分子生物学笔记完全版
分子生物学笔记
第一章基因的结构
第一节基因和基因组
一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列．
一个典型的真核基因包括
①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。
二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。
每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。
人类基因组计划（human genome project, HGP）
基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。
蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）
第二节真核生物基因组
一、真核生物基因组的特点：，
①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中．
②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)，
三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因．可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经重复(duplication)和突变产生。
基因家族的特点：
①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene)．Ψa1表示与a1相似的假基因．
四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同．
第四节细菌和病毒基因组
一、细菌基因组的特点。
1．功能相关的几个结构基因往往串联在—起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，
2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。
3．细菌DNA大部分为编码序列。
二、病毒基因组的特点
1．每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；
2．病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp；
3．除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。
4．大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成．
5．真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子．
6．有重叠基因．
第五节染色质和染色体
(二)组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷<富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力．
(二)．端粒(telomere)：真核生物线状染色体分子末端的DNA区域
端粒DNA的特点：
1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb)．
人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。
2、端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3’端突出。
端粒的作用：防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能
（三）、复制原点
第二章DNA的复制、修复和重组
第一节DNA的复制(DNA Replication)
一、DNA复制的基本特性
1. 半保留性(Semi-Conservative)
2. 双向复制(一般) 复制起始点(origin)+两侧复制叉=复制单位(复制子, Replicon)
3.半不连续性(Semi-discontinuous)
前导链(leading strand)-连续合成，随从链(Lagging Strand)-不连续,由岗崎片段(okazaki fragment)连接而成.
二、DNA复制必需的成份(真核生物)
1.染色体DNA复制必需三种核苷酸序列①复制起点②着丝粒③端粒.
2．RNA引物(RNA Primer) 一般8-14nt.带游离3'-OH末端.
3.参加DNA复制的主要酶和蛋白质
①DNA聚合酶(DNA Polymerase) 真核DNA复制的主要酶DNA Pol a/δ. 功能:从5'-3'方向延伸与模板互补的子代链.
②引发酶(Primase)与其他多种蛋白组成多蛋白复合体-引发体(Primosome).催化RNA引物合成和复制起始.
③DNA连接酶(DNA Ligase) 催化一个双链DNA的5'磷酸与另一双链DNA的3'-OH形成磷酸二酯键.
④DNA解链酶(DNA Helicase),打开DNA双链.
⑤增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen.PCNA) 辅助催化前导链合成.
⑥端粒酶(Telomerase)
末端复制问题。
端粒酶负责染色体末端(端粒)复制,是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白.其中的RNA成分是端粒复制的模板.(因此端粒是逆转录酶)
作用:维持端粒长度.
端粒酶活性可用基于PCR的“TRAP”（Telomerase repeat amplification protocol）法测定
端粒与细胞寿命。
端粒、端粒酶与肿瘤的关系：绝大多数恶性肿瘤具有端粒酶活性但端粒缩短，但也有约5%的肿瘤无端粒酶活性且端粒较长。
端粒酶作为新的肿瘤标志和肿瘤治疗靶点.
第二节DNA修复（DNA repair）
DNA修复是维持基因组完整性的重要机制，在保护基因组避免发生可能导致肿瘤或遗传疾病的突变中起关键的作用。引起DNA损伤的因素：
1、细胞内源性损伤因素：
DNA复制错误；自发损伤包括碱基互变异构、碱基脱氨（C→U、A→I）和碱基丢失等；氧化代谢副产物如活性氧物质（Reactive oxygen species，ROS）的攻击等。
2、环境中的损伤因素：
辐射（含紫外线、X射线）产生胸腺嘧啶二聚体；化学致癌物（氧化脱氨，烷化剂或代谢活化物如苯并芘、黄曲霉素等产生碱基加合物）
一、碱基切除修复(Base excision repair、BER)
该途径中最关键的是必须通过一种糖苷酶(glycosylase)先除去变异碱基(如被氧化、烷基化或脱氨的碱基)，该糖苷酶催化连接损伤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解，释放游离碱基并在DNA中产生一个去碱基位点，然后由去嘌呤／去嘧啶(AP)核酸内切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等利用相对的一条正常链为模板进行修补合成。
BER是修复内源性DNA损伤(自发水解、烷基化和活性氧攻击)的主要途径，因此对于降低自发突变的频率、防止肿瘤发生有重要作用。
二、核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair，NER)
首先由多聚体复合物识别损伤，再在损伤的两侧进行切除。随着DNA链被解开，包含损伤的单链片段释放出来，留下的缺口由DNA聚合酶填补，DNA连接酶封闭。该途径包括20种以上蛋白，可以修复紫外辐射诱导的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和(6—4)光产物((6—4)PPs)，以及一些化学物质产生的大加合物。
NER可再分为二条子途径：
(1)全基因组修复(Global Genomic repair，GGR)途径：修复整个基因组内的损伤，其效率取决于损伤的化学特性、损伤部位的DNA序列和染色质结构。
(2)转录藕联修复(Trancsription—coupled repair，TCR，)：特异地修复基因组中具有转录活性(即表达)的基因的被转录DNA链上的损伤，该途径的特点是依赖RNA聚合酶II催化的转录，其中的一些蛋白是普通转录因子TFIIH 的亚基。
三、错配修复(Mismatch repair)负责修复DNA复制过程中由于错误掺入而产生的错配。
四、重组修复(Recomhinant repair)修复DNA的两条链均受损伤的部位的双链断裂或链间交连。
第三节重组(recombination)
重组的本质是基因的重排或交换.即2个DNA分子间或一个DNA分子的不同部位间,通过断裂和重接,交换DNA片段从而改变基因的组合和序列.
一.同源重组(Homologous recombination)
指DNA同源序列间的重组,常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间。可通过同源重组将外源基因定位整合到细胞基因组中.
二.转座(transposition) 可移动的DNA元件(mobile DNA elements)
-转座元件(Transposable element).它是指那些可在DNA分子内或DNA分子间转移的DNA片段.
转座元件的转移过程-转座
转座的特点:
1.转座后原来位置的转座元件序列仍然保留,但同时又把新合成的DNA 复本插入到另外一个位点.
2.转座过程需要转座酶(transposase).它催化断裂和重接两步连续的过程(需要M2+)
3.转座元件插入位置的两茶有3-12bp的正向重复序列(靶序列),它是由于转座酶错位切割DNA造成的.这种短正向重复序列是存在转座元件的特征.
转座元件的分类
①转座子(transposon):通过DNA复制而转移的转座元件.
②逆转座子(retroposon)或返座子,通过RNA阶段实现转移的转座元件(DNA→RNA→DNA→插入新位点)
转座的遗传效应-导致基因重排、插入、缺失。
第三章基因表达的调控
基因表达：DNA→mRNA→蛋白质的遗传信息传递过程
第一节基因的活化
基因的“开关”-染色质的活化
一、活性染色质的结构
二、活性染色质的结构特点
(一)DNaseI敏感性
转录活性(或有潜在转录活性)的染色质对DNase I更敏感．
(二)组蛋白H3的CyS110上巯基暴露，
三、活性染色质结构的形成
(二)、组蛋白修饰。
（三)HMG蛋白结合
HMG（high mobility group)蛋白—高迁移率蛋白, 如HMG14/HMG17.
与核小体核心颗粒结合，有利转录。
四、DNA甲基化与基因表达．
(一)、真核生物基因组DNA的甲基化(Methylation)
(二)DNA甲基化的转录抑制作用。
持家基因(housekeeping gene)：是指对所有类型组织细胞在任何时候都需要其表达的基因，通常都是维持细胞基本生存所必须的基因，其表达常保持在固定的水平。又称为组成性基因(Constitutive gene)。
（三）甲基化与基因组印迹
基因组印迹(genomic imprinting)：指基因表达活性只局限于来自双亲之一的基因版本。
被印迹(imprinted)的基因．
第二节转录水平的调控
一、真核基因转录基本条件：
特异性基因转录的基本条件包括：
①启动子(特别是核心启动子)
②转录模板(转录起始点（+1）---终止点)
③RNA PolⅡ
④普通转录因子(GTFs)
(一)启动子(promoter)
与基因转录启动有关的一组DNA序列，一般位于RNA poII转录起始点上游100-200bp以内，其功能是决定转录的起始点和调控转录频率．
启动子区域包括核心启动子和启动子上游近侧序列：
1、核心启动子(core promoter)
是决定转录起始位置的关键序列，也是普通转录因子TFⅡD的结合位点，
①TATA盒(TATA box) 位于转录起始点上游-25～-30bp．
②起始子(initiator，Inr) Inr是与转录起始位点重叠的短的较保守序列．
注：①不是所有基因都含有TATA盒或Inr序列．有的只有其中之一，有的两者都无．
②这些核心启动子的序列和它们之间的间隔多变
2、上游启动子元件(Upstream Promoter element，UPE)
位于较上游(-30一-110bp)，能较强影响转录起始的频率，如CAAT 盒和GC盒．其中GC盒是转录因子SPl的结合位点。
(二)RNA聚合酶Ⅱ
负责真核生物蛋白编码基因的转录(产物mRNA)，有7-10个亚基，最大亚基的羧基末端结构域(CTD)具有7个氨基酸(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser -Pro-Set)的重复序列，其中有多个磷酸化位点．CTD磷酸化对调控基因转录有重要作用．(三)基础转录因子(basal transcription factor)
真核基因转录除RNA聚合酶外还需要许多蛋白因子—转录因子参加，其中一些转录因子是RNA聚合酶Ⅱ转录起始必需的，并且可以维持基础水平的转录，因此称为基础转录因子或普通转录因子(general transcription factor)
1．RNA聚合酶II的普通转录因子(TF II)
包括TFIID,TFⅡB,TFIIF，TFIIE，TFIIH，TFIIA等．
TFIID是由TATA盒结合蛋白(TATA binding protein，TBP)和8种TBP协同因子(TBP associated factor，TAF)组成的复合物，TFIID可识别和结合核心启动子(TATA盒和Inr)；
TFⅡB的C端与TFIID和DNA的复合物结合，N-端与TFⅡF协同作用募集RNA聚合酶II，再加上TFIIE,TFIIH形成完整的转录复合物．
TFIIH有蛋白激酶活性，可使RNA Pol最大亚基CTD磷酸化，使转录起始过渡到转录延伸．
TFIIA有助于TFIID与TATA盒核心启动子结合．
2、TAF的作用
TFIID中包括至少8种TBP协同因子,分子量为30—250kD,分别命名为TAFⅡ-30～250．
TAFⅡ150识别起始子(1nr)序列．
TAF是基因转录调控的辅助因子，它的作用是通过与多种转录调控因子（激活物或阻遏物）的转录调控结构域结合，
而介导转录激活或抑制。
二、基因转录的顺式调控元件
顺式调控元件(cis-regulating element)是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因．
(二)增强子(enhancer)
能显著提高基因转录效率的一类顺式调控元件（其核心序列常为8-12bp)．
增强子的作用特点：
1．能(通过启动子)提高同一条链上的靶基因转录速率；
2．增强子对同源基因或异源基因同样有效；
3．增强子的位置可在基因5’-上游、基因内或3’下游序列中；
4．自身没有5’-或3’-方向性；
5．增强子可远离转录起始点(最多30Kb)；
6．增强子一般具有组织或细胞特异性．
(三)负调控元件—沉寂子
负调控元件是能抑制基因表达的序列．如沉寂子(silencer)
(四)其它顺式调控元件
1．应答元件(responsive elements)
真核细胞中对某些特定的环境作出应答的基因，常具有相同的顺式元件—应答元件．
应答元件能被在一些特定情况下表达的调控因子识别(又称为可诱导的顺式调控元件／反式作用因子)。
2．转座元件对基因表达的调控，。
三、基因转录的反式作用因子
转录水平的调控主要是通过与多种DNA元件结合的蛋白因子来实现．
反式作用因子(trans-acting factor)是通过识别和结合顺式调控元件的核心序列而调控靶基因转录效率的一组蛋白质．反式作用因子对基因表达的调控可正(激话)可负(阻遏)．
第三节转录后加工
在细胞核内对基因产物(mRNA前体)进行各种修饰、剪接和编辑，使编码蛋白质的外显子部分连接成为一个连续的开放读框(open reading frame，ORF)的过程称为转录后加工．
一、mRNA前体加工的分子机制-
核内mRNA前体—异质性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，
hnRNA与蛋白质结合形成核异质性核糖核蛋白(hnRNP), mRNA前体的加工在hnRNP上进行．
选择性剪接(alternative splicing)：在mRNA前体的剪接过程中，参加剪接的外显子可以不按其线性次序剪接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择性剪接。此外，不同的启动子或不同的poly(A)加尾位点的选择，也可看作选择性剪接．
选择性剪接的主要方式。
由来自一个基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多种mRNA，并翻译出的不同蛋白质，称为同源异构体(isoform)．>5%的人基因可在不同的组织或生理状态下，通过选择性剪接产生不同的蛋白质异构体，这是造成真接生物高度异质性的基础。
第四节翻译水平调控
四、翻译后修饰
1、氨基酸侧链的共价修饰：乙酰化、磷酸化、糖基化（N-、O-）；
2、蛋白质前体的切割和成熟。Proprotein→protein.例：胰岛素的成熟。
五、蛋白质的分泌和胞内定位
信号肽：作为蛋白质定位信号的短肽序列，指导蛋白质运输到正确位置，定位结束后通常被特异的信号肽酶切除。
第四章原癌基因与抑癌基因
第一节概述
病毒致癌作用，病毒癌基因Viral oncogene，V-onc).。
细咆癌基因(cellular oncogene ，c-onc)或原癌基因(protoncogene)
—正常细胞中与v-onc同源的基因，
抑癌基因(tumor suppressor gene)：是指由于其存在和表达而抑制细胞癌变的基因。
原癌基因与抑癌基因生物学性质差异：
1．功能：抑癌基因在细胞生长中起负调节作用，抑制增殖、促进分化成熟与衰老，或引导多余细胞进入程序性细胞死亡(PCD)，原癌基因的作用则相反．
2．遗传方式：原癌基因是显性的，激活后即参与促进细胞增殖和癌变过程，而抑癌基因为隐性，只有发生纯合失活时才失去抑癌功能．
3．突变的细胞类型：抑癌基因突变不仅可发生在体细胞中，也可发生在生殖系(germ 1ine)细胞中，并通过其遗传突变，而原癌基因只在体细胞中产生突变。
第二节原癌基因
原癌基因是细胞的正常基因，其表达产物对细胞的生理功能极其重要，只有当原癌基因发生结构改变或过度表达时，才有可能导致细胞癌变。
一、原癌基因表达的特点：
l、正常细胞中原癌基因的表达水平一般较低，而且是受生长调节的，其表达主要有三个特点：①具有分化阶段特异性；
②细胞类型特异性；③细胞周期特异性。
2、肿瘤细胞中原癌基因的表达有2个比较普遍和突出的特点：
①一些原癌基因具有高水平的表达或过度表达?
②原癌基因的表达程度和次序发生紊乱，不再具有细胞周期特异性。
3、细胞分化与原癌基因表达．
在分化过程中，与分化有关的原癌基因表达增加，而与细胞增殖有关的原癌基因表达受抑制。
二，原癌基因的结构改变与其表达激活
(一)点突变
(二)染色体易位染色体易位(translocation)：是染色体的一部分因断裂脱离，并与其它染色体联结的重排过程。
(三)基因扩增即基因拷贝数增加．
(四)LTR插入LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复，其中含有强启动子序列。
三、原癌基因产物的功能
大多数原癌基因编码的蛋白质都是复杂的细胞信号转导网络中的成份，在信号转导途径中有着重要的作用．
原癌基因产物可作为：
1、生长因子，如sis(PDGF-β)，fgf家族(int-2，csf-1等)
2、生长因子受体(质膜)：具酪氨酸蛋白激酶活性，如neu，ht，met，erbB，trk，fms，ros-1等。
3、非受体酪氨酸蛋白激酶(质膜／胞质) 如src家族：src，syn，fyn，abl，lck，ros，yes，fes，ret等．
4、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(胞质)：如raf，raf-1，mos，pim-1，
5、G蛋白(质膜内侧)，具GTP结合作用和GTP酶活性，如ras家族中的H-ras，K-ras，N-ras，以及mel和ral等．，6．核内DNA结合蛋白(转录因子) 如myc家族，fos家族，Jun家族，ets家族，rel，erb A(类固醇激素受体)
第三节抑癌基因
一、抑癌基因失活与杂合性丢失
抑癌基因为隐性癌基因，只有发生纯合失活时才对肿瘤形成起作用，通常的表现为抑癌基因的一个等位基因丢失，面另一个存留的等位基因发生突变(点突变、微缺失，重排等)，等位基因丢失常伴有抑癌基因相邻区域的杂合性丢失(Loss of heterozygosity，LOH)，
LOS指肿瘤中特定染色体上某种DNA多态性标志(如RFLP，VNTR、STR或SSCP等)的等位基因片段在同一患者中由正常组织基因组中的两种变为一种，即等位基因型由杂合子变为纯合子。
LOH是肿瘤细胞中部分染色体区域缺失的表现。
二、抑癌基因产物的功能
巳知的肿瘤抑制基因及其蛋白产物功能
基因相关癌产物胞内定位作用
p53 Rb WT-1 APC DCC NF l RET VHL P16(MTS-1) WAF／CIPl BRCAl 肺癌、乳腺癌等（>51种）视网膜细胞瘤等
wilm’肿瘤结肠癌结肠癌神经纤维瘤甲状腺癌肾癌黑素瘤等(多种) 多种乳腺癌、宫颈癌等
核胞质？粘附分子GTP酶激活剂受体酪氨酸激酶转录延伸因子CDK抑制剂CDK抑制剂转录因子抑癌基因p53
人P53基因定位：17P13，11个外显子编码393个氨基酸。
p53基因突变：存在于一半以上的人肿瘤中，多为点突变，主要发生于外显子5-8,如肝癌中的249号密码子第3碱基G→T ,与黄曲霉素B1有关。
P53蛋白结构和功能：
P53蛋白为核内转录因子，包括①核心区的DNA结合域；②N端转录激活域；③C端介导寡聚体化的结构域。
1、P53的中央域识别和结合一个10bp的启动子序列，可激活转录（通过N-端的反式激活域）。P53突变大多发生于中央DNA结合域。
2、P53也可结合DNA损伤时产生的单链区域。
3、P53是四聚体，寡聚化需要C-端域
4、P53激活cki p21, 后者抑制细胞周期于G1期.
5、p53 激活与负责辐身损伤的修复蛋白GADD45，维持基因组稳定性。
6、P53诱导凋亡的机制尚不清楚。
7、正常情况下p53以低水平存在，半衰期短。DNA损伤稳定P53并增加其转录活性
8、Mdm2使p53不稳定，易被降解，并能直接抑制其反式激活活性（Mdm2是癌基因）
第五章信号转导
细胞外信号通过与细胞表面的受体相互作用转变为胞内信号并在细胞内传递的过程称为信号转导(signal transduction) 跨膜信号转导过程包括：
1，胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别，受体被活化；
2，通过胞内信号转导物(蛋白激酶，第二信使等) 的相互作用传递信号；
3，信号导致效应物蛋白的活化，引发细胞应答（如激活核内转录因子，调节基因表达）。
第一节胞内信使
细胞内信使(intracellular messenger)是具有信息传递作用的一些小分子，也称为第二信使(second messengers)。一、cAMP{环磷酸腺苷) ，
生成：腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP;
代谢：cAMP磷酸二酯酶水解cAMP产生5’-AMP
功能：，
①激活蛋白激酶A
②抑制蛋白磷酸酯酶
二、cGMP(环磷酸鸟苷)
生成酶：鸟苷酸环化酶
代谢酶：cGMP磷酸二酯酶
功能：①激活蛋白激酶G ②调控细胞膜离子通道
三、三磷酸肌醇（inositol triphosphate,IP3）和甘油二酯（diacyglycerol, DAG）
G-蛋白偶联受体激活磷脂酶Cβ生成IP3及DAG
功能：
1、IP3：开放胞内钙库，激活Ca2+途径．
2、DAD：在Ca2+和磷脂酰丝氨酸存在下，激活蛋白激酶C，
四、钙离子
细胞内钙离子主要贮存于胞内钙库(如肌细胞的肌浆网，SR)和线粒体中。
细胞质膜两铡[Ca2+]跨膜梯度：细胞外液>>胞浆
胞浆内[Ca2+]的调节一通过(质膜和钙库膜上的)钙离子通道(进入)和钙泵(出)，
钙通道开放的条件：
①质膜或钙库膜去极化(可兴奋细胞)；
成②IP3介导钙库膜上钙通道开放(任何细胞)．
钙泵激活．线粒体钙泵的作用．
Ca2+功能：与钙调蛋白(calmodulin, CaM)结合形成Ca2+?CaM复合物：
①激活腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶，②激活Ca2+?CaM依赖蛋白激酶
钙通道阻断剂及其临床应用。
五、一氧化氮(NO)
NO合成酶催化L-精氨酸生成NO和胍氨酸
NO合成酶(NOS)分类：①神经元型(nNOS)．
②内皮细胞型(ecNOS)
③诱导型（iNOS)
功能：激活乌苷酸环化酶，刺激cGMP合成。
NO的生理病理作用
第二节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶
蛋白激酶(Protein kinase，PK)催化蛋白质的含羟基氨基酸(丝／苏和酪)的侧链羟基形成磷酸酯（ATP的γ磷酸基转移至氧）．
蛋白质磷酸酯酶(Protein phosphatase，PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化。
细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种相反酶活性之间的平衡决定的。
蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。
一、信号转导过程中的蛋白激酶
{一)丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(Ser／Thr PK)
是一大类特异地催化蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的激酶家族，参与多种信号转导过程。
1、蛋白激酶A（PKA)
-cAMP依赖性蛋白激酶.
PKA由两个催化亚基C和两个调节亚基R所构成
PKA参与cAMP介导的转录水平调控。
PKA的其它(下游)底物：①多种代谢相关酶②核内组蛋白和非组蛋白③膜蛋白等。
2、蛋白激酶C(PKC)
-Ca2+激活的／磷脂依赖性蛋白激酶．
调节：可被Ca2+，DAG和磷脂酰丝氨酸激活．TPA(佛波酯)也可激活．
PKC分子由N-端的调节区和C—端催化区（亲水的蛋白激酶结构域）所组成。
PKC有多种亚型(>12种)．
PKC可激活：
①受体，如EGFR，胰岛素受体，细胞因子受体等。
②细胞骨架蛋白如Map，Tau．
②膜蛋白，如Na+-H+交换蛋白，Ca2+-ATP酶等．
④核蛋白／转录因子，起始因子等，
⑤信号转导物如鸟苷酸环化酶，Raf-1等．
3、Ca2+?钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Cam-PK)
Cam-PKII是一种多功能的蛋白激酶．
4。cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)
功能：调节胞内钙离子．
5，DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)
调节：结合游离DNA片段后被激活，
底物：核内DNA结合蛋白和转录因子，如SPl，Fos／Jun，Myc和P53，
作用：①参与DNA修复和重组,
②通过激活TF调节基因表达;
③参与细胞周期的关卡机制(Checkpoint).
6．丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)
调节：MAPK激酶-MAPKK（MEK）。
下游底物：核内转录因子如Myc，Jun，Ets及其它胞内蛋白．
(二)酪氨酸蛋白激酶（Tyrosine protein kinase，TPK)
—特异地催化蛋白质的酪氨酸残基磷酸化，
蛋白质酪氨酸磷酸化在细胞生长，分化和转化的调节中起重要作用。
1、经典的src激酶家族
原癌基因c-src蛋白产物Src是一种酪氨酸蛋白激酶，它有三个基本结构域：从C-端至N--端依次为SH1、SH2，SH3(SH=src homolog)。
SHl结构域：具酪氨酸激酶活性，
SH2结构域：能识别并结合含磷酸化酪氨酸的短序列，
SH结构域：通过脯氨酸和疏水性氨基酸残基与靶蛋白结合，
Src家族：包括原癌基因src，yes，lyn，fyn，lck，blk，fgr，bcd和yrk编码蛋白，它们都有TPK活性．共同参与细胞转化的信号转导过程．
SH2结构域在信号转导途径中的重要作用：由于含SH2结构域的信号转导分子可以识别和结合其他含磷酸化酪氨酸的蛋白，因此，通过蛋白质的酪氨酸磷酸化／去磷酸化调节可以决定信号转导分子的结合与解离，从而导致信号的开启或关闭。
2、JAK嫩酶家族
JAK(Janus kinase)激酶家族包括Jakl，Jak2，Jak3，Tyk2等，
Jak激酶具有一个TPK结构域和一个激酶样结构域，它们与Src的TPk激酶结构域具有同源性，但JaK激酶没有SH2，SH3结构域；
Jak激酶主要参与细胞因子的信号转导．
二、蛋白磷酸酯酶对磷酸化的调节
(一)、丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶
这类酶选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性．
主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C，等．
PP2A，催化亚基及其功能．
(二)酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)
蛋白质酪氨酸磷酸酯酶催化磷酸化酪氨酸残基的去磷酸化反应，与相应的酪氨酸蛋白激酶共同调节蛋白质的磷酸化水平，
PTPase家族可分为2类：
1、胞质型(非受体型)：小的可溶性蛋白，只有一个催化结构域，
特点是合有SH2 domain，如PTPlC，，PTPlB等．，
2．受体型(PTPR)，是大的跨膜蛋白，特点是有2个串联的胞浆催化结构域，如白细胞共同抗原CD45，
PTPlC(存在于造血细胞)：N端2个串联重复的SH2结构域{识别Tyr?P，并指导蛋白与蛋白结合)，C端为磷酸酯酶催化结构域。
Jak可作为PTP1C底物．
PTPase基因可能是肿瘤抑制基因．
第三节细胞膜受体介导的信号转导
一、受体的分类
质膜受体和胞内受体（胞浆或核受体，如类固醇激素受体）
膜受体的分类：
（一）G蛋白耦联受体家族
又称为七次胯膜受体家族，特点是具有七段跨膜的α螺旋结构，本身无酶活性，胞浆侧肽链上有磷酸化位点，受体功能受磷酸化调节。成员；肾上腺素受体、多巴受体、视紫红蛋白等。
（二）酪氨酸激酶受体家族
受体本身胞浆侧有蛋白酪氨酸激酶活性，并且胞浆侧肽链上有自身磷酸化位点，配基结合后受体形成二聚体，二聚体中每个亚基可以磷酸化对应的另一亚基，从而启动信号转导。
这类受体主要包括多数生长因子受体(如IGF，EGF，PDGF，NGF，SCF，HGF等生长因子的受体)，除胰岛素受体外，这类受体均由一条肽链组成．
(三)细胞因子受体家族
这类受体本身无TPK活性，但其胞浆侧近膜部分有非受体酪氨酸蛋白激酶的结合位点，在配基与受体结合后，受体发生二聚化或寡聚化，并激活Jak族蛋白酪氨酸激酶．
此类受体包括细胞因子受体以及生长激素、促乳素等受体．
细胞因子(cytokine)：是淋巴细胞和造血细胞产生的一大类对细胞生长和分化有调节作用的蛋白因子。包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、白血病抑制因子（LIF）、抑癌素M等(但IL-8R为G蛋白藕联受体)
(四)离子通道受体
与配基结合后构成离子通道，主要存在于神经突触，如乙酰胆碱(ACH)，5-HT受体等。
二、G蛋白介导的信号转导。
G蛋白藕联受体的信号转导途径由三部分组成：
①细胞膜受体；②G蛋白③效应物(effector)，其中G蛋白将受体与效应物藕联．
G-蛋白(G-protein)是一种鸟苷酸结合蛋白，是由α、β和γ三个亚基组成的异三聚体，多，β和γ亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位Gβγ
Gα亚基可分为Gs,Go,Gi,Gq等，其活性可被霍乱毒素（CT）或百日咳毒素（PT）修饰。
G-蛋白介导的信号转导的机制：G-蛋白循环。
G-pr的效应物：离子通道、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2等
三、RAS-MAPK信号转导途径
1、途径中的信号分子
Ras：具鸟苷酸结合活性的一种胞浆蛋白（与G-蛋白不同）
Ras活性与其结合的鸟苷酸有关。
鸟苷酸交换因子（SOS）
Ras?GDP Ras?GTP
(失活) GTP酶激活蛋白（GAP）（激活）
接头蛋白：生长因子受体结合蛋白Grb2，通过其SH2结构域与Tyr被磷酸化的受体结合，同时通过其SH3域与具有pro富集区的SOS结合，并通过SOS活化Ras蛋白．
2、Ras-MAPK途径：
生长因子→生长因子受体(具酪氨酸激酶活性)→含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)→鸟苷酸交换因子SOS→Ras-GTP→Rafl→MAPKK（MEK）→MAPK→转录因子→调节基因表达。
3．Ras-MAPK途径的调节
①Ras-MAPK途径中信号转导分子的突变(如Ras)和表达量的改变．
②其他信号转导途径的影响
cAMP-PKA：抑制Raf-1；PKC：活化Raf~l，
四、Jak-stat途径：
STAT：信号转导物与转录激活剂（signal transducer and activators of transcription）
至少6种，分子量84-113KD，含一个SH2结构域(羧端)，一个SH3样结构域，并合有DNA结合域，Stat的激活依赖通过磷酸化形成二聚体．
Jak-Stat途径：
细胞因子→受体(二聚体化)→Jak→Stat→Stat二聚体(活化)→易位至核，影响转录．?
第六章细胞周期及其调节
细胞增殖(cell proliferation)与细胞生长分裂周期．
第一节细胞周期
一、细胞周期(cell cycle)：指亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程，这个过程所需的时间称为细胞周期时间。
细胞周期由G1、S、G2和M期组成(G1、S和G2期又合称为分裂间期)。
G1(Gap1)期：DNA合成前期(复制前期)，从上次有丝分裂完成到DNA复制之前的阶段;
S期：DNA复制期;
G2期：合成后期，从DNA复制完成至有丝分裂开始;
M期：有丝分裂(Mitosis)期，包括核分裂和胞质分裂．
M期结束后形成两个新的子细胞。
注：①不同细胞的细胞周期时间不同，一般S+G2+M期较恒定，而G1期变化较大，因而它决定了细胞周期时间的长短；
②G1期细胞有三种可能的趋向：1)进入S期(即进入细胞周期)．2)处于静止期即Co期(在一定条件下可重新进入增殖周期)，3)分化、衰老、凋亡。
二、细胞周期中各时相的主要生化事件
细胞周期中每期都有其特殊功能，其中S期的DNA复制和M期细胞核的有丝分裂是细胞周期中2个最关键的过程：1、G1期：为DNA复制作准备，G1早期合成各种RNA、结构蛋白和酶等，细胞通过一个限制点(restriction point，R点)后在G1后期合成DNA复制有关的蛋白和酶。
在开始合成DNA之前有一个关卡(checkpoint)，检查染色体DNA是否有损伤，如有则先要进行修复。
2、S期：DNA(包栝端粒)的复制及组蛋白合成、核小体装配．S期后每一染色体复制成2个染色单体?
S→G2期关卡：检查DNA复制是否完成
3、G2期：为有丝分裂作准备．有RNA和非组蛋白合成。
4、M期：染色体浓缩一仿锤体形成→染色体分离并移向细胞两端→染色体解聚，形成两个新核→胞质分裂。
第二节周期素依赖性蛋白激晦与细胞周期调节
周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs) 通过使特异底物磷酸化调节细胞周期进行，其活性依赖与周期素(cyclin)结合形成复合物。
一、周期素-周期素依赖性蛋白激酶
周期素家族和周期素依赖蛋白激酶(CDK)家族．
细胞周期的不同时相表达不同cyc-CDK，这些cyc-CDK复合物在各不同的细胞周期过渡点起作用．
1、G1期cyc-CDK
G1期表达的周期素为周期素C、D（D1、D2、D3)和E。
D族周期素主要与CDK4(以及CDK2、CDK5、CDK6)结合成活性的蛋白激酶复合物，对细胞通过R点(G0→G1过渡有重要作用。
E族周期素与CDK2形成复合物。
cycE-CDK2复合物调控G1→S过渡。
2、S期和M朔cyc-CDKs
cycA-CDK2：驱动细胞通过S期．
cycB-cdc2：驱动G2→M期过渡(cdc2或p34cdc2即CDKl)．
二、周期素依赖性蛋白激酶抑制物
(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKIs)
CKls通过与CDKs结合而抑制激酶活性，在细胞周期中起负调控作用．
CKIs一般按其分子量命名．：
CKls的分类：
1、Kip／Cip家族：包括三种结构相关蛋白P21、P27、P57、特点是能结合并抑制大多数cyc-CDK复合物；
P21(其它名称WAFI／CIPl等)：可被P53诱导转录，P21抑制cycDl-CDK4和cycE-CDK2，参与(由于DNA损伤诱导的)P53介导的细胞周期停止。
P27参与血清去除、接触抑制和TGF-β等导致的细胞周期停止。
2、INK4蛋白家族，包括四种相关蛋P16、P15、P18、P19．
特点：INK4是cycD-CDK4和cycD-CDK6的专一性抑制剂，并与CDK单体结合。
P15可能参与TGF-β诱导的细胞周期停止于G1期，’
三、细胞周期调节因子与肿瘤
1、cyclin和CDKs可能为原癌基因，其突变或过度表达可导致细胞转化。
2、CKI可能是广谱的肿瘤抑制基因，其失活导致CDK活性失调。
p16(MTSl)在肿瘤中突变特点及其作用。
第三节细胞周期的其它调节机制
生长因子、生长抑制因子、原癌基因(如，myc)和抑癌基因产物、蛋白质可逆磷酸化、蛋白水解等对细胞周期也有重要调节作用。
一、pRB ，?
抑癌蛋白，分子量106KD，其活性与磷峻化状态有关：
G0及G1早期：pRB非磷酸化，与转录因子E2F-1结合(抑制转录)
GF等→cycD-CDK4及cycE-CDK2激活→pRb磷酸化(失活)→释放E2F→DNA合成基因表达。
二、p53
抑癌蛋白(转录因子)，
在细胞周期中的作用：参与细胞周期关卡-DNA损伤检查的关键蛋白(通过诱导P21转录使细胞周期停止于G1期)。
三、细胞因子对细胞周期的作用．
1．生长因子在细胞通郧点中的作用
GF→GFR→Ras-MAPK→fos/jun等基因表达→cycD-CDK4等表达→pRB磷酸化→E2F释放→进入细胞增殖周期。
2、生长抑制因子与细胞周期停止
TGF-β使细胞周期停止于G1期。
四、泛有素(Ubiquitin，Ub)介导的蛋白水解作用
周期素，周期素依赖性蛋白激酶抑制剂(如P27)以及其它细胞周期调节蛋白均可通过泛有素介导的蛋白酶水解作用降解，这些按精确的时间顺序进行的蛋白水解反应在细胞周期的不同阶段起着重要的调节作用。
第七章细胞凋亡
凋亡（apoptosis）, 程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）
生理性细胞死亡。
第一节细胞凋亡概论
一、凋亡与坏死apoptosis vs. necrosis）
凋亡是一个受细胞主动调节的自身消化过程，凋亡细胞的特征形态学改变使其可被其它细胞吞噬而不泄露胞质内容物，不会引起炎症反应。
坏死是由于物理损伤、缺血或细菌毒素等引起的破坏性细胞死亡过程，细胞内容物的释放导致局部炎症反应。
二、凋亡的生理功能
1、维持组织稳态平衡（homeostasis）,通过干细胞分裂产生新细胞的同时，选择性地除去那些损伤的或老的或多余的细胞。
2、清除不需要的免疫细胞。
3、神经元发育
4、个体发育
三、凋亡细胞的形态学和生化特征
1、细胞皱缩（shrinkage）
2、质膜出泡（blebbing）
3、染色质浓缩
4、DNA裂解：核小体DNA ladder
5、磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧
6、凋亡小体的释放
第二节凋亡的分子机制
一、细胞表面死亡受体
细胞死亡受体家族的成员是一类跨膜蛋白，它们均含有一个与配基结合的胞外结构域；一个跨膜域和一个转导胞外信号进入胞内的胞内结构域(死亡结构域)。这此受体（如Fas、TNF受体）同它们的配基结合后被激活并导致细胞凋亡。
二、Bcl-2家族
对B细胞淋巴瘤的研究发现bcl-2是一种抗凋亡基因，进一步研究证明它与ced-9基因同源。
1、由于8：14染色体易位所致的bcl-2过度表达抑制肿瘤细胞凋亡。
2、与Bcl-2功能相似的有Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, and A1等，构成一个大的蛋白家族。
3、这些蛋白表达于线粒体、内质网和核被膜的外膜，Bcl-2及其高度同源物Bcl-xl 保护线粒体膜的完整性。
Bax-促进凋亡的Bcl-2家族成员：
1、与Bcl-2结合的蛋白，包括Bax、Bak、Bik 、Bid、Bim和HRK。
2、当在细胞中过度表达时促进凋亡，其杀细胞活性可被Bcl-2类蛋白拮抗。
3、抗凋亡蛋白和促进凋亡的蛋白如Bcl-2和Bax间的比率决定细胞对凋亡信号的敏感性。
4、Bax可被P53上调，这是DNA损伤时P53诱导细胞死亡的一种方式。
5、这些蛋白通常存在于其它胞内隔室如胞浆中，在凋亡时移动进入线粒体。
三、Caspase 蛋白酶-实施凋亡的蛋白酶
1、这是一族半胱氨酸（cysteine）催化的在天冬氨酸（aspartic acid）处裂解底物的蛋白酶（半胱天冬酶）
2、所有Caspase先以无活性的酶原（procaspase）的形式合成，其激活过程包括：①二聚体化②caspase自身序列裂解成小亚其和大亚基③除去prodomain。
3、最早发现的caspase 为IL-1β转化酶(ICE=caspase-1) 它将pro-IL-1 前体裂解成其活性形式。ICE 基因转染导致细胞凋亡。此过程可被一种牛痘病毒蛋白CrmA抑制。CrmA抑制所有caspase。
4、已知该家族成员超过12个，虽然其中某些caspase参与白细胞介素的成熟，但大多数作用是激活凋亡。通过在特异性caspase裂解位点(e.g. DEV D)处裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活，从而影响凋亡。
例如：
a. DFF -DNA fragmentation factor- cleavage of an inhibitory subunit activates this nuclease which cuts the DNA into
a distinct ladder-likepattern and for chromatin to condense.
b. PARP -Poly-ADP ribose polymerase, a DNA repair enzyme inactivated by caspases
c. nuclear lamin - causes nucleus to lose its structural integrity after cleavage
d. cytoskeletal proteins - cleavage causes membrane blebbing
5、杀伤T-淋巴细胞可释放颗粒酶（granzymes）于靶细胞上而诱导凋亡：granzymes 裂解和激活caspase→诱导凋亡
6、现正研究能完全阻断凋亡的caspases抑制剂，看它们是否能保护中风、心梗和器官移植中细胞免于因缺血诱导的凋亡
四、Caspases的激活
（一）死亡受体被其配基激活
1、TNF 受体与称为TRADD的蛋白结合，后者再结合FADD；Fas直接与FADD结合。
2、FADD结合caspase-8 (又称为FLICE),它含有死亡结构域同时又具蛋白酶催化活性
3、活化的caspase-8激活凋亡途径.；
4、.触发激活的关键是受体的寡聚化。在Fas系统中FasL与Fas 的相互作用导致Fas 受体形成三聚体,从而激活凋亡。
5、FasL 也是一个单一跨膜蛋白。FasL 既可通过与之相互作用杀死相邻细胞，也可激活细胞自身的Fas而自杀。（二）Apaf1- caspase活化蛋白
1、Caspase-8裂解Bid 使其C-端域易位至线粒体中。
2、Bid及其它Bcl2家族促凋亡蛋白的作用导致线粒体释放细胞色素C。.
3、Bcl2抑制cytochrome c释放。
4、Cytochrome c 在胞浆中与Apaf-1结合。Apaf-1/cytochrome c经需能的寡聚化形成大的蛋白复合物(Apoptosome)，后者聚集procaspase-9
5、procaspase-9经自身裂解而活化。
6、Caspase-9裂解caspase-3和其它caspases，激活凋亡的效应器期effector phase ）,从而使细胞结构被破坏。
第八章基因克隆
基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：
１、获得待克隆的DNA片段（基因）；
２、目的基因与载体在体外连接；
３、重组DNA分子导入宿主细胞；
４、筛选、鉴定阳性重组子；
５、重组子的扩增与／或表达。
第一节重组DNA中常用的工具酶
包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，
一、限制性内切酶的定义、命名和分类
限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点
1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；
2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；
3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。
4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和Sau3A。
三、其它工具酶
参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）
第二节载体－宿主系统
一、概述
载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：
１、能在适当的宿主细胞中复制；
２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；
３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；
４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；
５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：
１、对载体的复制和扩增没有严格的限制；
２、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；
３、在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；
４、重组缺陷型，不会产生体内重组；
５、容易导入重组DNA分子；
６、符合重组DNA操作的安全标准。
二、质粒载体
质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。
作为载体的质粒一般具有以下特点：
１、分子相对较小（３∽１０kb）；
２、松驰型复制；
３、具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；
４、具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；
５、质粒能携带的外源DNA片段一般较小（<15kb）．
三、λ噬菌体载体
λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约为50kb+。
线性λ噬菌体DNA分子的两端各有12碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点。
λ噬菌体的生活周期：溶菌（裂解）生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生长。
λ噬菌体的基因组：左臂长约20kb,含噬菌体头、尾蛋白编码基因；中央片段长约12-24kb,对噬菌体为非必需区；右臂长约10kb,含λ噬菌体复制和溶菌相关蛋白的编码基因。所有λ噬菌体载体均为通过切除非必需的中央区，并增减某些限制性酶切位点和插入适当的筛选标记基因改造而成。
已构建的λ噬菌体载体分为两类：
１、置换型载体：有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点，其间的DNA片段可被外源DNA置换。这类载体适
于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于构建基因组DNA文库。
２、插入型载体：只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。这类载体允许插入5-7kb的外源DNA,适于构建cDNA文库。如λgt 噬菌体载体。
一般将噬菌体DNA在体外包装成病毒颗粒后再用于感染受体菌，这样能大大提高转染效率。
四、Ｍ13丝状噬菌体载体
Ｍ13基因组大小为6407bp，它是一种闭环的单链DNA分子，在感染细菌后呈双链复制型DNA。因此用作克隆载体的双链DNA可从细菌中分离得到。在细菌中，双链DNA复制100-200拷贝后就大量产生单链DNA,后者包装成子代噬菌体颗粒，分泌到细胞外，而不裂解细菌。
在M13基因组中含507个核苷酸的非必需区，在这个区域插入外源DNA不会影响M13的繁殖和生存，现在使用的M13载体如M13Mp18等均为对此区域进行改造而获得。
M13克隆的最大问题是不能插入较大的外源ＤＮＡ片段（一般<1000bp）,但M13载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒中含有一条与克隆的模板DNA互补的单链，所以最适合于制备DNA测序时用的单链模板，另外也可用于制备单链特异性DNA探针。
五、粘粒载体
粘粒（柯斯质粒）是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制，但不表达任何噬菌体的功能。
粘粒的结构特点：
１、含有抗药性标记和质粒复制起始位点；
２、一个或多个单一限制酶切位点；
３、带有λ噬菌体粘性末端；
４、分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb的外源DNA片段，因此适于构建真核生物基因组DNA文库。
六、酵母人工染色体载体
酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成。它可携带长达200-1000kb的DNA片段，因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。
用酵母人工染色体克隆DNA的过程与λ噬菌体相似，将DNA大片段与载体的两臂相联，然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选。
第三节目的基因的获取
一、通过建立基因文库分离靶基因
基因文库包括两类：基因组文库和cDNA文库，两种文库的建库过程不同，产生的基因结构也不同，因此应用范围也不相同。
（一）、基因组文库
是含有某种生物体（或组织、细胞）全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。
用λ噬菌体载体构建基因组文库的基本步骤：
１、准备载体DNA(如置换型λ噬菌体载体)，用适当的限制酶消化并分离得到载体的左右两臂；
２、纯化真核细胞高分子量DNA，并用适当的限制酶部分消化；
３、分离适当大小的基因组DNA片段（20-24kb）；
４、连接载体与外源ＤＮＡ；
５、连接产物体外包装及感染；
６、基因组文库的扩增。
由于基因组文库包含了染色体的所有随机片段形成的重组DNA克隆，因此，利用适当的筛选方法，就可以从中找出携带所需目的基因片段的重组克隆。
（二）、cDNA文库
cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA.
以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库。
从cDNA文库可以获得较完整的连续编码序列（不含内含子），便于表达成蛋白质。
构建cDNA文库的主要步骤：
１、mRNA分离；
２、cDNA第一链合成；
３、cDNA第二链合成；
４、载体与cDNA的连接;
５、噬菌体的包装及转染；
６、cDNA文库的扩增和保存。
二、化学合成法制备DNA片段
主要用于一些小的DNA 片段的合成。
三、聚合酶链反应法扩增基因片段
对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。
第四节DNA分子的体外连接
DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成的。
一、DNA连接酶
DNA连接酶催化两年双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：
１、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；
２、连接双链DNA分子间的平端；
３、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
二、粘性末端连接
如果载体和插入片段具有相同的粘性末端，则很容易用DNA连接酶连接成环状的重组DNA分子，但是要注意当载体和插入的两个末端均为同源的粘性末端时，连接后可能出现以下问题：
１、载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA 5’- 端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；
２、插入片段可双向插入；
３、插入片段可多拷贝插入。
当DNA片段两端为非同源的粘性末端时，可实现定向克隆，这时的连接效率非常高，是重组方案中最有效、简捷的途径。
三、平端连接
平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何DNA平端，这对不同DNA分子的连接十分有利。因为除了相同或不同限制酶酶切产生的平末端分子外，含3’-或5’-突出的粘性末端也可以被补齐或削平，实现平端连接。
（一）、5’-突出粘性末端的补齐
限制酶降解产生的5’-端突出的粘性末端，可用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段（klenow片段）补齐。
（二）、3’-突出粘性末端的削平
含3’- 突出的粘性末端可用T4 DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性补平。
平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4 DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促进平端连接反应。
四、人工接头连接
对平端DNA片段，可借助人工合成的接头来方便连接。所谓接头是人工合成的至少８个核苷酸长的一段迥文序列。接头是平端，在磷酸化后通过T4 DNA连接酶可与大多数平端DNA连接。连接后用相应的限制性内切酶切割，可产生所需要的粘性末端。
五、利用适配子连接
适配子是人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的短序列，它具有一个平端，可与其它DNA的平端连接，同时它还有某种限制酶的突出端，可与含互补的限制酶突出端的DNA片段连接，连接后，用适当的限制酶切割又可产生所需要的突出粘端。
第五节重组DNA导入宿主菌
体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。
一、转化
指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。
此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。
二、转染和感染
利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。
第六节重组克隆的筛选与鉴定
基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。
一、抗药性标志的筛选
如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetrr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。二、β－半乳糖苷酶系统筛选
很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补，而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。
三、菌落快速裂解鉴定法
从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。
四、内切酶图谱鉴定
经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。
五、通过聚合酶链反应筛选重组子
一些载体的外源DNA插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序列作为引物，对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可迅速扩增插入片断，判断是否阳性重组子，还可直接对插入进行DNA 序列分析。
六、菌落或噬菌斑原位杂交
它是先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后用标记的特异DNA探针进行分子杂交，挑选阳性菌落。该法能进行大规模操作，一次可筛选多达5x105-5x106个菌落或噬菌斑，特别适于从
基因文库中挑选目的基因。
第九章基因诊断
基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。
基因诊断的主要技术：
1、核酸分子杂交
2、聚合酶链反应（PCR）
3、基因芯片技术
第一节核酸分子杂交技术
核酸杂交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。
一、核酸杂交的基本原理
DNA的变性和复性：
在一定的条件（如适当的温度、有机溶剂存在等）下，DNA的双链可解开成为单链，这一过程称为DNA的变性（Denaturatioin）。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。
Tm值是反映DNA的热稳定性的一个参数，称为DNA的熔化温度，系指一半的双链DNA解离成为单链时的温度。DNA的热稳定性或Tm值直接与其碱基组成特别是GC碱基对含量有关，GC碱基对含量越高，Tm值也越高。DNA的杂交即复性（Renaturation）是变性的单链DNA在一定的条件下（低于Tm的温度下）与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与Tm值相关。
影响杂交的主要因素：
温度：一般在低于Tm约15至２５度的温度下杂交速率最快。
盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过0.4M 时，对复性速度和Tm值影响不大。
甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少0.72℃。常用50%甲酰胺
硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。
二、核酸探针的选择和标记
核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段，它必须具有高度的特异性，并且带有某种适当的标记以便被检测。
（一）核酸探针的类型
1、克隆的DNA片段，常用cDNA探针。
2、RNA探针（Riboprobe）
RNA探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。
3、寡核苷酸探针可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。
4、聚合酶链反应扩增产物是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。
（二）核酸标记的类型
放射性同位素目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。
核酸探针标记常用的同位素有以下几种：
１、３２P：其放射性强，自显影时间短，灵敏度较高，缺点是半衰期短（14.3天），放射线散射较严重，因此对分辩率有影响。
２、35S ：放射性较低，半衰期长（87.1天），灵敏度较高；低散射，因此在用Ｘ－光片自显影时分辩率高，特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。
３、33P ：是一种较理想的同位素，它的放射性较低，灵敏度高，分辩率好，半衰期也较长(25.4天)，适用范围较
广。但价格偏高。
非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。
优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。
（三）核酸探针的标记
1、随机引物法（Random priming）
随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，因此可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。
标记酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－klenow片段。
特点：所得探针的放射性比活较高，适用于大多数杂交。
2、缺刻平移法(Nick translation0
标记酶：大肠杆菌DNaseⅠ（极微量）和DNA聚合酶Ⅰ。
用缺刻平移法制备的探针较短，较适合于原位杂交。
3、RNA探针的制备和标记
RNA探针可用RNA聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高，所得产物大小均一，有较高的比活，特异适合于Northern杂交和原位杂交。
4、聚合酶链反应标记DNA探针
利用Taq DNA聚合酶和标记的dNTP,sk 以少量的起始模板合成高比活的c双链或单链DNA探针。
5、寡核苷酸探针的标记
5’-端标记：T4多核苷酸激酶标记法，一般用于制备DNA序列分析时用的5’-标记的寡苷酸引物。
3’-端标记：末端转移酶法，32P-dNTP或ddNTP。
6、非同位素核酸探针标记：地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和同位素探针相似。但是不能用多核苷酸激酶标记法直接对5’-端进行非同位素标记。
三、常用核酸杂交技术
滤膜杂交
固相杂交
核酸杂交原位杂交
液相杂交
滤膜杂交是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上，然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。
滤膜杂交的基本过程为：
1、核酸探针的制备和标记；
2、核酸片段的凝胶电泳分离；
3、将凝胶中的核酸片段通过印迹（blot）转移到某种固相支持物上；
4、用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交（通过还包括预杂交）；
5、洗膜（除去未杂交的游离探针等）；
6、检测带标记的杂交分子（放射自显影或酶联反应）。
（一）斑点／狭缝印迹（Dot/slot blot）杂交：DNA或RNA样品经变性后直接点样于尼龙膜上，然后进行杂交和检测。其优点是简单、迅速，可同时做多个样品；缺点是特异性不好，有一定比例的假阳性，此外，靶核酸的分子大小难于判断。
（二）Southern印迹：指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程。
Southern印迹杂交的步骤如下：
1、用限制性内切酶消化大分子DNA;
2、用琼脂糖凝胶电泳对DNAa片段按分子量大小分离；
3、将DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后，再转移到适当的固相支持物上并与之结合；
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现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
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结合着下载的资料复习吧~~~~ 绪论 分子生物学的发展简史 Schleiden和Schwann提出“细胞学说” 孟德尔提出了“遗传因子”的概念、分离定律、独立分配规律 Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离出DNA Morgan基因存在于染色体上、连锁遗传规律 Avery证明基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体 McClintock首次提出转座子或跳跃基因概念 Watson和Crick提出DNA双螺旋模型 Crick提出了“中心法则” Meselson与Stah用N重同位素证明了DNA复制是一种半保留复制 Jacob和Monod提出了著名的乳糖操纵子模型 Arber首次发现DNA限制性内切酶的存在 Temin和Baltimore发现在病毒中存在以RNA为模板，逆转录成DNA的逆转录酶 哪几种经典实验证明了DNA是遗传物质? (Avery等进行的肺炎双球菌转化实验、Hershey 利用放射性同位素35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质外壳和DNA) 第二章染色体与DNA 第一节染色体 一、真核细胞染色体的组成 DNA：组蛋白：非组蛋白：RNA = 1：1：(1-1.5)：0.05 （一）蛋白质（组蛋白、非组蛋白） （1）组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 功能：①核小体组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）作用是将DNA分子盘绕成核小体
②不参加核小体组建的组蛋白H1，在构成核小体时起连接作用 （2）非组蛋白：包括以DNA为底物的酶、作用于组蛋白的酶、RNA聚合酶等。常见的有（HMG蛋白、DNA结合蛋白） 二、染色质 染色体：分裂期由染色质聚缩形成。 染色质：线性复合结构，间期遗传物质存在形式。 常染色质（着色浅） 具间期染色质形态特征和着色特征染色质 异染色质（着色深） 结构性异染色质兼性异染色质 （在整个细胞周期内都处于凝集状态）（特定时期处于凝集状态）三、核小体 由H2A、H2B、H3、H4各2 分子组成的八聚体和绕在八聚体外的DNA、一分 子H1组成。八聚体在中央，DNA分子盘绕在外，由此形成核心颗粒。,H1结合在核心颗粒外侧DNA双链的进出口端，如搭扣将绕在八聚体外DNA链固定，核心颗粒之间的连接部分为连接DNA。 核小体的定位对转录有促进作用
分子生物学笔
(gene) RNA DNA --(exon) --(intron) 5'-3'-(UTR) () (split-gene) (genome) () DNA 3X1 09(30bp)10 DNA C(C-value Paradox) human genome project, HGP genomics,structural genomics functional genomics proteome proteomics DNA (2--3) DNA• ()(>lO5) DNA(Satellite DNA) () 1 DNA () 2 (long interspersed repeated segments) LINES (Short interspersed repeated segments) SINES SINES<500bp>105Alu LINEs>1000bp(7Kb),104-105LINEl ()(Unique Sequence)
(gene family) (ancestral gene)(duplication) (gene cluster)(tandemly repeated genes)rRNA tRNA (Pseudogene) a1a1 (processed pseudogene) 1tRNA 1300tRNA tRNA 2rRNA >l00copy rRNA(28S18S 5.8s-rRNA) 3 30-40copy7q32-q36 (H1H2A H2B H3H4) intron Poly(A)- RNA 4 16p13(24Kb)5'------1--2--1--3' 11p15(60Kb)5'----Gr--Ar--------3' (Supergene family Superfamily) 1A1u 50-1003-6Kb Alu A1u300bp 2X130bp +31bp() 7-21bp(direct repeats)? Alu90%Alu Alu 2• • Variable number tamdem repeat VNTR DNA(minisatellite DNA) (6-40bp)(6-100) VNTR----DNA fingerprint. DNA H-Ras 3short tandem repeat,STR DNA microstallite DNA 2-6(10-60), l0kb
分子生物学问题汇总
Section A 细胞与大分子 简述复杂大分子的生物学功能及与人类健康的关系。 Section C 核酸的性质 1.DNA的超螺旋结构的特点有哪些？ A 发生在闭环双链DNA分子上 B DNA双链轴线高卷曲，与简单的环状相比，连接数发生变化 C 当DNA扭曲方向与双螺旋方向相同时，DNA变得紧绷，为正超螺旋，反之变得松弛为负超螺旋。自然界几乎所有DNA分子超螺旋都为负的，因为能量最低。 2.简述核酸的性质。 A 核酸的稳定性：由于核酸中碱基对的疏水效应以及电荷偶极作用而趋于稳定 B 酸效应：在强酸和高温条件下，核酸完全水解，而在稀酸条件下，DNA的核苷键被选择性地断裂生成脱嘌呤核酸 C 碱效应：当PH超出生理范围时（7-8），碱基的互变异构态发生变化 D 化学变性：一些化学物质如尿素，甲酰胺能破坏DNA和RNA二级结构中的 而使核酸变性。 E 粘性：DNA的粘性是由其形态决定的，DNA分子细长，称为高轴比，可被机械力和超声波剪切而粘性下降。 F 浮力密度：1.7g/cm^3,因此可利用高浓度分子质量的盐溶液进行纯化和分析 G 紫外线吸收：核酸中的芳香族碱基在269nm 处有最大光吸收 H 减色性，热变性，复性。 思考题：提取细菌的质粒依据是核酸的哪些性质？ 质粒是抗性基因，，在基因组或者质粒DNA中用碱提取法。 Sectio C 课前提问 1.在1.5mL的离心管中有500μL，取出10 μL稀释至1000 μL后进行检测，测得A260=0.15。 问（1）：试管中的DNA浓度是多少？ 问（2）：如果测得A280=0.078, .A260/A280=？说明什么问题？ (1)稀释前的浓度：0.15/20=0.0075 稀释后的浓度：0.0075/100=0.75ug/ml （2）0.15/0.078=1.92〉1.8，说明DNA中混有RNA样品。 2.解释以下两幅图
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分子生物学试题及答案 一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。 3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。 9．弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列。 10．魔斑：当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。 11．上游启动子元件：是指对启动子的活性起到一种调节作用的DNA序列，-10区的TATA、-35区的TGACA 及增强子，弱化子等。 12．DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。13．SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。 14．单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 15．考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。16．蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。 17．顺式作用元件：在DNA中一段特殊的碱基序列，对基因的表达起到调控作用的基因元件。18．Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’→3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。 3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。 4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（DNA重组技术）三部分。7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，）、 （mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。 9．蛋白质多亚基形式的优点是（亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法）、（可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响）、（活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭）。 10．蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。 11．半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。所以需要一个不依赖于cAMP—CRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMP—CRP的启动子S1对高水平合成进行调节。有G时转录从（ S2）开始，无G时转录从（ S1）开
现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)
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一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA 进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。
二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白
真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C 值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。
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分子生物学 第一章绪论 分子生物学研究内容有哪些方面？ 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、Tm(熔链温度)：DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分 9、DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0.34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。 特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列 11、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成：由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 复制型转座：整个转座子被复制，所移动和转位的仅为原转座子的拷贝。 非复制型转座：原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。 第三章DNA Replication and repair 1、半保留复制：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱
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分子生物学笔记第一章基因的结构 第一节基因和基因组 一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列. 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控 序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene) ，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划( human genome project, HGP ) 基因组学( genomics ),结构基因组学( structural genomics )和功能基因组学( functional genomics )。 蛋白质组( proteome )和蛋白质组学( proteomics ) 第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点：， ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中. ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2 —>% ), 三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因. 可能由某一共同祖先基因(ancestral gene) 经重复(duplication) 和突变产生。 基因家族的特点： ①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如 rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生 有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene) . ￥ a1表示与a1相似的假基因. 四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同． 第四节细菌和病毒基因组 一、细菌基因组的特点。 1 ．功能相关的几个结构基因往往串联在—起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。 3 .细菌DNA大部分为编码序列。 二、病毒基因组的特点 1 .每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA ; 2 .病毒核酸大小差别很大，3X10 3 一3X106bp ; 3.除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。 4 .大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成. 5. 真核病毒基因有内含子，而噬菌体(感染细菌的病毒)基因中无内含子. 6. 有重叠基因. 第五节染色质和染色体 (二)组蛋白(histone): 一类小的带有丰富正电荷<富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力. (二).端粒(telomere) ：真核生物线状染色体分子末端的DNA 区域端粒DNA的特点： 1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb). 人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。
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分子生物学总结完整版 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、 DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、 Tm(熔链温度)： DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、 C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分
9、 DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为 3、4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0、34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列1 1、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成： 由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复
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1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的 激活机制有哪些？ 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白 激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变 3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。 临床特征：生长发育障碍，智力低。呆滞面容，又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力 低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。 核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX（XY）,+21 2.5%患者为嵌合型：46，XX（XY）/47，XX（XY）,+21 5%患者为易位型：46，XX（XY）,-14，+t（14q21q） 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优 势 1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。 2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA ）的检测、基因分型和耐 药基因分析等。 1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析 AP —PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用 DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究 7、F WII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P197，P203，P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了） 答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。
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第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
研究生-分子生物学Ⅱ笔记整理版
分子生物学Ⅱ 专题一细胞通讯与细胞信号转导（一）名词解释 （1）信号分子(signal molecule)：是指在细胞间或细胞内进行信息传递的化学物质。 （2）受体（receptor）：是指细胞中能识别信息分子，并与之特异结合、引起相应生物效应的蛋白质。 （3）蛋白激酶（protein kinase）：是指使蛋白质磷酸化的酶。 （二）简答分析 （1）细胞通讯的方式及每种作用方式的特点。 答： （2）膜受体介导的信息传递途径的基本规律。
答：配体→膜受体→第二信使→效应蛋白→效应。（3）试以肾上腺素、干扰素、胰岛素、心纳素为例，阐述其信息转导过程。 答：①肾上腺素：cAMP-PKA途径； 过程：首先肾上腺素与其受体结合，使G蛋白被激活；然后G蛋白与膜上的腺苷酸环化酶相互作用，后者将ATP转化为cAMP；最后cAMP磷酸化PKA，从而产生一系列生物学效应。 ②胰岛素：受体型TPK途径； 过程：胰岛素与其靶细胞上的受体结合后，可使其受体中的TPK激活，随后通过下游的Ras途径继续传递信号，直至发生相应的生物学效应。 ③干扰素：Jak-STAT途径； 过程：首先干扰素与受体结合导致受体二聚化，然后受体使JAK（细胞内TPK）激活，接着JAK将下游的STAT磷酸化形成二聚体，暴露出入核信号，最后STAT进入核内，调节基因表达，产生生物学效应。 ④心钠素：cGMP-PKG途径； 过程：心钠素与其受体结合，由于该受体属于GC型酶偶联受体，具有鸟苷酸环化酶的的活性，因此结合后可直接将GTP转化为cGMP，进而激活下游的PKG，最终产生一系列的生物学效应。
（4）类固醇激素是如何调控基因表达的？ 答：类固醇激素穿膜后与细胞内（或核内）受体结合，使受体变构形成激素受体活性复合物并进入细胞核中，然后以TF的形式作用于特异的DNA序列，从而调控基因表达。 专题二基因分析的策略 （一）名词解释 （1）分子杂交（molecular hybridization）：是指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）在一定条件下，按碱基互补配对原则经退火处理，形成异质双链的过程。（2）核酸分子杂交技术：是指采用杂交的手段（方式），用一已知序列的DNA或RNA片段（探针）来测检样品中未知核苷酸顺序。 （3）探针（Probe）：是指用来检测某特定核苷酸序列的标记DNA或RNA片段。 （4）增色效应：是指DNA变性时260nm紫外吸收值增加的现象。 （5）解链温度（Tm）：是指加热DNA溶液，使其对260nm 紫外光的吸光度达到其最大值一半时的温度，即50%DNA 分子发生变性的温度。 （6）转基因：是指是借助基因工程将确定的外源基因导入
现代分子生物学总结
第一章、基因的结构与功能实体及基因组 1、基因定义 基因(遗传因子)就是遗传的物质基础,就是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称,携带有遗传信息的DNA序列,就是具有遗传效应的DNA分子片段,就是控制性状的基本遗传单位,通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息,从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复(DNA repairing)就是细胞对DNA受损伤后的一种反应,这种反应可能使DNA结构恢复原样,重新能执行它原来的功能;但有时并非能完全消除DNA的损伤,只就是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来(如细胞的癌变等),但如果细胞不具备这修复功能,就无法对付经常在发生的DNA 损伤事件,就不能生存。对不同的DNA损伤,细胞可以有不同的修复反应。 3、DNA损伤 DNA损伤就是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变,并导致遗传特征改变的现象。情况分为:substitutation (替换)deletion (删除)insertion (插入)exon skipping (外显子跳跃)。DNA损伤的改变类型:a、点突变:指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition);嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。b、缺失:指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入:指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不就是3的整倍数,则发生读框移动(reading frame shift),使其后所译读的氨基酸序列全部混乱,称为移码突变(frame-shift mutaion)。d、倒位或转位:(transposition) 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。e、双链断裂:对单倍体细胞一个双链断裂就就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组,(Homologus Recombination)就是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(Holiday Juncture Structure) 的形成与拆分分为三个阶段,即前联会体阶段、联会体形成与Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除(geneknockout),就是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其它顺序相近基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外,还包括引入新基因及引入定点突变。既可以就是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因,也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)就是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法,因为在该座位有与导人基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换有缺陷的基因片段,达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组就是发生在两条DNA链特异位点上的重组,重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点;attachmentsite,att)与位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组,因而重组具有特异性与高度保守性。 5、碱基错配对修复
分子生物学作业(完整版)
分子生物学作业 第一次 1、Promoter：（启动子）一段位于结构基因5…端上游、能活化RNA聚合酶的DNA序列，是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系转录的特异性与效率。 2、Cis-acting element：（顺式作用元件）影响自身基因表达活性的非编码DNA序列，组成基因转录的调控区包括：启动子、增强子、沉默子等 一、简述基因转录的基本特征。（作业）P35 二、简述蛋白质生物合成的延长过程。P58 肽链的延伸由于核糖体沿mRNA5 ′端向3′端移动，开始了从N端向C端的多肽合成。 起始复合物，延伸AA-tRNA，延伸因子，GTP,Mg 2+，肽基转移酶 每加一个氨基酸完成一个循环，包括: 进位：后续AA-tRNA与核糖体A位点的结合 起始复合物形成以后，第二个AA-tRNA在EF-Tu作用下，结合到核糖体A位上。 通过延伸因子EF-Ts再生GTP,形成EF-Tu?GTP复合物，参与下一轮循环。 需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子。 转位：P位tRNA的AA转给A位的tRNA,生成肽键； 移位：tRNA和mRNA相对核糖体的移动； 核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子，二肽酰－tRNA2进入P位，去氨酰-tRNA 被挤入E位，空出A位给下一个氨酰-tRNA。移位需EF-G并消耗GTP。 三、真核细胞mRNA分子的加工过程有哪些？P40 1、5’端加帽 加帽指在mRNA前体刚转录出来或转录尚未完成时，mRNA前体5’端在鸟苷酸转移酶催化下加G,然后在甲基转移酶的作用下进行甲基化。 帽子的类型 0号帽子(cap1) 1号帽子(cap1) 2号帽子(cap2) 2、3’端的产生和多聚腺苷酸花 除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3?末端都有poly(A)序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40～200个A 。 大部分真核mRNA有poly(A)尾巴，1/3没有。 带有poly(A)的mRNA称为poly(A)+， 不带poly(A)的mRNA称为poly(A)－。 加尾信号： 3?末端转录终止位点上游15～30bp处的一段保守序列AAUAAA。 过程： ①内切酶切开mRNA3?端的特定部位； ②多聚A合成酶催化加poly(A)。 3、RNA的剪接
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分子生物学笔记 第一章基因的结构 第一节基因和基因组 一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列． 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划（human genome project, HGP） 基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。 蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics） 第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点：， ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中． ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)， 三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因．可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经重复(duplication)和突变产生。 基因家族的特点： ①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene)．Ψa1表示与a1相似的假基因． 四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同． 第四节细菌和病毒基因组 一、细菌基因组的特点。 1．功能相关的几个结构基因往往串联在—起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构， 2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。 3．细菌DNA大部分为编码序列。 二、病毒基因组的特点 1．每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA； 2．病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp； 3．除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。 4．大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成． 5．真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子． 6．有重叠基因． 第五节染色质和染色体 (二)组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷<富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力． (二)．端粒(telomere)：真核生物线状染色体分子末端的DNA区域 端粒DNA的特点： 1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb)． 人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。