制猪瘟犊牛睾丸细胞苗用种毒的保存期试验

AMPK信号通路负向调节热应激诱导仔猪睾丸支持细胞乳酸分泌

目录 目录 中文摘要............................................................................................................................ I ABSTRCT....................................................................................................................... III 第一章文献综述. (1) 1.睾丸支持细胞概述 (1) 1.1支持细胞的结构和功能 (1) 1.2支持细胞的能量代谢 (1) 1.3支持细胞乳酸的分泌 (2) 2.热应激的研究进展 (4) 2.1热应激概述 (4) 2.2热应激对机体代谢的影响 (5) 2.3热应激对公猪繁殖性能的影响 (7) 3.AMPK的研究概况 (8) 3.1 AMPK的结构 (9) 3.2 AMPK的活性 (10) 3.3 AMPK与代谢调节 (11) 3.4 AMPK与热应激 (13) 4.结束语 (13) 第二章引言 (15) 第三章试验材料与方法 (17) 1.试验材料 (17) 1.1试验材料 (17) 1.2主要试剂 (17) 1.3试剂配置 (18) 1.4主要试验仪器 (20) 2.试验方法 (21) 2.1睾丸支持细胞分离培养 (21) 2.2支持细胞的纯度鉴定 (22) 2.3热应激处理 (23) 2.4 AMPK过表达载体的构建 (23) 2.5细胞转染 (26) 2.6蛋白免疫印迹 (26) 2.7 乳酸含量测定 (28) i

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

猪瘟疫苗分类

猪瘟疫苗目前主要有四种：脾淋苗（I）、乳兔苗（I）、细胞苗（II）和联苗。这四种疫苗的猪瘟毒株虽然均是中国系猪瘟兔化弱毒株（简称C株），但彼此间还是有一定的区别：（1）脾淋苗、乳兔苗和细胞苗为猪瘟单苗，单苗可以用于猪基础免疫.（2）普通苗一般指细胞苗（每头份不低于750RID的含毒量，远高于组织苗每头份不低于150RID的含毒量），既能防止临床发病，又能保护不发生亚临床感染，达到了“双保护”的水平，所以一般猪瘟免疫使用猪瘟细胞苗免疫就可以了。 （3）脾淋苗和乳兔苗，是兔源组织苗，是利用成兔和乳兔的活组织生产制备的，产量小，成本高，易污染。本类疫苗最好不用于乳前免疫，没吃初乳的子猪群免疫猪瘟活疫苗(兔源)可能诱发较严重的接种反应。 （4）在紧急免疫猪瘟苗时，组织苗优于细胞苗，可能因为组织苗中的一些组织蛋白，特别是淋脾苗中的淋巴因子是一种免疫促进剂。 建议 （1）子猪做基础免疫时最好选用猪瘟细胞苗，不要选用猪瘟组织苗（脾淋苗和乳兔苗）. （2）一旦发生猪瘟，须紧急免疫猪瘟疫苗时，建议使用猪瘟脾淋苗，必要情况下可以配合转移因子使用。 对于猪瘟免疫，某些养殖户说：“大剂量使用猪瘟疫苗，一头猪注射几十头份甚至上百头份，以毒攻毒，也未见产生明显的不良反应。”进而形成了“注射量多多益善”或“多了比少了好”的错误观点。 分析：无论是正常免疫猪瘟疫苗，还是紧急免疫猪瘟疫苗，大剂量使用猪瘟疫苗均是错误的做法，即使免疫后没有产生明显的不良反应，但后续的负效应是非常可怕的。 首先，猪瘟苗均是活疫苗，大剂量注射疫苗，无形中就给机体内注入了大量的病毒，就会给健康猪埋下“潜伏的病原”或加重病猪的疫情。 其次，大剂量使用猪瘟苗，不仅造成了疫苗的浪费，增加了成本，而且从长远来看，会影响猪瘟病毒的生态变化以及机体正常免疫能力的产生，甚至产生“免疫耐受”现象。再其次，猪瘟活疫苗的生产过程，有时会发生被牛病毒性腹泻病毒（BVDV）污染的情况，这会使疫苗的免疫效能下降，甚至免疫失败（这是猪细胞苗存在的问题）。在这种情况下大剂量使用猪瘟疫苗，必然会增加疫苗对猪体的副作用。 建议 大剂量注射猪瘟疫苗，会造成猪体长时间带毒、排毒，猪场很难净化猪瘟，甚至猪场一旦发病，猪瘟都会起到主要作用。所以，对于猪瘟苗的使用，应当科学合理，按照实际情况定量免疫猪瘟疫苗。

小鼠睾丸支持细胞分离培养

小鼠睾丸支持细胞分离培养 一、材料和器械： 1、材料：小白鼠（18~ 20 日龄）1只 2、配液： PBS 1L，高压灭菌 细胞洗液：DMEM+双抗 消化液：0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，0 1%( 质量分数) 胶原酶 细胞培养液：DMEM+10%FBS+双抗 3、器械： 镊子、手术剪、手术刀各3-4把，高压灭菌 500mL烧杯2个，高压灭菌 25 mL离心管、5 mL离心管各20个，高压灭菌 酒精棉一瓶 细胞培养皿若干 冰块若干 二、操作步骤： 1、处死小鼠颈椎脱臼法处死； 2、消毒置于含75% ( 体积分数) 乙醇平皿中浸泡2 min, 然后置于超净台上； 3、取睾丸用中剪剪开下腹部皮肤, 眼科剪从下腹部附睾部剪断精索, 取出双侧睾丸, 放入含预冷细胞洗液的培养皿中； 4、取实质修剪睾丸附带的精索。剥除睾丸被膜, 将睾丸实质剪成约1 mm 1 mm 1 mm 碎块, 静置3~ 4 min； 5、消化转入25mL 离心管中。吸出上层细胞洗液, 每只睾丸加入1 5mL 37 预温的0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，37 高速振荡消化15~ 20min, 直到残存的间质消化成粘液状, 可见成片断的曲细精管； 6、终止消化加入入少许血清终止消化,； 7、离心1000 r/ min离心5 min, 倾去上层胰酶。加入DMEM/ F12 培养基重悬, 1000r/min 离心5min。倾去上层培养液； 8、再消化每只睾丸加入1 mL 37 预温的0 1%( 质量分数) 胶原酶, 37 低速

缓慢振荡消化20~ 25min； 9、铜网过滤取滤液800 r/ min 离心5min, 2 次去除胶原酶, 用培养液洗涤； 10、接种往离心管加入细胞培养液5ml左右，吹打均匀，接种到两个30细胞培养皿中，补加培养液到培养皿1/3~1/2,培养皿标记显微观察后放入36CO2培养箱培养。 三、换液纯化，计数结果鉴定

小鼠睾丸支持细胞体外培养特性

生物工程学报Chin J Biotech2009, May 25; 25(5): 745-753 https://www.wendangku.net/doc/b614622311.html, Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@https://www.wendangku.net/doc/b614622311.html,? 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 小鼠睾丸支持细胞体外培养特性 师冰洋1, 张淑香1, 郭美锦1, 王永红1, 张嗣良1, 史小林2 1 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海 200237 2 首都医科大学生殖医学中心, 北京 100069 摘要:支持细胞是睾丸的重要组成部分, 其主要功能是为生精细胞提供适宜的生长环境。从幼鼠睾丸中分离得到支持 细胞, 并通过苏木精-伊红和Fas-L免疫组化染色对分离得到的细胞进行了鉴定。通过对原代小鼠睾丸支持细胞的贴壁、 生长和培养液中葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等营养底物及其副产物乳酸、铵根离子等的代谢以及培养液渗透压和pH的 研究, 发现支持细胞的贴壁时间主要集中在接种后2~4 h; 当培养液中氨根离子浓度高于 2.3 mmol/L, 渗透压高于 326 mosm/kg, pH≤6.8时支持细胞生长进入衰亡期; 在氨基酸代谢方面, 发现培养过程中丙氨酸和谷氨酸浓度迅速增加, 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度略有降低, 丝氨酸、精氨酸和甘氨酸浓度基本保持不变。因此培养液中铵根离子浓度的 过量积累、渗透压和pH的异常和贴壁面积不足是限制支持细胞静态生长的主要因素。研究结果为支持细胞大规模培养 及工艺优化奠定了基础。 关键词:支持细胞, 分离与鉴定, 体外培养, 代谢特性 Metabolic characterization of rat sertoli cell in vitro culture Bingyang Shi1, Shuxiang Zhang1, Meijin Guo1, Yonghong Wang1, Siliang Zhang1, and Xiaolin Shi2 1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China 2 Reproductive Medical Center of Capital Medical University, Beijing 100069, China Abstract: Sertoli cell (SC) is intrinsic to the testis and provides an appropriate growth environment for the germ cells. It was separated from rat’s testis and identified by hematoxylin and eosin staining(HE) and immunocytochemical reaction, then cultivated in vitro. Culture conditions such as pH, osmotic pressure and metabolic parameters that include consumption rates of glucose, glutamine, amino acids and formation rates of lactic acid, ammonium ion were investigated. It was showed that adhesion process of SCs was accomplished within 2?4 hours after inoculation. It was also observed that the SCs entered into the decline phase when the concentration of ammonium ion and lactic acid were above 2.3 mmol/L and 14 mmol/L, respectively, which caused osmotic pressure above 326 mosm/kg and pH below 6.8 in the medium. As the changes of amino acids during culture were concerned, Glu and Ala accumulated rapidly, while Val, Leu, Ile reduced slightly and at the same time Ser, Arg, and Gly were stable. The restrict factors for SCs grown in static culture might be high osmotic pressure and low pH, which were generated when glutamine and glucose were metabolized into lactic acid. The findings could be fundamental in the process optimization of large scale Sertoli cells in vitro culture. Received:December 9, 2008; Accepted:February 19, 2009 Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA02Z216), Shanghai Biotechnology Industrialized Platform (No. 07DZ22914), National Special Fund for State Key Laboratory of Bioreactor Engineering (No. 2060204). Corresponding author: Shuxiang Zhang. E-mail: zhangsx1976@https://www.wendangku.net/doc/b614622311.html, Meijing Guo. E-mail: guo_mj@https://www.wendangku.net/doc/b614622311.html, 国家高技术研究发展计划(863计划)(No. 2007AA02Z216), 上海市生物技术产业化平台(No. 07DZ22914), 国家重点实验室专项经费 (No. 2060204)资助。

组织学解剖--睾丸

组织学解剖--睾丸 睾丸(一) 一般结构 1. 被膜浆膜（睾丸鞘膜脏层）：由间皮及少量结缔组织组成白膜（tunica albuginea）：位于浆膜深层，由致密结缔组织组成睾丸纵隔（mediastinum testis）：白膜在睾丸后缘增厚形成睾丸纵隔，纵隔结缔组织呈放射状深入睾丸实质形成许多睾丸小隔 2. 实质由睾丸小隔分隔睾丸实质成250多个锥体形睾丸小叶。每个睾丸小叶含1）1～4条弯曲的小管——生精小管生精小管在近睾丸纵隔处变为短而直的直精小管 直精小管在睾丸纵隔内相互吻合形成睾丸网 即生精小管→直精小管→睾丸网2）生精小管间的结缔组织为睾丸间质,内含睾丸间质细胞 (二) 生精小管(seminiferous tubule) 是睾丸产生精子的场所它为极度弯曲的上皮性管道成人的生精小管：长30～70cm 管径150～250um，中央为管腔 管壁厚60～80um 1.结构生精上皮基膜1）生精上皮（spermatogenic epithelium）组成：两种细胞支持细胞：支持细胞作单层排列生精细胞（spermatogenic cell）生精细

胞镶嵌在支持细胞侧面及腔面 由上皮基部到腔面作多层（5～8层）排列2）基膜较厚外周覆以胶原纤维和一些梭形的具有收缩功能的类肌细胞(myoid cell)肌样细胞收缩有助于精子排出 2.生精细胞与精子的发生生精细胞精原细胞 初级精母细胞 次级精母细胞 精子细胞 精子青春期前，生精小管管腔很小或缺如，管壁中只有支持细胞和精原细胞青春期开始，在垂体促性腺激素的作用下，生精细胞不断增殖分化形成精子，生精小管壁内可见不同发育阶段的生精细胞。 1）精原细胞（spermatogonium）位置紧贴生精上皮基膜细胞形态圆形或椭圆形，直径约12um细胞结构细胞质内除核糖体外，细胞器不发达。是各级生精细胞中最幼稚的细胞细胞分类精原细胞分A、B两型A型精原细胞是生精细胞中的干细胞，经过不断地分裂增殖，一部分A型精原细胞继续作为干细胞，另一部分分化为B型精原细胞B型精原细胞经过数次分裂后，分化为初级精母细胞

睾丸性索间质肿瘤

由正常发育和演化的间质细胞成分构成的睾丸肿瘤。2004年世界卫生组织WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中将其分为间质细胞瘤和恶性间质细胞瘤。睾丸问质细胞瘤罕见，间质细胞瘤占睾丸肿瘤的1%～3%，是最常见的性索/间质肿瘤。儿童睾丸间质细胞瘤为良性，约有10%成人的睾丸间质细胞瘤为恶性，可能发生腹膜后淋巴结转移或远处脏器转移。恶性睾丸间质细胞瘤肿瘤体积常大于5cm，核分裂象增多，有坏死或血管浸润。1895年由Sacchi 首先报道。该病可发生于任何年龄段，其中，约有20%发生于儿童，约80%发生于成人。 目录 1病因 2临床表现 3检查 4治疗 1病因 病因不清。可能与先天性睾丸发育不全、隐睾有关。 2临床表现 儿童睾丸间质肿瘤高发年龄为3岁～9岁，成人睾丸间质肿瘤高发年龄为21岁～59岁。5%～10%的患者有隐睾史。常为单侧，3%为双侧。成人患者最常见的临床表现是无痛性睾丸增大或肿物，30%的患者有乳房增大，男性乳房增大的表现往往较睾丸肿物更早，平均比睾丸间质细胞瘤的诊断早3年。儿童患者常见症状为无痛性睾丸肿大，假性性早熟，如出现喉结、声音低沉、阴毛增生，阴茎增粗、时常勃起。 3检查 超声检查是临床上辅助诊断睾丸病变的首选方法。B超对于判断睾丸肿瘤的性质、大小、部位、肿瘤所占睾丸组织的比例甚至选择治疗方式等具有重要的临床价值。睾丸内可见单发，均呈类圆形，界清，体积小，实性低回声/中等回声/

高回声，与正常睾丸组织有明显的边界，形态不规则，内部回声均匀。丰富的动、静脉血流信号。 成人睾丸间质细胞瘤患者的血清和尿中的雌激素常常升高。儿童睾丸间质细胞瘤患者的血清睾酮升高，部分患儿的尿17-酮升高。间质细胞瘤患者的血清甲胎蛋白（AFP）和人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）多在正常范围。 4治疗 外科手术切除是惟一有效的治疗方法，对儿童睾丸畸胎瘤患者术中冰冻病理检查结果排除恶性肿瘤者，可以考虑行保留睾丸手术。根治性睾丸切除术能够治愈大多数患者，对于病理怀疑恶性的病例，可以考虑腹膜后淋巴结清扫术。远处转移的患者对放疗或化疗不敏感。

睾丸细胞的生物学特征及研究进展

睾丸细胞的生物学特征及研究进展 周文钧 摘要：睾丸形态与功能的维持主要依靠生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞发挥作用。生精细胞、支持细胞功能的正常是精子发生的基础，管周肌样细胞的收缩促使精子排出至睾丸网，间质细胞是睾酮的主要来源。目前，睾丸细胞研究主要集中在细胞体外培养、细胞基因组学、细胞应用三大领域。本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。 关键词：生精细胞；支持细胞；管周肌样细胞；间质细胞；生物学；应用 睾丸由生精小管和间质构成，1～4条生精小管（seminiferous tubule）高度盘曲于睾丸小叶中。管壁上皮为特殊的生精上皮，是精子发生的场所，主要由支持细胞（Sertoli cell）、生精细胞（spermatogenic cell）组成。小管上皮基膜外有胶原纤维和管周肌样细胞（peritubularmyoid，PTM）。睾丸间质是含有大量的血管及淋巴管的疏松结缔组织，其中含有大量的间质细胞（Leydig cell），其主要功能为合成和分泌雄激素。本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。 1 睾丸细胞生物学特点 1.1生精细胞精子发生既是一个复杂的生物形态与遗传变化过程，又是一个复杂、特异的细胞分化过程，是生命周期循环的重要环节之一，其中生精细胞生物学变化起到关键作用。人的精子发生需要（64±4.5）d，需要经过精原细胞增殖分化、精母细胞减速分裂、形成精子三个阶段。 精原细胞位于生精小管基底室，基膜与之相接触。其分化起始于胚胎时期的原始生殖细胞，分化形成生殖母细胞并逐渐迁移至生精上皮基膜，经过细胞分裂分化成为以精原干细胞（SSCs）为主的精原细胞，SSCs可自我更新，又能定向分化成精母细胞。大鼠的精原细胞可分为A型、中间型、B型精原细胞，Huckins提出将大鼠的精原细胞分为三部分，即贮备型精原干细胞（As），更新或增值型精原细胞（Apr-Aal）和分化型精原细胞（A1～A4-In-B）[1]，前两者也可以称之为未分化型精原细胞。As一般情况下处于休止状态，只有在其他类型的精原细胞耗尽的情况下才会进行分裂。单个的精原细胞As分裂形成成对Apr精原细胞，Apr精原细胞再分裂分化成4、8、16个链状精原细胞（Aal），Aal再分裂形成分化型A型精原细胞（A1～A4）四个亚型及中间型（In）、B型精原细胞。初级精母细胞内细胞器增多，有发达的高尔基复合体，在组织切片中可观察到大量处于各阶段的初级精母细胞，分裂完成后次级精母细胞便很快开始第二次减数分裂，因次级精母细胞存在时间短，故在组织切片中不易看到，此时次级精母细胞不进行染色体复制，形成单倍体圆形精子细胞，最终形态改变形成精子。 1.2支持细胞支持细胞（Sertoli cell）是维持生殖上皮稳定性与维持睾丸功能的关键细胞，是一种滋养型细胞，位于基部紧贴基膜，顶部伸向腔面，侧面和管腔面有很多不规则的凹陷，其内镶嵌着各级生精细胞。支持细胞之间的连接复合体将生精上皮分为了基底室和近腔室，基底室有精原细胞和细线前期精母细胞，近腔室有精母细胞、精子细胞和精子[1]，为精子发生内环境的稳定提供了保障，支持细胞和精子细胞之间存在缝隙连接，此连接就像锚一样在精子细胞镶嵌在支持细胞上发挥作用[2]。 支持细胞可分泌生长因子（如TGFα、TGFβ、IGF-1、IL-1）、转运蛋白（如雄激素结合蛋白、转铁蛋白、铜蓝蛋白）、类固醇等物质，为精子细胞提供营养物质，同时还起到包裹生殖细胞质突起和释放管腔作用。支持细胞分泌的生长因子可支持精原细胞的增殖分化[3]。支持细胞具有免疫豁免作用[1]，还可以通过自分泌与旁分泌作用调节睾丸间质细胞的功能。

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

细胞传代实验报告

细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可 以与 体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较 经济， 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞 分散 后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养， 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞：293细胞株 2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附：消化液配制方法： 称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存， 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4） 五、实验结果

几十头份的注射猪瘟苗这件事

几十头份的注射猪瘟苗这件事 很多的养殖户在购回仔猪后，注射大剂量的猪瘟细胞苗，说是为了防止发猪瘟，因为猪瘟是引起其他疾病的诱因!今天猪小妹只想就猪瘟疫苗这一块，跟养殖户们说道说道!猪瘟疫苗目前主要有四种：脾淋苗(I)、乳兔苗(I)、细胞苗(II)和联苗。这四种疫苗的猪瘟毒株虽然均是中国系猪瘟兔化弱毒株(简称C株)，但彼此间还是有一定的区别! 一.区别 (1)脾淋苗、乳兔苗和细胞苗为猪瘟单苗，单苗可以用于猪基础免疫。 (2)普通苗一般指细胞苗(每头份不低于750RID的含毒量，远高于组织苗每头份不低于150RID的含毒量)，既能防止临床发病，又能保护不发生亚临床感染，达到了“双保护”的水平，所以一般猪瘟免疫使用猪瘟细胞苗免疫就可以了。

二.建议 1.基础免疫：仔猪做基础免疫时**好选用猪瘟细胞苗，不要选用猪瘟组织苗(脾淋苗和乳兔苗). 2.紧急免疫：一旦发生猪瘟，须紧急免疫猪瘟疫苗时，建议使用猪瘟脾淋苗，必要情况下可以配合转移因子使用。 3.脾淋苗和乳兔苗，是兔源组织苗，是利用成兔和乳兔的活组织生产制备的，产量小，成本高，易污染。本类疫苗**好不用于乳前免疫，没吃初乳的仔猪群免疫猪瘟活疫苗(兔源)，可能诱发较严重的接种反应。

4.在紧急免疫猪瘟苗时，组织苗优于细胞苗，可能因为组织苗中的一些组织蛋白，特别是淋脾苗中的淋巴因子是一种免疫促进剂。 对于猪瘟免疫，某些养殖户说：“大剂量使用猪瘟疫苗，一头猪注射几十头份甚至上百头份，以毒攻毒，也未见产生明显的不良反应。”进而形成了“注射量多多益善”或“多了比少了好”的错误观点。 三.分析 无论是正常免疫猪瘟疫苗，还是紧急免疫猪瘟疫苗，大剂量使用猪瘟疫苗均是错误的做法，即使免疫后没有产生明显的不良反应，但后续的负效应是非常可怕的。 首先，猪瘟苗均是活疫苗，大剂量注射疫苗，无形中就给机体内注入了大量的病毒，就会给健康猪埋下“潜伏的病原”或加重病猪的疫情。 其次，大剂量使用猪瘟苗，不仅造成了疫苗的浪费，增加了成本，而且从长远来看，会影响猪瘟病毒的生态变化以及机体正常免疫能力的产生，甚至产生“免疫耐受”现象。 再其次，猪瘟活疫苗的生产过程，有时会发生被牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染的情况，这会使疫苗的免疫效能下降，甚至免疫失败(这是猪细胞苗存在的问题)。在这种情况下大剂量使用猪瘟疫苗，必然会增加疫苗对猪体的副作用。

小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察

姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察学号 小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察 一．实验目的 1．了解快速制备动物染色体标本的方法，掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的制备方法。 2．观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征。 3．掌握小鼠睾丸染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。 二．实验原理 （一）染色体 染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本无疑是细胞学最基本的技术之一，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。 染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。本实验采用的方法是从小鼠的睾丸细胞中获取。 染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断地运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。 染色体特征： 1.数目（2n=？） 2.长度（绝对长度、相对长度） 3.着丝粒位置（M/SM/ST/T） 4.随体与次溢痕的数目、大小和位置 5.带型分析 （二）操作方法 小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织（由于分裂活动旺盛，睾丸也可以）。利用睾丸细胞的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂。 由于小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理、低渗、固定、制片、染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。 减数分裂是细胞分裂染色体数目减半时发生在性细胞的形成过程中。哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。 用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，

《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法

原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织

已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去

睾丸肿瘤诊疗指南

睾丸肿瘤诊疗指南目录 1.背景 1.1.方法 1.2.出版史 1.3.热点问题的潜在争议 2.病理学分类 3.诊断 3.1 临床体检 3.2 睾丸影像学检查 3.3 血清肿瘤诊断标记物 3.4 腹股沟探查和睾丸切除 3.5 保留脏器手术 3.6 睾丸病理检查 3.7 睾丸上皮瘤的诊断与治疗 3.8 肿瘤筛查 4．肿瘤分期 4.1 诊断工具 4.2 血清肿瘤标记物：睾丸切除术后半衰期动力学4.3 腹膜后、纵膈及锁骨上淋巴结和内脏 4.4 分期和预后分类 4.5 预后危险因素 4.6 对生育能力及生育相关问题的影响 5. 睾丸肿瘤诊断和分期指南 6. 治疗：原发生殖细胞肿瘤 6.1 原发精原细胞瘤 6.1.1 监控 6.1.2 辅助化疗 6.1.3 辅助放疗 6.1.4 腹膜后淋巴清扫（RPLND）

6.1.5 治疗相关风险 6.2 原发性精原细胞瘤治疗原则 6.3 原发性非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤（NSGCT） 6.3.1 监控 6.3.2 基本化疗 6.3.3 治疗相关风险 6.3.4 腹膜后淋巴清扫（RPLND） 6.4 持续增高的血清肿瘤标记物 6.5 原发性非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤治疗原则 7 治疗：转移性生殖细胞肿瘤 7.1 低危的转移性疾病（IIA/B期） 7.1.1 IIA/B期精原细胞瘤 7.1.2 IIA/B期非精原细胞瘤 7.2 晚期转移疾病 7.2.1 主要化疗 7.3 二次分期和治疗 7.3.1 二次分期 7.3.2 残留肿瘤切除 7.3.3. 手术质量 7.3.4 二次手术后辅助化疗 7.4 复发性或难治疗疾病的系统性补救治疗 7.4.1 迟发型复发(一线之后2年以上) 7.5 补救手术 7.6 脑转移的治疗 7.7 转移性生殖细胞肿瘤治疗原则 8 . 根治性治疗后肿瘤随访 8.1一般原则 8.2随访：I期非精原细胞瘤 8.2.1随访期间监测 8.2.2 保留神经的RPLND术后随访

小鼠睾丸支持细胞使用说明

小鼠睾丸支持细胞 小鼠睾丸支持细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠睾丸支持细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠睾丸支持细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠睾丸支持细胞产品简介： 产品名称：小鼠睾丸支持细胞 组织来源：小鼠睾丸 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠睾丸支持细胞细胞简介： 睾丸支持细胞又称sertoli细胞。它是生精细胞的支架,为其提供必需的营养物质,能合成与分泌雄激素结合蛋白,为其提供高浓度的雄激素环境等,还具有构成血-睾屏障,形成睾丸内微环境,调节精子发生等功能。制备高活率的sertoli 不仅对sertoli的基础研究有重要价值,而且在精子发生等领域有重要意义。本研究旨在建立小鼠sertoli的快速高效分离方法,并根据其分泌FasL的特性,采用细胞免疫化学方法对分离的小鼠sertoli进行鉴定,以期为进一步研究和应用sertoli奠定基础。

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 原代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 原代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

猪瘟细胞苗和脾淋苗的免疫效果对照试验

猪瘟细胞苗和脾淋苗的免疫效果对照试验 冷和平1,3，钟超武1，曾俊霞2，郭霄峰3 * （1.珠海市那洲猪场，广东珠海519085；2.珠海市安富来生物科技有限公司，广东珠海519080）；3 华南农业大学兽医学院，广东广州510642） 迄今，由我国周泰冲、袁庆志等于1956年成功研制的中国系（C系）猪瘟兔化弱毒疫苗，是国际公认最理想的猪瘟疫苗。这种疫苗除了在我国被普遍应用外，还广泛推广到欧亚很多国家，不但对控制我国猪瘟流行发挥着关键作用，而且对全球猪瘟的预防和控制起到了举足轻重的作用。很多国家依靠这种疫苗，甚至消灭了猪瘟[1]。 1989年，农业部成都药械厂又在中国C系猪瘟兔化弱毒疫苗的基础上，通过对制苗工艺的创新，成功地研制出猪瘟兔化弱毒犊牛辜丸细胞苗（以下简称猪瘟细胞苗）。这种制苗工艺的创新，大大地降低了制苗成本，且免疫效果并不比传统的猪瘟兔化弱毒疫苗差。其对猪兔效力的平行关系测定显示：对家兔毒价达5万倍的疫苗，1万倍和2万倍稀释免疫猪，攻击强毒全保护，免疫15天后即能产生坚强的免疫力，免疫期至少1年以上[2]。 然而，近年来，很多猪场在对猪瘟疫苗的选择方面，却纷纷弃用细胞苗，改用脾淋苗。以致很多地方政府免费供应给养猪场使用的猪瘟疫苗，都只有脾淋苗，而没有细胞苗。 为比较猪瘟细胞苗和脾淋苗的临床应用效果，2009年2-5月，笔者与相关技术人员一道，在珠海NZ猪场设计并完成了如下对照试验，其步骤及结果如下： 1材料与试剂 疫苗：细胞苗和脾淋苗都来自同一生物制药厂（广东XT生物药厂）。细胞苗（每头份含1500RID）批号：08115；脾淋苗（兔源，每头份含450RID或以上）批号：0846。诊断试剂：美国IDEXX猪瘟抗体ELISA检测试剂，批号：43220-T171。 2 方法和步骤 （1）分组和免疫：在珠海NZ猪场猪群中，选取一批42d，健康、大小均匀的三元杂小猪40头，随机分成A, B两组，每组20头，分别按A1~A20和B1~B20顺序打耳号编号。A组小猪免疫猪瘟细胞苗，B组小猪免疫猪瘟脾淋苗。两组试验猪在相同的饲养管理条件下饲养，并同时于42d和70d每头小猪肌肉注射相应疫苗5头份作猪瘟免疫。 （2）采血和送检：两组试验猪相继于42d（首次免疫猪瘟疫苗前）、70d（第2次免疫猪瘟疫苗前）和105d逐头前腔静脉采血3~4ml，分离血清，冷冻待检。 3 试验结果