神经干细胞与促红细胞生成素在脊髓损伤中的应用与进展_王喜良
2013年7月第10卷第20期
·综述·
CHINA MEDICAL HERALD 中国医药导报脊髓损伤（spinal cord injury ，SCI ）是由多种损伤因素引起的感觉和运动障碍，其治疗仍是世界性难题。为此，各国科学家都做了不懈的努力，不断有新技术、新方法问世。其中，干细胞移植技术就是其中一项。目前，已有大量的动物实验证实干细胞移植技术是治疗SCI 的有效方法，其机制可能与其释放多种神经递质、促进神经再生等有关，但其具体作用机制还有待于进一步研究[1]。目前，应用于SCI 治疗研究的细胞主要有：神经干细胞（neural stem cells ，
NSCs ）、胚胎干细胞（embryonic stem cells ，ESCs ，简称ES 或EK 细胞）、骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells ，BMscs ）、诱导性多功能干细胞（induced pluripo -tent stem cells ，iPSCs ）、脐血干细胞、非干细胞，如嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells ，OECs ）、施万细胞（Schwann cells ）等[2-3]。由于NSCs 自身所具有的独特的优势，如：具有较高
的增殖和自我更新潜能；多向分化潜能；低免疫原性等，而成为SCI 较理想的移植材料[4]。
促红细胞生成素（erythropoietin ，EPO ）产生于成人肾和
胎儿肝脏，是一种由165个氨基酸残基组成的糖蛋白。过去，人们一直认为EPO 只是一种作用于造血细胞的内分泌激素。但是，随着人们对EPO 研究的深入，EPO 已被证实是一种新型的组织保护因子，具有神经营养和神经保护作用[5]。
1NSCs 概述
1.1NSCs 生物学特性
90年代初，Reynolds 等[6]从成年小鼠脑纹状体中分离
出能在体外不断分裂增殖、具有多种分化潜能的细胞群，正式提出了“NSCs ”的概念。目前得到普遍认可的NSCs 的概念为：NSCs 指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。其生物学特性有5方面：①趋化性：NSCs 的增殖、分化和迁移与细胞外基质（ECM ）有着非常密切的关系；②归巢性：NSCs 在移植后，有着向着其起源部位，或功能及解剖区域的特殊趋化能力；③迁移性：NSCs 移植后，其细胞的密度从注射区向周围逐渐减少；研究发现[7]，鼠脑内新产生的神经干细胞在迁移的过程中需要通过星型胶质细胞的间隙，此时干细胞会分泌一种特殊的蛋白质—“SLIT ”，受到“SLIT ”刺激后，星形胶质细胞会将自身凸起收回，为
NSCs 让路，从而使NSCs 得以在脑内移动；④分化性：NSCs
可以分化为神经系统的各种细胞，而且神经系统损伤区域
神经干细胞与促红细胞生成素在脊髓损伤中的
应用与进展
王喜良
1
赵岩
1
肖宇龙
1
白丽杰
2
1.内蒙古医科大学第二附属医院胸腰椎脊柱外科，内蒙古呼和浩特010030；
2.内蒙古医科大学附属医院风湿免疫科，内蒙古呼和浩特010059
[摘要]脊髓损伤（spinal cord injury ，SCI ）是由多种损伤因素引起的感觉和运动障碍，这些损伤因素包括：创伤、缺
血、医源性损伤等，尽管各国研究者在其治疗方面做了很多努力，但脊髓损伤的治疗仍然是世界性的难题，目前还没有一种安全、有效的治疗方法。本文就神经干细胞和促红细胞生成素在脊髓损伤中的应用和研究进展做一综述，以便为临床治疗脊髓损伤提供新的思路和方法。
[关键词]脊髓损伤；神经干细胞；细胞移植；促红细胞生成素[中图分类号]R394.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2013）07（b ）-0019-03
Application and progress of neural stem cells and erythropoietin in spinal cord injury
WANG Xiliang 1ZHAO Yan 1XIAO Yulong 1BAI Lijie 2
1.Department of Thoracolumbar Spine Surgery,the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Monggol Autonomous Region,Hohhot 010030,China;
2.Department of Rheumatology and Immunology,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Monggol Autonomous Region,Hohhot 010059,China [Abstract]Spinal cord injury (SCI)is a feeling and movement disorder caused by many kinds of damage factors,in -cluding trauma,ischemia,iatrogenic injury,etc.The treatment for spinal cord injury is still a worldwide problem,while countries scientists did a lot of efforts in the treatment for spinal cord injury.Now,there is not yet a safe and effective treatment method for spinal cord injury.In this paper,to offer a new thought and method for the clinical treatment of spinal cord injury,this article has made a summarize about the application and progress of neural stem cells and ery -thropoietin in spinal cord injury.
[Key words]Spinal cord injury;Neural stem cells;Cell transplantion;Erythropoietin
[基金项目]内蒙古自治区自然科学基金项目（编号2011MS1139）。[作者简介]王喜良（1988-），男，汉族，内蒙古医科大学2012级在读硕士研究生；研究方向：脊柱外科。
[通讯作者]赵岩（1977-），男，汉族，博士，主治医生，主要从事脊髓损伤的基础和临床研究。
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内局部的微环境影响移植后NSCs 的分化；⑤抗原性：NSCs 是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，具有低免疫源性。
1.2NSCs 来源[8]
目前主要有：①胚胎脑组织来源的干细胞和胚胎干细胞诱导分化得到的NSCs ；②由胚胎或成年哺乳动物中枢神经系统分离得到的NSCs ，包括从出生到成年脑组织的广泛区域；③源于肿瘤组织或转基因永生化的NSCs ，永生化的NSCs 可携带目的基因，这给神经系统疾病的治疗带来了新的希望；④神经嵴细胞：该种细胞可以自我更新，能够分化形成各种细胞类型，包括NSCs ，有很大的分化潜能；⑤原代细胞培养：指从脑内分离出NSCs ，在合适的体外环境下培养，其细胞可以直接应用于NSCs 的移植，其优点是能够和损伤部位的其他神经细胞整合，替换损伤的神经细胞，并且可以作为基因移植的最佳载体细胞；⑥iPSCs 来源的NSCs ：最近构建的iPSCs 可以诱导分化为NSCs ，而且可以战胜NSCs 来源不足的问题，是一个很有发展前景的干细胞[9]；目前国内基础研究应用的NSCs 多数来源于胚胎动物脑组织、动物胚胎干细胞和人胚胎干细胞。目前临床上应用治疗SCI 的NSCs ，大多应用人脐血来源的NSCs 。1.3NSCs 的分离、培养[10-12]
研究发现，在成年哺乳动物脑中有两个NSCs 聚集区：侧脑室下区（subventricular zone ，SVZ ）和海马齿状回（sub -
granular zone ，SGZ ）；此外，在成年鼠前脑的嗅球中也发现有较多的NSCs 聚集，且能不断生成“谷氨酸能中间神经元”。目前，体外分离培养NSCs 的经典方法是：应用机械法
或酶消化法分离组织，以便获取单个细胞，用含高浓度有丝分裂原如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF/FGF-2）和（或）表皮生长因子（EGF ）的无血培养基进行原代和传代培养；该法是体外获得和扩增NSCs 的主要方法，获得的细胞生物性状接近于体内的细胞。NSCs 体外培养方法按生长方式分为悬浮神经球法和贴壁培养法。1992年，
Reynolds 等[13]首先应用悬浮培养神经球法（neurosphere as -say ，NSA ）创立了NSCs 的体外培养方法，由于该方法简单、
严格按照标准程序操作、重现性好等原因，已成为分离扩增NSCs 最常用的方法。在体外，NSCs 不仅能以悬浮生长方式扩增，也能以贴壁生长方式扩增，与悬浮培养法相比，贴壁培养法更有利于进行细胞形态学的观察、获取大量同质化的细胞，但也存在一定的局限性。
1.4NSCs 移植的最佳时间
SCI 后，损伤局部以及机体本身的内环境都在不断的
变化，但损伤局部以及机体本身的内环境又对移植的
NSCs 有很重要的影响，所以移植时间的选择对于移植细胞的存活及其分化是非常重要的。到目前为止，关于NSCs 移植的最佳时间的选择还未统一。SCI 后，受损的脊髓组织在原发性损伤的基础上出现继发性损伤，并在损伤后的4h
左右表现的最为明显。随后几天，损伤组织出现大片的坏死，胶质细胞活化、增生；这期间，都不利于NSCs 的存活、分化。SCI 后12d 左右，损伤局部出现囊肿、胶质瘢痕形成，脊髓组织的完整性被极大地破坏，也不利于移植的
NSCs 发挥作用。实验和临床研究表明，SCI 后1、2周可考虑作为进行NSCs 移植治疗的最佳时间。Okano 等[14]研究发
现，SCI 后移植的最佳时间在损伤后的9d 左右，此时的内环境比较适合移植细胞的存活、分化以及发挥其修复SCI 的作用。梁袁昕等[15]研究发现，SCI 后一周进行细胞移植效果最好。目前，国内外学者对于SCI 后NSCs 移植的最佳时间还存在较大争议。而且，现在的大部分研究还处在动物实验阶段，由于动物和人类的差别，关于人类SCI 后具体的移植时间还有待于进一步的研究。
1.5NSCs 的移植方式
NSCs 移植治疗SCI 的移植方式主要包括：①直接移植法：该方法是将体外制备好的NSCs 多靶点直接注射到SCI 的周边区域；②经静脉注入移植法：该方法是将体外制备好的NSCs 注入大鼠尾静脉内，移植细胞随血液循环到达SCI 部位，然后再突破血脑-脊髓屏障到达受损的脊髓组织；③经蛛网膜下腔注入移植法：该方法是指将体外制备好的NSCs 注入蛛网膜下腔，移植细胞随脑脊液到达病变脊髓；④经腹膜移植：该方法是指将体外制备好的NSCs
注入腹膜腔，移植细胞经腹膜到达病变脊髓；此外，还有通过载体移植技术或转基因技术，使移植细胞到达病变脊髓而发挥作用，但上述哪种移植方式更合适、有效，到目前为止，还没有定论[16]。目前，动物实验多采用直接移植法。
2NSCs 治疗SCI 的可能机制
①NSCs 在宿主体内的存活、迁移以及分化：NSCs 移植入宿主体内后，在趋化因子的作用下，移植细胞向着SCI
部位迁移，并在损伤部位分化为神经系统的各种细胞，替代受损神经细胞，重建突触联系，从而达到促进神经功能恢复的目的。孔令胜等[17]发现：在体外分离、培养出的大鼠
NSCs ，移植到大鼠SCI 区域后可存活、迁移，并能够有效地保护SCI 后的前角运动神经元，从而促进SCI 大鼠的后肢运动功能恢复。②分泌神经营养因子促进轴突再生：移植的NSCs 具有神经营养作用，其在SCI 区域可分化产生神
经元细胞和胶质细胞，这些神经细胞可以分泌多种神经营养因子，改善损伤脊髓局部的内环境，并启动再生相关基因的顺序表达，从而使损伤的轴突再生，修复损伤的神经细胞。此外移植的细胞还可以产生多种细胞外基质，填充脊髓损伤后留下的囊腔，为轴突再生提供支撑物。③替代作用：移植NSCs 通过产生外源性神经元，替换损伤的神经细胞，与神经系统相整合，形成新的神经突触，重建神经元回路。④神经保护以及免疫抑制作用：移植NSCs 可以减少损伤脊髓周围组织坏死，抑制炎症、胶质瘢痕形成、细胞凋亡、细胞再损伤。⑤移植的NSCs 可以分化产生少突胶质细胞，促进新生的神经纤维和残存脱髓鞘的神经纤维髓鞘化，以恢复神经结构的完整性，促进神经功能的恢复[18]。
3EPO 治疗SCI 的可能作用机制
3.1促进NSCs 的增殖与分化，促进神经再生
SCI 后，EPO 能够长期直接作用于NSCs ，诱导神经营
养因子的表达，促进受损处神经再生。研究发现，在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，重组人促红细胞生成素（rhEPO ）能够增强少突胶质细胞的增殖和髓鞘的再生，从而促进SCI 后神经功能的恢复。此外，EPO 还可以促进神经细胞轴突再生，调节机体血管痉挛，刺激新生血管形成，从而为SCI 的修复提供良好的微环境，对脊髓功能的恢复非常有益。
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（收稿日期：2013-04-20本文编辑：张瑜杰）
3.2减少神经细胞的凋亡
EPO 可以通过阻断炎症坏死和细胞凋亡而保护神经细胞，但到目前为止，有关EPO 减少神经细胞凋亡的机制还不是十分清楚。研究发现，在体外，EPO 可以保护神经元
免受缺氧和各种其他介质，包括兴奋性毒性介质、葡萄糖缺乏诱导的细胞死亡。在体内脊髓神经根挤压伤后，EPO 能够立即发挥防止脊髓背根神经节细胞凋亡的作用；在大鼠脊髓压迫模型中，也发现了EPO 的细胞保护作用。研究表明[19-20]，炎症细胞的缺失可能导致凋亡过程和caspase-1的抑制，而它们正好构成了SCI 后部分的炎症过程。
综上所述，NSCs 能分化为神经系统的各种细胞，替代变性、坏死的神经细胞，并与宿主神经系统相整合，重建受损的神经环路，恢复受损脊髓的功能。EPO 可抑制SCI 后的炎性反应、减少兴奋性氨基酸的产生、减少氧自由基的生成、降低NO 的含量，从而为SCI 后神经细胞的再生、轴突的生长提供合适的微环境。此外，NSCs 和EPO 具有以下共同的生理作用：促进轴突再生；抑制神经细胞凋亡；抑制
SCI 后的炎性反应等。4问题与展望
NSCs 由于其本身独特的生物学特性，使其在治疗中
枢神经系统性疾病方面有着非常广阔的前景。但到目前为止，对NSCs 的研究尚处于动物实验阶段，将其应用于临床还有一系列的问题需要解决，如：①移植后NSCs 的增殖、分化、迁移机制还没有得到明确的阐释，对于NSCs 精确的调控也还有很长的路要走；②在NSCs 移植的来源选择上还未经过系统的比较；③NSCs 作为转基因载体治疗神经系统疾病的疗效和安全性等问题仍需进一步观察；此外，NSCs 移植的最佳时机、合适的移植方式、神经细胞移植后的成瘤性等问题还有待于进一步的研究。与此同时，
EPO 对SCI 后治疗机制的研究也处于动物实验阶段，临床上应用个体差别较大，EPO 在临床上的应用也存在许多亟待解决的问题，如EPO 治疗SCI 的给药时间，合适的给药剂量以及疗程，EPO 的用药方式等。相信随着相关研究的深入，上述这些问题也会得到进一步的解决，SCI 的治疗效
果也会得到进一步的改善。
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（收稿日期：2013-04-09本文编辑：卫轲）
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