GB7918.5进行 4.检验合格标准：细菌总数10－100个∕cm2， 5.关键点：细菌总数≤10个∕cm2 一般区域：细菌总数≤100个∕cm2 三、人员手表面细菌污染情况的检验

微生物检测步骤

1.菌落总数操作步骤 1.1检样稀释及培养 1.1.1以无菌操作,取样25 g放入225mL灭菌生理盐水或灭菌乳钵中，经充分振摇作成1：10均匀稀释液。 1.1.2用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1∶100的稀释液。 1.1.3另取1mL灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL火菌吸管。 1.1.4根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。 1.1.5稀释液移入平皿后，应及时将凉至45℃营养琼脂培养基，注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照 1.1.6待琼脂凝固后，翻转平板(使平皿底朝上)，置36±1℃温箱内培养48±2h。 1.2菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 1.3菌落计数的报告 1.3.1平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。 1.3.2 稀释度的选择 1.3. 2.1 应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表1中例1)。 1.3. 2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字(见表中例2及3)。 1.3. 2.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例4)。 1.3. 2.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例5)。 1.3. 2.5 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表1中例6)。 1.3. 2.6 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 1.3. 2.7 若只有一个稀释度菌落在适宜计数范围内，计算平均值X 稀释倍数；作为结果；若两个连续稀释度的菌落都在适宜计数范围内时按公式计算：

微生物快速检测方法及应用进展

微生物快速检测方法及应用进展 随着人们生活水平不断提高，各种安全问题越来越受到人们的重视，微生物的污染问题也相应地备受关注。在食品和环境等各个方面都有微生物污染的可能，一旦污染，微生物将大量繁殖而导致食源性疾病或环境污染甚至医院内感染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，导致感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高，但涉及的实验较多、操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，而且要有大量人员参与［1，2］。所以，迫切需要准确、省时、省力和省成本的快速检验方法。本文对微生物快速检测方法的进展情况及实际应用进行综述，以利于预防食源性疾病及公共卫生突发事件的发生。 1 即用型纸片法 3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数［3］。由RCP Scientific Inc 公司开发上市的Regdigel系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品［4］，这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果［5］。美国3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2 d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3～5 d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶—底物反应法。只需检测食品中大肠菌群、大肠杆菌的有关酶的活性，将荧光产物在365 nm紫外光下观察即可。同时纸片可高压灭菌处理，4℃保存，简化了实验准备、操作和判断［6］。但由于它们价格昂贵，限制了在基层单位的实际应用。 2 生物化学技术 2.1 PCR技术PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间，但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果，扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。由于以上原因，PCR技术对操作者的自身素质要求很高，对于基层单位而言难以做到。短时间内也不会有经济效益和社会效益，因此影响了这项技术在基层的应用。 2.2 基因探针技术基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳 定的或链的原理，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细菌。基 因探针的优点是减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数。如法国生物一梅里埃公司的 基因探针检测系统，对于分离到的单个菌落，30 min完成微生物的确证试验［7］， 基因探针的缺点是不能鉴定目标菌以外的其他菌。 3 选择、鉴定用培养基法