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根癌土壤杆菌产辅酶Q10 的补料分批发酵工艺

2011年2月 The Chinese Journal of Process Engineering Feb. 2011

收稿日期：2010?10?08，修回日期：2010?12?10

基金项目：国家高技术研究发展计划(863)重点基金资助项目(编号：2007AA100402)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(编号：JUSRP31004)；

江苏省高校“青蓝工程”科技创新团队基金资助项目

作者简介：金赛(1986?)，男，湖北省黄冈市浠水县人，硕士研究生，生物化工专业；石贵阳，通讯联系人，Tel: 0510-********, E-mail: gyshi@https://www.wendangku.net/doc/c5743987.html,.

根癌土壤杆菌产辅酶Q 10的补料分批发酵工艺

金赛，徐俭，张梁，丁重阳，石贵阳

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心，江苏无锡 214122)

摘要：以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens Q14)为生产菌株，在15 L 发酵罐内对补料分批发酵生产辅酶Q 10的工艺进行优化. 通过逐步添加限制性营养物质，考察其对发酵的影响，获得了较优的补料分批发酵工艺，即流加葡萄糖和KH 2PO 4溶液，将葡萄糖和磷浓度分别控制在5～15 g/L 和50～120 mmol/L ，同时，在30和50 h 各加入5%(?)新鲜发酵培养基. 在此工艺条件下，发酵周期为84 h ，菌体量达87.2 g/L ，辅酶Q 10产量高达2166.2 mg/L ，生产强度为25.8 mg/(L ?h)，比分批发酵提高了7.8倍.

关键词：根癌土壤杆菌；辅酶Q 10；补料分批发酵

中图分类号：TQ929 文献标识码：A 文章编号：1009?606X(2011)01?0113?04

1 前言

辅酶Q 10(Coenzyme Q 10, CoQ 10)，又名泛醌(Ubiquinone)，是一种脂溶性醌类化合物，广泛存在于动物、植物及微生物体内，是生物细胞呼吸链中的重要递氢体[1]，具有多种生理活性[2,3]. 微生物发酵法生产辅酶Q 10被认为是最具发展潜力的生产方法[4,5]，但菌种和发酵工艺是制约其发展的2个关键因素.

本研究室在前期研究中已对一株产辅酶Q 10的根癌土壤杆菌(A . tumefaciens )进行紫外和离子束诱变，获得了1株高产突变株Q14，摇瓶发酵产量最高可达105.8 mg/L [6]. 前期研究[7]显示，在根癌土壤杆菌内辅酶Q 10的形成与菌体生长相偶联，通过补料分批发酵增加菌体量是提高辅酶Q 10产量的重要途径. Ha 等[4]以A . tumefaciens KCCM 10413为生产菌株，采用pH-stat 控制策略流加蔗糖，辅酶Q 10产量达626.5 mg/L ，比分批发酵提高了99.4%. 肖海蓉等[8]以酵母菌HY-05为生产菌株，将蔗糖和玉米浆组合流加，结合溶氧的控制，辅酶Q 10积累量最大为156.2 mg/L ，

比不补料提高了58.1%. 由此可见，在补料分批发酵中，一些限制性营养物质的添加对菌体生长和产物合成能起到显著的促进作用.

目前辅酶Q 10的补料分批发酵主要通过流加碳源和氮源来提高产量. 本工作拟研究确定多种限制性营养物质，以期获得一种高产量的补料分批发酵工艺.

2 实验

2.1 实验材料 2.1.1 菌种

根癌土壤杆菌(A . tumefaciens )，编号Q14，由江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心保存. 2.1.2 试剂

辅酶Q 10标准品购于Sigma 公司，葡萄糖购于山东西王生化科技有限公司，纯度90%以上，玉米浆购于吉林大成集团有限公司，其他化学试剂均为分析纯以上级别，购于国药集团化学试剂有限公司. 2.1.3 培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖 3，酵母膏 5, (NH 4)2SO 4 3, KH 2PO 4 0.6, K 2HPO 4 0.4, NaCl 2. 用NaOH 调节pH 到7.2.

发酵培养基(g/L)：葡萄糖 20，玉米浆 10, (NH 4)2SO 4 4, KH 2PO 4 2, MgSO 4?7H 2O 3, NaCl 2. 用NaOH 调节pH 到7.2. 2.2 实验设备

15 L 全自动搅拌式发酵罐(FJS15，浙江新昌德力石化设备有限公司)，pH 电极和溶氧电极(瑞士梅特勒公司)，721分光光度计(上海第三分析仪器厂)，SBA-40C 生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)，DIONEX P680高效液相色谱仪(美国戴安公司)，KR100-5C18色谱柱(瑞典AKZO NOBEL 公司). 2.3 实验方法 2.3.1 培养方法

一级种子培养：菌种斜面于30℃培养箱中培养，接一环生长良好的菌体至装有50 mL 种子培养基的250 mL 三角瓶中，30℃下200 r/min 振荡培养24 h.

二级种子培养：在装有100 mL 种子培养基的500

mL 三角瓶中，按5%(?)的接种量接入一级种子液，在30℃下200 r/min 振荡培养24 h.

15 L 发酵罐培养条件：初始装液量8 L ，接种量5%(?)，培养温度30℃，溶解氧(DO)浓度通过调整通气量和搅拌转速控制在25%，通过蠕动泵自动补加1 mol/L 硫酸或30%浓氨水将pH 控制在7.0～7.2. 2.3.2 分析方法

菌体干重(Dry Cell Weight, DCW)的测定：发酵液经8000 r/min 离心10 min ，去上清后用蒸馏水洗涤2次，放入110℃烘箱烘干，待菌体恒重后称重. 葡萄糖的测定采用SBA-40C 生物传感分析仪，磷浓度的测定采用磷钼蓝分光光度法[9]. 辅酶Q 10的测定采用高效液相色谱法，色谱条件：检测波长275 nm ，KR100-5C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm)，流动相甲醇:无水乙醇(?)=1:1，流速1 mL/min ，柱温34℃，进样量20 μL.

3 结果与讨论

3.1 分批发酵

图1是Q14分批发酵的结果，如图所示，辅酶Q 10

的合成与菌体生长是偶联关系，且DCW 和辅酶Q 10产量最高可达11.5 g/L 和132.6 mg/L ，相应的细胞内辅酶Q 10含量为11.5 mg/g ，生产强度为3.0 mg/(L ?h). 从图1可知，经过6 h 延滞期后，菌体生长进入对数期，葡萄糖被快速消耗，到40 h 后葡萄糖被耗尽，菌体也随即停止生长，说明葡萄糖是菌体生长的限制性底物. 3.2 流加葡萄糖对辅酶Q 10发酵的影响

前期研究结果[6]表明，

当葡萄糖浓度大于20 g/L 时对菌体生长具有抑制作用，而5～15 g/L 的低浓度葡萄糖有利于菌体的生长. 本研究采用恒残糖反馈流加的方式将糖浓度控制在10 g/L. 恒残糖反馈流加是根据上一时间段的耗糖速率预测下一时刻的耗糖速率，从而将葡萄糖流速调至适当值，保持糖浓度的恒定[10]. 葡萄糖流

图1 A. tumefaciens Q14的分批发酵结果 Fig.1 Batch fermentation of A. tumefaciens Q14

加速率通过下式预测：

V 1C S1+v p (t 1?t 2)C SP =V 2C S2+x [e μ(t 2?t 1)?1]/Y x/s ,

式中，V 1, V 2为发酵液体积(mL), C S1, C S2为发酵液中糖浓度(g/L), t 1, t 2为发酵时间(min), C SP 为流加葡萄糖浓度(g/L), x 为菌体浓度(g/L), μ为比生长速率(h ?1), Y x/s 为菌体得率系数，v p 为葡萄糖流加速率(mL/min). 用某时段实测的C S1, C S2和x 计算得到糖的消耗速率，从而得到下一时段的v p .

图2(a)是葡萄糖流加速率变化曲线，如图所示，葡萄糖以阶梯式进行流加，发酵前期接近于指数流加，后期呈阶梯式下降，浓度在5～15 g/L 范围内波动. 图2(b)是流加葡萄糖的补料分批发酵结果，如图所示，补充碳源和氮源(流加氨水控制pH)延长了菌体的生长时间，60 h 后DCW 达29.8 g/L ，此时辅酶Q 10产量达418.4 mg/L ，细胞内辅酶Q 10含量为14.0 mg/g ，生产强度为7.0 mg/(L ?h). 发酵50 h 后，菌体生长逐渐缓慢，但此时单位细胞耗糖速率仍然较高，说明可能存在其他限制因子. 3.3 补加培养基对辅酶Q 10发酵的影响

在以上实验基础上补加新鲜发酵培养基(不含糖)，

图2 流加葡萄糖的补料分批发酵

Fig.2 Fed-batch fermentation with glucose feeding

24681012

14160

3040

020406080

100120140

C o Q 10 (m g /L )

Time (h)

G l u c o s e (g /L ), D r y c e l l w e i g h t (g /L )

4050

0.0

0.20.40.60.81.0

(a)

G l u c o s e f e e d i n g r a t e (m L /m i n )

Time (h)

100200

300400C o Q 10 (m g /L )

Time (h)

G l u c o s e (g /L ), D r y c e l l w e i g h t (g /L )

第1期金赛等：根癌土壤杆菌产辅酶Q 10的补料分批发酵工艺 115

考察其对发酵的影响，同时，为进一步考察培养基中单一成分对发酵的影响，对发酵过程中单一成分含量进行检测. 在发酵对数中期补加蔗糖和玉米浆有助于菌体的生长和辅酶Q 10的合成[8]. 因此，本实验将1000 mL(发酵液体积的10%)新鲜培养基分别在30 h(对数中期)和50 h 各加入500 mL ，葡萄糖流加方式同3.2节.

图3是间歇补加培养基的发酵结果，细胞干重最大为38.1 g/L ，辅酶Q 10最高产量达803.6 mg/L ，相应的细胞含量为21.1 mg/g ，生产强度为11.5 mg/(L ?h). 与只流加葡萄糖的补料分批发酵结果相比，菌体生长时间延长，且细胞干重、辅酶Q 10产量和单位细胞产量都有明显提高. 发酵后期磷含量几乎为0，菌体生长也随之停止，说明磷含量可能是菌体进一步生长的限制性因素. 3.4 流加KH 2PO 4对辅酶Q 10发酵的影响

前期实验结果[6]表明，菌体生长和产物合成的最适磷浓度为80 mmoL/L. 考虑到实际控制中磷浓度的波动，本实验通过流加20% KH 2PO 4溶液将磷浓度控制在50～120 mmol/L 之间，KH 2PO 4的流加采用与葡萄糖相同的方式，葡萄糖和培养基的补加同3.3节.

图3 流加葡萄糖同时补加培养基的补料分批发酵

Fig.3 Fed-batch fermentation with glucose feeding and

production medium supplementation

图4(a)是K 2HPO 4流加速率变化曲线，实际控制中磷浓度会产生波动. 通过流加K 2HPO 4溶液，菌体浓度和辅酶Q 10产量显著增加.

图4(b)显示，细胞干重达87.2 g/L ，增加了129%，辅酶Q 10产量达2166.2 mg/L ，细胞含量为25.3 mg/g ，生产强度为25.8 mg/(L ?h).

图4 流加葡萄糖和K 2HPO 4同时补加培养基的补料分批发酵

Fig.4 Fed-batch fermentation with glucose and KH 2PO 4 feeding and production medium supplementation

表1 四种发酵方式的比较

Table 1 Comparison of CoQ 10 production among four kinds of fermentation

Fermentation process

DCW (g/L) CoQ 10 production (mg/L)

CoQ 10 content (mg/g)

CoQ 10 productivity [mg/(L ?h)]

Batch fermentation

11.5 132.6

11.5

3.0

Fed-batch fermentation with glucose feeding 29.8

418.4

14.0

7.0

Fed-batch fermentation with glucose feeding and production medium supplementation

38.1 803.6 21.1 11.5 Fed-batch fermentation with glucose and KH 2PO 4 feeding and production medium supplementation

87.2 2166.2

25.3

25.8

3.5 实验结果的比较

表1是上述优化过程中4种发酵方式的比较，通过补加菌体生长的限制性营养物质，菌体生长时间逐渐延长，细胞干重、辅酶Q 10产量和生产强度也逐渐提高，

最终获得了较好的结果.

国内外对辅酶Q 10的补料分批发酵多数只关注碳源或氮源的流加，如表2所示. 可见仅考虑碳源或氮源对提高产量是有限的. 本研究获得的同时添加几种关键性

10203040

1224

3648607284

200400600800

C o Q 10 (m g /L ), P h o s p h o r u s (m m o l /L )

Time (h)

G l u c o s e (g /L ), D r y c e l l w e i g h t (g /L )

100

0.00.10.2

0.3K H 2P O 4 f e e d i n g r a t e (m L /m i n )

Time (h)

(a)

500100015002000050

100150200

100

406080

G l u c o s e (g /L ), D r y c e l l w e i g h t (g /L )

Time (h)

C o Q 10 (m g /L )

K 2H P O 4 (m m o l /L )

116 过程工程学报第11卷

营养物质的发酵工艺不仅为菌体生长提供了充足的碳源和氮源，还提供了菌体繁殖和产物合成中需要的磷

源，从而取得了较高的辅酶Q 10产量和生产强度，同表2比较具有明显优势.

表2 国内外发酵水平的比较

Table 2 Production of coenzyme Q 10 by various microorganisms

Strain CoQ 10 conc. (mg/L) Specific CoQ 10 content (mg/g) CoQ 10 productivity [mg/(L ?h)] Working volume (L)Ref.

Rhodobacter sphaeroides 350 8.70 6.03 5

Agrobacterium sp . 180 1.96 3.10 5 [11]

Sporobolom ycesroseus 188.6 5.24 0.25 [12] Yeast HY-05 156.2 3.12 5 [8] 458 8.54 4.77 5

562.3 9.10 5.86 5

Agrobacterium tumefaciens KCCM 10413 763.7 11.84 7.96 5

[13～15]

4 结论

(1)除碳源和氮源外，磷源也是根癌土壤杆菌(A. tumefaciens )发酵产辅酶Q 10的限制因子.

(2)将葡萄糖和磷浓度分别控制在5～15 g/L 和50～120 mmol/L 范围内，同时在30和50 h 分别加入5%(?)新鲜发酵培养基(不含糖)，发酵周期为84 h ，菌体量达87.2 g/L ，辅酶Q 10产量高达2166.2 mg/L ，发酵强度达25.8 mg/(L ?h)，比分批发酵提高了7.8倍.

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Production of Coenzyme Q 10 in Fed-batch Fermentation by Agrobacterium tumefaciens

JIN Sai, XU Jian, ZHANG Liang, DING Zhong-yang, SHI Gui-yang

(Key Laboratory of Industrial Biotechnlogy, Ministry of Education, Research Center of Bioresource and Bioenergy,

School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China )

Abstract: The production of coenzyme Q 10 by Agrobacterium tumefaciens Q14 was studied under fed-batch fermentation by adding restrictive nutrient substances in a 15 L fermentor. The best process of fed-batch fermentation was obtained by stepwise optimization in order to maintain glucose concentration between 5 and 15 g/L and phosphorus concentration between 50 and 120 mmol/L. 5%(?) fresh medium was added at 30 and 50 h, respectively, to satisfy the growth of cells. The results showed that the fermentation period was 84 h, a highest biomass of 87.2 g/L, coenzyme Q 10 production of 2166.2 mg/L and productivity 25.9 mg/(L ?h) which increased 7.8 times compared with batch fermentation.

Key words : Agrobacterium tumefaciens ; coenzyme Q 10; fed-batch fermentation