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从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组II分离物

从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组II分离物
从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组II分离物

!云南省科委重点基金(!"#$$%&)、浙江省自然科学基金委青年科技人才培养专项资金(’#!($)*)及教育部跨世纪人才基金资助项目

本文报道的基因序列在+,-.中的登录号为/0121"%"作者简介:李

凡()!($3)

,男,云南凤庆人,云南农业大学讲师,博士,主要从事植物病毒病害研究从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组&&分离物!

李凡),

1周雪平)戚益军)陈海如1李德葆)()浙江大学生物技术研究所

杭州*)$$1!

)(1云南农业大学云南省植物病理重点实验室

昆明5"$1$)

)摘

要:在对云南省烟草病毒病的研究中,分离到一种直径约15!*$67的球形病毒。提纯

病毒进行的8984:/;+发现一条""<9蛋白带。""<9蛋白=4端)$个氨基酸与#,>亚组&&的?株系外壳蛋白=4端氨基酸同源性为)$$@。以#,>4?抗血清对""<9蛋白进行了A B C D B E 6F G H D 检测,发现""<9蛋白与#,>?株系抗血清有血清学反应。根据已报道的

#,>亚组&&外壳蛋白基因序列合成引物,采用’I 4:#’技术扩增到一条约$J !亚组&&分离物有极高的同源性,分别达!(@!!%@和!5@!!!@,而与亚组&分离物的同源性仅为("@!(5@和(%@!(!@。因此,

该球形病毒应为#,>亚组&&的一个分离物,命名为#,>4N =F 。关键词:球形病毒,黄瓜花叶病毒,亚组"中图分类号:82*1J 2

文献标识码:/

文章编号:$$$)351$!(1$$$)$23$*253")

病毒是引起烟草严重病害的一类病原,在云南各烟区都有病毒病的发生,而且常常是

多种病毒的复合感染或病毒与其它病原的复合感染。孔宝华等[)]多年对云南省主要烟

区病毒病的调查研究结果表明,该省烟草病毒以I ,>、#,>为主要种类,而且多数病株均为I ,>和#,>混合感染,二者复合感染率达2*@,I ,>单独感染率为1)@,#,>单独感染率约为*J "@。我们在对云南西部烟区保山烟草病毒病的研究中,发现感病烟株病毒提纯产物经1@:I /负染后为大量杆状的I ,>,而经)@O /K 负染后还发现了少量直径约15!*$67的球形病毒(命名为#,>4N =F )。提纯病毒进行的8984:/;+,发现除I ,>的)(J "<9外壳蛋白外,还同时含有一条约""<9的蛋白。

!材料和方法

!"!毒源

感病烟株采自云南省保山市板桥镇烟田,病株于无虫温室无菌土栽培保存。!"#质粒和受体菌

M ;+,4I+L C P >B K D H E 为:E H 7B Q

L 公司产品,大肠杆菌0,)$!为本所保存。2$卷2期1$$$年%月

微生物学报

!"#$%&"’()&(*(+

&"$,&-&"$>H G R 2$=H R 2

/S Q

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"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""S C D 1$$$

!"#酶、

试剂盒及其它化学试剂!"#、!$%&%’(%&!)*+&*$,’(%&-!./+&*0+试剂盒、1,23*$+4(#25%6(%,*!

678-./,9&:*+2+./+&*0试剂盒为!$%0*;4公司产品,<=->?26@A *(B C &$46&2%,试剂盒和<=-D $*D

.D 2,E 2,2D $*D 试剂盒为<=-A B 8公司产品,F #=G %(!试剂为A =’"H /’#I 公司产品。!"$%%&’蛋白()端氨基酸序列测定及*+,-+./012-检测提纯病毒的.7.9!-A B 及蛋白转膜按李德葆等[J ]

方法进行,最后从!K 7L 膜上剪下M M @7蛋白,分别送北京大学和日本N %@%:404大学进行测序。进行)*+&*$,5(%&检测转

膜时以硝酸纤维素滤膜取代!K 7L 膜。)*+&*$,5(%&检测采用!$%&%’(%&!)*+&*$,’(%&

-!./+&*0+试剂盒并按公司提供的产品使用说明书进行。"E K 9<多抗血清由澳大利亚-O *(42O *大学P Q )Q #4,O (*+教授惠赠。!"%%%&’蛋白的变性试验

M M @7蛋白.7.9!-A B 前进行如下变性处理:处理R :J S .7.,T M U R V V W 加热M 02,;处理J :J S .7.,T M U R V V W 加热R V 02,;处理X :J S .7.,V Q R S 巯基乙醇,T M U R V V W 加热R V 02,;处理Y :Y S .7.,V Q R S 巯基乙醇,T M U R V V W 加热R V 02,;处理M :Y S .7.,V Q J S 巯基乙醇,T M U R V V W 加热R V 02,。!"3456亚组77分离物48基因的克隆及序列测定

根据M M @7蛋白8端氨基酸测序结果和)*+&*$,5(%&检测结果,结合已报道的"E K

亚组==("E K<株系)"!基因及其部分M ’端基因间隔区序列[X ],设计合成了一对用于扩增"E K<株系"!基因的引物<"Z /<"$(上海.4,;

%,公司合成),引物序列如下:M ’端引物<"Z 为:M ’U-A -A F """A F A F A -A F F A F --U X

’;X ’端引物<"$为:M ’UF F --"A F "F F "A A -"A ""A A F U X

’。病毒总#8-采用F #=[H I

!试剂从病毒提纯产物提取,具体方法参照戚益军等[Y ]。取病毒#8-R !;与V Q M !;X ’端引物<"$充分混匀,\V W 保温R V 02,后,采用1,23*$+4(#295%6(%,*678-./,&:*+2+./+&*0试剂盒合成678-第一链。取R !

I 第一链678-,用!*$@2,9B (0*$A *,*-0D !"#./+&*0T ]V V 进行!"#扩增。扩增条件为:T Y W 变性R 02,,]M W 退火R 02,,\J W 延伸R 02,,共X M 个循环。最后一轮循环后再\J W 延伸R V 02,。!"#

产物经R Q M S 琼脂糖凝胶分析后,割取预期的V Q T @5左右78-条带,用<=->

?26@A *(B C 9&$46&2%,试剂盒纯化。纯化后的78-片断采用D A B E 9FB 4+/K *6&%$./+&*0试剂盒进行连接,连接产物转化大肠杆菌P E R V T 。在含氨苄青霉素的麦康凯平板上挑取白色菌落。抽提质粒78-,!"#及酶切筛选出具有V Q T @5左右插入片段的重组子。选取两个重组子D <"M 和D <"]用<=-D $*D .D 2,E 2,2D $*D 试剂盒提取质粒7

8-,然后采用!B 公司的-’=!#=.EX \\78-自动测序仪进行序列测定。

9结果和分析

9"!%%&’蛋白()端氨基酸序列及其*+,-+./012-检测

M M @7蛋白分别经北京大学和日本N %@%:404大学进行了8端氨基酸序列测定,两次均测了十个氨基酸,结果完全一致,此M M @7蛋白的8端十个氨基酸序列为:E 7^.A .!9\

Y X Y 期

凡等:从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组==分离物

氨基酸同源性为!""#。为了进一步确证$$%&蛋白与’()*株系的关系,以’()+*抗血清对$$%&蛋白进行了,-./-01234/检测,结果发现$$%&蛋白与’()*株系抗血清有血清学反应(图!)

"*

,而

)由

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P3=313-Q/B

’/01234,52K=,83;0,5

J292<2802

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@ E !

E期李凡等:从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组??分离物

[!]"#$%&’(#)*,)(+

,%-.,)/0#,10&$234!"#",5667,!"!(8):869!86:4[;]<=%>0$0?,@%0&#%+2,A (#’0/B %’C ,"$%&’(!"#)*+,&,56;6,#$(7):5D E 7!5D !94[6]F 0/0#G H @,I 1(/%J ,)0/0K ’L ,"$%&’)*+-./".,566:,%!(9):9!6!9;:4[5D ]徐平东,周仲驹,林奇英,等M 病毒学报,5666,!&(8):5E :!5!5M [55]F 1H #N 0G =.4(’!"#)*+,&,5665,#’(5D ):87;!!87;64

[58]O P %#*,F 1H #N 0G =.,"%’,1/%>0#-,"$%&’(!"#)*+,&,566D ,#!(5D ):88:9!88:64

[59]?0+G 0P 0I ,.H K =G 0>H.,Q 0G 0R H >0.,"$%&’(!"#)*+,&,56;6,#$(8)::66!7D :4[5:].=&S 1+T",T 0=U =%N 2.,)H ’1(S C?3,"$%&’J H &=’I 0V (#(>+4F S &H #W X B %&/0W P

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79:期

凡等:从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组a a 分离物

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