四种细菌多重PCR快速诊断方法的建立与运用

项目编号

西北农林科技大学

大学生创新创业训练计划项目

创新训练项目申请书

项目级别国家级

项目名称四种细菌多重PCR快速诊断方法的建立与运用项目负责人安俊卿

学院、年级、专业动物医学院、10级、动物医学

联系电话 187********

电子邮件 904345922@https://www.wendangku.net/doc/b817661804.html,

填表日期 2012年3月31日

西北农林科技大学教务处制表

一、基本情况

项目名称四种细菌多重PCR快速诊断方法的建立与运用

项目来源青年学术骨干

负责人安俊卿性别男年龄20 学号2010014812 所在学院动物医学院专业动物医学

联系电话187******** 电子邮箱904345922@https://www.wendangku.net/doc/b817661804.html,

指导教师许信刚性别男年龄38

研究方向预防兽医学职称副教授

联系电话134******** 电子邮箱xuxingangzhangqi@https://www.wendangku.net/doc/b817661804.html,

项目成员

姓名学号学院专业项目分工

安俊卿2010014812 动物医学院动物医学提取细菌DNA，低温培养张晨瑜2010014838 动物医学院动物医学

对多重PCR各反应条件进

行优化

张新2010014845 动物医学院动物医学

取4种细菌的标准株作为阳

性对照，用巴氏杆菌作为阴

性对照

罗小花2010014823 动物医学院动物医学

将测定浓度沙门菌、大肠杆

菌、金黄色葡萄球菌和链球

菌标准株的DNA进行10倍倍

比稀释后混合，进行扩增，

测定多重PCR敏感性

吴科学2010014819 动物医学院动物医学应用优化好的多重PCR方法分别对阳性菌株，人工感染过的水，牛奶，小鼠以及阳性病料进行检测,验证本项目建立的多重PCR方法的可行性

项目

组人

员获

奖及

成果

情况

获奖者奖励、成果名称颁发单位及时间

二、立论依据

1.项目的研究意义（限200字）

目前，由于猪场饲养环境污染严重，细菌血清型众多、疫苗交叉保护能力差，致使副猪嗜血杆菌

病、沙门氏菌病、猪链球菌病、猪多杀性巴氏杆菌病、大肠杆菌病等细菌性疾病发病率升高，难于控制，经济损失严重。沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及链球菌是猪群细菌性疾病的常见病原。我国对致病菌的检验大多沿用细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，周期较长。因此，建立快速敏感特异的检测方法对于猪群细菌性疾病的防治意义重大。

2.国内外研究现状分析并附主要参考文献（限1000字）

目前，国内外对临床标本中病原菌的检验大多采用培养法，即采集标本后，先将其接种于增菌培养液进行增菌，待出现阳性结果后，再分离单个菌落，通过形态学、生理学、生物化学、免疫学等方法最终确诊。传统培养方法尽管较为准确，但都需要将病原菌从病料中分离纯化出来，才能作进一步的鉴定，难以满足临床需求。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ．PCR)技术能弥补微生物学培养和生化方法进行细菌分离鉴定的局限性，是一种新的分子水平细菌分类和鉴定方法，在医学和兽医学临床诊断中有很广阔的前景。多重PCR(Multiplex PCR)技术因具有高效快捷、特异敏感、实验成本低等优点而得到广泛应用。1988年，Chamberlain 等首先使用多重PCR 技术对人的杜氏营养不良症(DMD)进行检测；随后，多重PCR 技术在动物疫病检测方面得到了广泛的应用和发展。国外，QIAGEN 公司研制出适于多重PCR 反应的新型缓冲系统，已经研制出多重PCR 试剂盒，可以直接用于相关基因的检测分析。 国内在运用该技术进行病原鉴定，临床诊断方面也做了一些较有意义的工作。2007年，覃芳芸等设计了3对引物，分别扩增链球菌属特异性gdh 、猪链球菌种特异性16S rRNA 和猪链球菌2型特异性cps2J 等基因。研究结果表明，该方法特异性高、敏感性强，可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。马保臣等（2006）建立的检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR 方法与传统细菌学培养法相比，对金黄色葡萄球菌和酵母真菌具有更高的检出率。沙门氏菌和大肠杆菌0157都是目前世界公认引起食源性疾病的重要致病菌。2008年，杨小鹃等针对沙门氏菌、大肠杆菌建立的多重PCR 方法可简便、快速、灵敏地实现对沙门氏菌和大肠杆菌0157的同时检测，为食源性致病菌的检测提供了理想手段，有良好的应用前景。

3

3

与常规PCR相比，多重PCR不但保持了高度的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测多个基因，减轻了工作量，尤其是在检测病原体的多重感染、流行病学调查、病原体的分型鉴定等方面具有常规PCR无可比拟的优越性。很多单一的PCR已经被组合为多重PCR应用于实践，一些科研单位也已研制出多重PCR的标准诊断试剂盒。随着分子生物学的发展，很多病原体特异性保守基因序列将被获得，多重PCR技术将会有更加广阔的应用前景。

参考文献：

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[3] Cohen N D，Wallis D E，Neibergs H L,et a1．Comparison of the polymerase chain reaction using genus—specific oligonucleotide primers and microbiology culture for the detection of Salmonella in dragswabs from poultry houses [J]．Poult Sci．，1994，73(8)：1276-1281．

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[7] Lee JC，Pier G．The Staphylococci in human disease．Infect Immun，1996，64(1)：659

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[9] 盛凤珍，细菌致病因素及机会致病菌探讨[J] 临床合理用药杂志，2010，3（9）：98

[10] Chamberlain JS, Gibbs RA. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification,Nucleic Acids Res, 1988,16:11141-11156

三、研究方案

1. 研究目标（限200字）

本研究将根据Genbank收录的沙门氏菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和链球菌基因序列，设计各自的特异性引物，建立一种能同时检测四种病原菌的多重PCR方法，初步应用于临床实践,，为快速检测病原微生物提供敏感和特异的技术手段，以期达到对动物疫病快速检测，建立动物产品生产及加工的不同阶段四种人畜共患病原菌的快速监测体系。解决我国检测相关病原菌耗时长，国内试剂供应不配套，难以适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要等问题。

2.研究内容（限400字）

本研究旨在寻求一种适合兽医临床快速诊断以及动物源食品快速检测的方法，以期用于我国的畜禽安全养殖及其产品安全的检测监控。本试验建立的多重PCR方法，在同一反应体系中，可同时检出四种病原菌，若将其研制成试剂盒用于各种检样，将大大提高检测效率，弥补传统方法的不足。

本研究中多重PCR引物的设计是技术关键之一。多重PCR反应体系中存在多对引物和多个模板，相互之间发生作用的几率增加。选择的扩增靶序列和非扩增序列有同源性，引物设计的不合适以及操作过程中靶序列或扩增产物的交叉污染都容易导致假阳性结果。

多重PCR反应条件的优化是技术关键之二。多重PCR影响因素复杂，反应体系中的各个组分会对扩增结果产生综合效应。Henegariu等对多重PCR中的模板、引物、聚合酶、循环条件、Mg2+浓度等各个参数进行了量化研究，提出了一个系统的调整方案。

3.拟解决的关键问题（限200字）

本研究旨在为快速检测主要致病菌提供敏感和特异的技术手段，以期达到对动物细菌性疫病以及动物产品生产及加工的不同阶段建立相应的重要人兽共患病病原的快速检测、监测体系，进而解决我国检测相关细菌性传染病方法耗时较长，且存在国内试剂供应不配套，难以适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要等问题。

4.拟采取的研究方法及技术路线（限800字）

（1）根据GenBank中收录大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和链球菌的全基因序列，利用引物设计软件进行引物设计及相关分析。

（2）将沙门氏菌、大肠杆菌、金葡萄球菌、链球菌纯培养，离心后取沉淀物按照SDS-蛋白酶K法提取细菌DNA，低温保存。

（3）以沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的标准菌株的混合DNA为模板，对多重PCR各反应条件进行优化。

（4）分别取4种细菌的标准株作为阳性对照，用巴氏杆菌作为阴性对照。根据本研究项目设计的4对引物，分别对标准阳性菌株和阴性对照菌株进行扩增试验，检测3对引物的特异性。

（5）将测定浓度沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌标准株的DNA进行10倍倍比稀释后混合，进行扩增，测定多重PCR敏感性。

（6）不同人用不同公司的试剂多次重复操作，以检测提取模板DNA的方法和反应体系、条件的重复性及稳定性。

（7）应用优化好的多重PCR方法分别对阳性菌株，人工感染过的水，牛奶，小鼠以及阳性病料进行检测验证本项目建立的多重PCR方法的可行性。

技术路线

大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌、链球菌引物设计标准菌株的制备

细菌基因组DNA提取及单一细菌PCR检测方法的建立

目的基因的克隆测序

检测大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌、链球菌多重PCR方法的建立及反应条件的优化

多重PCR反应特异性、敏感性及重复性试验

多重PCR检测方法临床初步应用

5．实验方案（限500字）

5.1根据GenBank中收录的大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和链球菌的全基因序列及部分截短基因序列，分析其同源性，选择细菌的保守区域作为细菌PCR扩增的靶序列，利用引物设计软件进行多重引物设计及相关分析。

5.2通过摸索多重PCR反应体系和程序，建立检测同时检测大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和链球菌的多重PCR方法。

5.3通过人工模拟感染试验及临床病料的检测来验证多重PCR的实用性和可行性。

6．具备的知识基础（限150字）

本研究小组进行了大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和链球菌细菌病的研究，分离得到了大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和链球菌的菌种，并对这些细菌分离株的主要抗原基因进行了克隆、测序等方面的研究工作。本小组成员已熟练掌握了与本项目有关的实验技术原理与方法，为本项目的顺利完成奠定了良好的基础。

7.设备条件（限150字）

本项目全部工作落实于西北农林科技大学动物医学院预防兽医学中心实验室，主要实验条件齐备。具有无菌操作间、灭菌设备、低温冰箱、超低温冰箱（－80℃）、纯水系统、高速冷冻离心机、超声波破碎仪、PCR仪、电泳系统、Syngene全自动凝胶成像系统、电子天平等。西北农林科技大学动物医学院P3实验室能够满足对病原微生物操作要求。

8.本项目的创新之处（限200字）

首次建立沙门氏菌等四种细菌的多重PCR快速检测方法，解决传统细菌检测方法特异性差、敏感度低、耗时长且不能检测细菌混合感染的问题。

该检测方法操作简便、稳定、准确、高效、经济，在日常检测工作中值得推广应用。

该方法建立后可组装试剂盒，易于产业化生产和大规模应用，而且技术上达到国际先进水平，从而有力地促进畜牧业的健康发展，具有重要的意义。

9. 项目研究年度计划

2 0 1 2 年

（1）沙门氏菌等四种细菌能保守性基因的选择,使用NCBI的Blast软件对各基因进行同源性、特异性分析。

（2）使用Primer 5.0设计多重PCR引物，并对引物进行分析。对设计好的引物使用Primer Blast 软件进行在线分析。

（3）细菌核酸的提取及单一细菌PCR检测方法的建立。单一细菌PCR条件的优化、含目的基因的阳性质粒的构建。

2 0 1

3 年

（1）多重PCR反应的条件的摸索，多重PCR条件的优化及灵敏性、特异性、重复性试验。

（2）单一细菌PCR方法与多重PCR方法检测临床样品，比较其灵敏性。目的片段回收测序。细菌进化树的绘制。

（3）从阳性病料中做细菌分离鉴定。

（4）收集、整理实验数据，发表研究论文，完成结题报告。

10.项目成果

(1)获得特异性检测四种细菌的多重PCR引物

(2)建立能够检测沙门氏菌等四种细菌的多重PCR方法

(3)将该方法初步用于临床病料的检测

(4)在国内外刊物发表3篇以上研究论文

四、经费预算

支出科目金额（元）计算根据及理由合计20000

1.科研业务费3000

会议资料费3000 复印、打印、发表论文费用

2.实验材料费16000

各种工具酶及试剂盒费5000 购买DNA聚合酶，基因提取试剂盒等样品的测序、测试费3000 细菌目的基因的测序

试验耗材费用5000 玻璃器皿、离心管、吸头、试管等

实验动物3000 购买Balb/c小鼠

3．其他支出1000

病料收集费用1000 用于病料的采集及差旅费

六、审批情况：

指导教师对项目的评价及承诺：

多重PCR检测是病原实验室诊断研究的一个崭新的方向，其作为细菌及病毒特异性检测的研发平台，是国内外研究的热点，实验者选择这个课题有很强的理论意义和应用价值。本试验设计合理，技术路线可行，可以达到预期的目标，建议优先资助。

签字：

年月日学院推荐意见：

分管领导签字：（公章）

年月日学校评审组意见：

建议项目经费：元组长签字：

年月日教务处意见：

批准项目经费：元负责人签字：（公章）

年月日