噬菌体的检查与效价鉴定

噬菌体的检查与效价鉴定

1 目的

1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。

1.2 学会检查噬菌体的方法。

1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。

2 原理

噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒,其个体形态极其微小,用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解,释放出大量子代噬菌体,然后它们再扩散和侵染周围细胞,最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清,或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性,快速检查、分离,并进行效价测定,对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。

检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等(至于无法采样而需检查的对象,可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品)。为了易于分离可先经增殖培养,使样品中的噬菌体数量增加。

采用生物测定法进行噬菌体检查,约需12h左右,因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染,以采取必要的防治措施。根据正常发酵(培养)液离心后菌体沉淀,上清液蛋白含量很少,加热后仍然清亮;而侵染有噬菌体的发酵(培养)液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白,加热后发生蛋白质变性,因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速,对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断,对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。

噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上,一般一个噬菌体产生一个噬菌斑,故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数,计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致,且清晰度高,故计数比较准确,因而被广泛应用。

3 材料

3.1菌种

敏感指示菌(大肠杆菌)、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。

3.2培养基

二倍肉膏蛋白胨培养液,上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基(含琼脂0.7%,试管分装,每管5mL),下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基(含琼脂2%),1%蛋白胨水培养基。

3.3仪器和器具

无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管(1、5mL),恒温水浴锅,离心机、721分光光度计等。

4 流程

4.1噬菌体的检查

4.2噬菌体效价的测定

5 方法

5.1 噬菌体的检查

5.1.1 样品采集

将2~3g土样或5mL水样(如阴沟污水)放入灭菌三角瓶中,加入对数生长期的敏感指示菌(大肠杆菌)菌液3~5mL,再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。

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