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中药喘可治对小鼠T淋巴细胞活化的双向调节作用机理研究

中药喘可治对小鼠T淋巴细胞活化的双向调节作用机理研究
中药喘可治对小鼠T淋巴细胞活化的双向调节作用机理研究

淋巴细胞的分离方法

1、淋巴细胞的来源: 人淋巴细胞的方便来源是外周血 分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。 根据不同试验有相对纯度,无论采用哪种方法,应尽最大可能保持细胞应有活性。 分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计,根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 2、密度梯度离心法: 外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.075~1.092之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 3、实验方法: 1.采血,稀释(外周血:稀释液=1:2) 2.在离心管中加入Ficoll,沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血(Ficoll:稀释血=1:2) 3、20℃,1500r/min,离心30min 从上一次至下 稀释的血浆、血小板 PBMC Ficoll 红细胞、粒细胞 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。 5.加足量稀释液充分洗涤,1800 r/min离心10min ,弃上清。 6.重复洗涤一次,1400r/min离心10min,弃上清。 7.适量的培养基重悬细胞,计数。

分离单个核细胞纯度为95% 淋巴细胞约占90%~95% 4、淋巴细胞高纯度化 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2~3次,常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下,若外周血中血小板数量异常增多,可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 (三)单核细胞和粒细胞的去除 1.粘附去除法 原理:单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点:简便易行,对细胞损伤极少。 缺点:B细胞也有较弱的粘附能力,因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后,大约95%的单个核细胞为淋巴细胞,活性大于95%。 2.羰基铁粉吞噬法 原理:单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力,吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一:经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后,则单核细胞沉积于管底而被去除。 方法二:用磁铁将细胞吸至管底,上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3.苯丙氨酸甲酯去除法 原理:苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质,能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸,导致溶酶体内因渗透压改变而破裂,释放出的酶类物质可引起细胞溶解。 用该法可溶解含溶酶体的细胞,如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等,B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶,因而不受影响。 该法去除单核细胞后,约99%的单个核细胞为淋巴细胞,活性大于95%。

小鼠免疫细胞

免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取 一、实验目的 1、明确各免疫器官分布与形态结构,能熟练找到各免疫器官,弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。 2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法,熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。 二、实验原理 脾脏是外周免疫器官之一,是人体最大的淋巴器官。它生在腹腔左上方,质地比较脆,容易外伤。一般来讲,脾脏有三大功能: 首先它是人体的“血库”,当人体休息、安静时,它贮存血液,当处于运动、失血、缺氧等应激状态时,它又将血液排送到血循环中,以增加血容量; 其次,脾脏犹如一台“过滤器”,当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时,脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉; 此外,脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质,发挥免疫作用。脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞,特别是红细胞和血小板。因此,脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。脾脏还有产生淋巴细胞的功能。 我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。 小鼠淋巴细胞的比重为1.088,利用比重为1.088的淋巴细胞分离液,将脾细胞悬液置于分离液上层,通过梯度离心的方法,在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。 三、实验器材 KM种小鼠,PBS缓冲液,淋巴细胞分离液,200目不锈钢网,解剖器械 四、实验步骤 1、杀死老鼠,取出小鼠的脾脏,在pbs缓冲液中冲洗干净。 2、将小鼠脾脏至于200目铜网中,铜网绑定在烧杯上面,剪碎、碾磨,边碾磨边加PBS 冲洗,制得脾细胞悬液。 3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中,1000r/min 5min离心洗涤,倒掉上清,加入5mlPBS再离心洗涤一次。 4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮,缓慢加入淋巴细胞分离液上层,细胞悬液与分离液体体积比为1:1。 5、2000r/min离心30min。 6、小心吸取中间层细胞,1000r/min 5min离心洗涤两次。 7、将制得的淋巴细胞滴于玻片,镜检。

小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书

小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用,试剂内容如下: 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液(赠品)清洗液(赠品)2010C11192010X1118F2013TBD F 液(赠品)说明书 【实验前准备】A .适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B .耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液,制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管,加入与组织单细胞悬液等量的分离液(注:分离液最少不得少于 3ml )。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上,400-500g ,离心20-30min 。(注: 根据组织单细胞悬液量确定离心条件,组织单细胞悬液量越大,离心力越大,离心时间越长,具体离心条件需客户自行摸索,以达到最佳分离效果)。

4.离心后,此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中,向离心管中加入 10ml清洗液(产品编号:2010X1118),混匀细胞。 6.250g,离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液(产品编号:2010X1118)重悬所得细胞。 9.250g,离心10min。 10.重复7、8、9,弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果,最 好在取样2h内进行实验,样品存放时间越长,细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质(如聚苯乙烯)的塑料制品,应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品,因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面,影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时,分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低,请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存,有效期2年。本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启封后置常温保存。如4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。 【参考值(参考范围)】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例,用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 (4.0-10.0)×109 含量(个/L)(4.0-5.5)×1012(1.0-3.0)×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞

小鼠淋巴细胞分离方法

小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备: 1.采血用品:10ml注射器10个;手套20付;15ml离心管10个;20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把;加样器;70%酒精;5%碘酒; 2.取脾用品:10ml注射器10个;手术器械10套;手套20付,60mm玻璃培养皿10个; 200 目尼龙网,裁成100mm×100mm正方形10块;10mL 玻璃注射器内活塞10个; 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基;鼠淋巴细胞分离液;摄子、剪刀各10 把;70%酒精;5%碘酒;移液器、离心机;刀剪浸泡液(新洁尔灭); 注:红色必须灭菌;蓝色可以不灭菌;绿色需特殊处理;黑色不用灭菌。 二、相关实验: (一)实验名称:分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的:获得小鼠脾脏淋巴细胞,为ELISPOT实验做准备。 实验动物:BABALB/c小鼠;雌性 实验材料: 1.小鼠淋巴细胞分离液, 2.60mm玻璃培养皿 3.10mL 玻璃注射器内活塞,灭菌 4.气管切开包 5.5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6.1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠,浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮,用大头针固定,再剪开小鼠的腹腔,用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基,将小鼠脾脏放入培养皿中,用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液,注入小鼠脾脏,直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。(病毒室离心机) 6.吸出淋巴细胞层,加入5mL 1640培养基洗涤一次,1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液,加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬,细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。

小鼠脾细胞培养实验

山东大学实验报告2011年3月30日 姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者张少华 科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105 一、实验目的 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等,初步掌握无菌操作方法。 二、实验原理 (一)细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官,经体外培养后,直到第一次传代为止。这种培养,首先用无菌操作的方法,从动物体内取出所需的组织(或器官),经消化,分解成单个游离细胞,在人工培养下,使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长,必须满足两个基本要求:一是供给细胞存活所必须的条件,如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二)细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种,常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法,简便,易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理,但无论采用何种办法,都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法,根据染色机理的不同,染料或使死细胞着色,或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括: 死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用,只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后,细胞膜受损,通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝,又称锥蓝,是一种阴离子型染料,不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色,而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异:是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用,使细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型,因此美蓝染色后活的酵母细胞无色;而死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们的无还原能力或还原能力极弱,使美蓝处于氧化态,从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此之外,还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料,可以使活细胞液泡着红色,而细胞质和细胞核不被着色;死细胞的液泡不被着色或浅染,染料弥散于整个细胞中,细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用,如甲基蓝-中性红混合染色法。 三、实验器材 剪子,棉球,75%酒精,移液枪,无菌操作台,正置光学显微镜,倒置光学显微镜,解剖盘,滴管,离心管,离心机,注射器,Eppendorf管,培养皿,酒精灯,塑料培养皿,载玻片,盖

T淋巴细胞提取

淋巴细胞提取 一实验目的:小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象:B/C 小鼠 三实验器材: 1.试剂:淋巴细胞分离液、1640培养基 2.器材:无菌培养皿、200目尼龙网(裁成90mm*90mm正方形,灭菌)、10mL玻璃注射器内活塞(灭菌)、不同规格的镊子、剪刀若干(灭菌)、细胞实验常用器材(离心管、移液管、加样枪、离心机)、75%乙醇、烧杯(无菌)、大头针、超净台 四实验步骤: 1、断头处死小鼠,浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮,用大头针固定,再剪开小鼠腹腔,用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一,在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液(使用前摇匀淋巴细胞分离液)。用镊子固定尼龙网,然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏,使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。(没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内,防止在研磨过程中液体挥发,使得密度与渗透压改变,影响分离效果) 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中,离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟,注意离心设置较慢的加速度和减速度(如果有十档,一般设置在第三档)。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来,在1640覆盖层下面聚集,细胞分层如图二所示

6、析出淋巴细胞层,再加入10mL1640培养基,250g离心10分钟。倾倒上清液,加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬,细胞计数。 五、注意事项: ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基,既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集,又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚,2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠,需要注意两点:其一,每研磨一只小鼠,立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中,注意盖严管盖,切不可敞口放在超净台中。否则,液体挥发,密度与渗透压都会改变,严重影响分离效果。其二,在所有的小鼠脾脏处理完后,统一再加1640覆盖层。如果加早了,两层液体会相互扩散,造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛,以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏,由于镊子夹住脾脏的力度不好控制,易造成细胞死亡。

小鼠脾脏中分离淋巴细胞

小鼠脾脏中分离淋巴细 胞 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞 1小鼠断颈处死,酒精浸泡5分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏,提起,剪去周围结缔组织,放入有PBS的小瓶中。无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中。 2另取无菌试管,先加入淋巴细胞分离液,然后将试管倾斜,略放平,吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中,一般分离液和细胞悬液的体积比为1:2,要轻要慢,不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟,20分钟。 3离心后取出试管,可以看到不同的分层,一般上面是非细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在另外无菌试管中,因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用,加入PBS 离心洗两遍(PBS1000转/分钟,10分钟)。 4,洗好的细胞加入1640培养液和20%的血清中重悬,缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放37度孵育一小时。一小时后取出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管(我们的柱子是用大号注射器做的),以HANKS液和血清先后缓慢冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到80%到90%,再次冲洗并且用力挤压,这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以1640加血清配制的培养液进一步培

养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分,如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。

2018年淋巴细胞分离

淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理: 外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料: 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液(生理盐水) RPMI1640粉末 实验设备:1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程: 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中,(每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释(外周血:稀释液=1:2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀) 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁,把稀释血缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面(Ficoll:稀释血=1:2) 5.放入离心机1500r/min离心20min(注:缓慢加速1-4档个3分钟)

6.用吸管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一离心管中,加入5倍以上体积的稀释液(生理盐水),1500rpm×10分钟离心,洗涤细胞。 7.重复洗涤一次,1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)= 4个大方格内细胞总数 ────────── × 104×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量,外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数: 实验流程: 1.准备计数板:

B淋巴细胞分离技术

B淋巴细胞分离技术 一、实验原理 膜表面免疫球蛋白(SmIg),是B细胞特有的表面标志,它既是B细胞识别抗原的受体,与相应抗原特异性结合;又是表面抗原,能与相应的抗Ig的抗体结合,故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检,以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg,所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM,以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合,并且这种反应也发生于膜表面的IgG,所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞,凡于FITCSPA结合的细胞,在荧光显微镜下,可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体,即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下: 二、实验材料 1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂,用时按要求稀释。 2 pH值72 Hank s液,含5%小牛血清。 3 淋巴细胞分层液,20℃时比重为1077±0002 4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片 三、实验步骤 1、取肝素抗凝血2ml,用Hank s液稀释1~2倍,轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中,2000~2500 r/min水平离心20~25min,获取淋巴细胞。 2、用pH值7.2Hanks液洗2次,最终配成细胞数为2~25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂,然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合,充分混匀后,放4℃冰箱30min。

MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书

MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书 主要用途: 淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液,达到特定比重,然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。可以被用于动物(大鼠、小鼠等)单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、 DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。产品严格无菌,即到即用,操作简易,分离出色,性能 稳定,细胞活性保证。 技术背景: 全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。为了获得纯化完整的单核白细胞 /淋巴细胞,采用Boyum(1968)的离心技术,可以方便快速地从全血和骨髓中分离。 产品内容: 淋巴细胞分离液(200)毫升 产品说明书1份 产品特点: -密度变化率依照 Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在 低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格

检测标准: 热源检测结果:<0.5EU∕ml 无菌检测结果:已检测 应用 人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞,包括骨髓血细胞、脐带血 细胞及组织匀浆。 实验步骤 实验开始前,室温预热淋巴细胞分离液。然后进行下列操作。(注:上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离,需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。 1.准备无菌的锥形离心管 2.加入淋巴细胞分离液 3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1:1比例(如果全血样本粘稠,可适当增大比例)稀释抗凝过的全血样品。 3.小心沿着管壁,接近分离液层面,非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。 (注意:切记不要搅浑淋巴细胞分离液) 4.小心放进台式离心机离心30分钟,速度为400g 5.小心取出离心管,切记不要震动 6.可见,最上层为淡红色透明血浆,其次为薄薄的致密白色环

流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取(图文解说)

流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中 小鼠脾脏的摘取 最近老婆要提取脾脏细胞做流式,我就做个简单的解说,也顺便传到网上供菜鸟理解,如果有大神看到这篇文章,也欢迎指导。大家一起讨论,把实验做得更好。 无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。小鼠的脾脏摘取颇为简单,但有很多同学是第一次接触,所以在此做一个简单的图文讲解。在此讲解不甚详细,具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说,让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。 一,小鼠处死后泡酒精2-3分钟,泡久了细胞会缩水,泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用 二,摆好小鼠体位,取右侧卧位。 三,沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。准备眼科镊和眼科剪若干(文中笔者使用眼科直镊3把,眼科剪2把)

四,向小鼠左后背方探查,在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。脾脏走行向与肋骨方向近似平行 五,用镊子轻轻提起脾脏。脾脏下会连着许多结缔组织,轻轻把它们撕掉。

六,完整摘下脾脏,放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS (混淋)或红裂(流式)和200目的铁丝网】如下右图所示,银色的为本步骤中使用的铁丝网,白色的为后面要用到的过滤膜

七,一把新的眼科剪和一把新的眼科镊(新消毒过的。本文所用的为新高压的),把脾脏在培养皿里剪成小块。然后用2.5ml或5ml注射器柄,把脾脏研磨成细胞。研磨过程要轻柔,否则会损伤脾脏中的细胞。

八,研磨至培养皿中不见整块脾脏,只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。

九,再加入4ml红细胞裂解液,冲洗铁丝网,注射器内芯,并用枪头吹打混匀,裂解5min 十,将液体一并转入15ml离心管中,400g,5min,离心 十一,弃去上清,加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。 十二,滤液离心400g,5min,弃上清,加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀,稀释50(20+980)倍计数,; 至此,脾脏细胞就算提取完成了。后面几步没有上图,但做过实验的同学很容易就能理解是怎么回事啦。

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告 一、实验目的 1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理 2. 掌握淋巴细胞分离的技术,为进行下一步生物实验奠定基础 二、实验材料 1.淋巴细胞分离液 2.EDTA抗凝剂 常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂,能与血液中的钙离子结合成螯合物,而是钙离子失去凝血作用,从而阻止血液凝固 3.PBS缓冲液 PBS缓冲液一般作为溶剂,起溶解保护试剂的作用 4.戊巴比妥钠溶液 作用与苯巴比妥相同,为中时作用的巴比妥类催眠药,作用时间可维持3~6小时,显效较快。用作催眠和麻醉前给药,亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。 5.其他实验材料:健康的小白鼠一只、注射器(1ml,10ml)1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管(5ml,10ml) 三、实验原理 外周血中各种细胞的密度不同。密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异,利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心,使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带,从而达到分离的目的。 第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层

图1 小鼠外周血离心前后示意图 四、实验步骤 1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂,使其麻醉 2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛,将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中,取足1ml新鲜血液 3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1) 4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓(一定要慢)加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中(稀释血液:分离液=1:1),沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上,并与分离液形成明显的界面 5.经水平式离心机离心(1500r/min)15分钟,小心取出试管 6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞,用PBS溶液洗涤两次,每次离心1800r/min,离心10min 7.弃上清液,加入4mlPBS待用

淋巴细胞的分离及鉴定

离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定 【实验目的】 1.了解离心分离技术的原理与分类。 2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。 【实验原理】 1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降,借以分离比重不同的各种物质成分。因此 用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法,在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。 2.用过氧化物酶标记的抗IgM,在一定条件下与淋巴细胞混合,标记的抗IgM抗体可以与 B细胞表面的IgM结合,通过DAB显色,在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。 【实验步骤】 一.细胞分离 1.将小鼠用颈椎脱臼法处死,解剖左侧腹腔靠上部位,将腹膜剪开,找到并取出脾脏。 2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上,加入8ml的生理盐水,用磨棒磨碎脾脏后过滤,即 获得脾细胞混合悬液。 3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液,弃部分上清,调整体积至4ml,重悬细胞。 4.取盛有3ml细胞离心液(比重1.088)的试管一支,用移液器加入细胞混合液4ml。 5.将试管离心1800rpm,(上升和下降率为2)20℃30min。 6.离心后取出试管,观察细胞分层,底层为红色的红细胞,依次向上为细胞分离液和生理 盐水,在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。 7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管,并加2ml PBS洗涤一次,1500rpm 离心5min后去上清。 8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中,取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上,自然干燥后, 可进行细胞类型鉴定。 二.细胞鉴定 1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片,自然干片 2.在室温条件下,用甲醇固定细胞,自然干燥后用蜡笔标出细胞范围,蒸馏水洗三次。 3.配制封闭液。室温浸泡30分钟,PBS洗3次。 4.滴加适当稀释(1:100)的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片,滴加适量 的封闭液于右侧涂片(做阴性对照),于37℃30分钟,PBS洗2分钟3次。 5.滴加DAB显色液,37 ℃显色30分钟,蒸馏水洗3次,干片后,显微镜下观察。 【注意事项】 1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入,使脾细胞混合悬液与分离液形成 明显的界面,小心放取试管,保持界面完整,避免打乱界面,影响分离效果。 2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体,以免假阳性结果。 3.DAB潜在致突变作用,请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。 【实验结果】 如下图:

脾淋巴细胞分离

小鼠脾脏单个核细胞的分离 一、实验目的 1.熟悉细胞分离的基本原理 2.掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法 3.掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法 二、实验原理 1.台盼蓝染色:正常的活细胞,胞膜结构完整,能够排斥台盼蓝,使之不能够进入胞内。丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失,即可认为细胞已经死亡。 2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。人的脾脏位于左季肋区的后外侧部,呈卵圆形,脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞,特别是红细胞和血小板。 三、实验材料 小鼠 手术器械(剪刀、镊子)、酒精喷壶、杀鼠板 平皿,尼龙膜指套、研磨棒、 吸管、试管、EP管、移液器和tips PBS缓冲液、红细胞裂解液(ACK) 细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 8.显微镜 四、实验步骤 (一)取小鼠脾脏 1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头,另一只手抓住鼠尾,用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼,造成脊髓与脑髓断离。 2.取其后右侧卧位,消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。 (二)制备单个核细胞悬液: 1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中,然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使 单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中; 2.吸取平皿中细胞悬液(再次用尼龙指套过滤)置于刻度离心管中,加PBS缓冲液(可冲 洗培养皿)至10mL,以1500rpm离心5min。弃去上清,弹散细胞沉淀,加ACK2ml,轻轻吹打混匀并放置3-4min,以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml,以1500rpm离心5min; 3.弃去上清,弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬 液。(放置冰上) 4.取100uL至EP管中,进行计数和活力测定(建议5倍稀释) 5.以1500rpm离心5min,根据计数结果稀释到合适的浓度 a)注:减少操作的时间,并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力 (三)计算细胞浓度 1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释;(建议5倍稀释)。 2.混匀稀释后,取1滴加至细胞计数板中,计数细胞计数板中4大方格细胞总数; 3.细胞计数:细胞浓度(个/mL)=平均每个大方格中细胞数(4个大方格细胞总数/4)

实验二__小鼠脾细胞提取及计数

实验二小鼠脾细胞提取及计数 一、介绍本次实验整体情况(8:00-8:05,5分钟): 本次实验的操作包括三部分:包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。 二、包被和封闭ELISA板: 备注:提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8:05-8:15,10分钟) 包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验(ELISA)做准备。 包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。在ELISA 板上加上抗原以后,因为电荷数与板不同,所以抗原吸附板上,但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙; 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。 下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。 (1)包被ELISA板: 1) 试剂和器材(老师已经在ELISA板上统一标记好)

a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ; b. 绵羊红细胞抗原-SRBC;(a和b为包被液,实验室老 师已经配好) c.聚乙烯塑料板,微量加样器 2) 操作方法 a. 包被液:碳酸盐缓冲液1:200 稀释抗原SRBC; b. 聚乙烯塑料板:8孔/2人,每孔加100ul包被液,37度恒温2小时。 (2)微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下,老师教学生看量程): 1) 量取样品时选择适当量程的加样器,(P20: 0.5~20.0 μl;P200: 20~200 μl; P1000:200~1000 μl)。老师结合不同型号的微量加样器,指导如何读数,白色由左至右读数,黑/蓝色由上至下读数。 2)转动旋钮,调整量取体积。顺时针旋转增加体积,逆时针 减少体积。禁止超出量程范围,否则会损坏加样器。若有 损坏需赔偿。 3)拇指操作加样器芯,其它四指弯曲握住加样器。 4)让学生了解不同量程的枪头(白色P20,黄色P200,蓝色 P1000),如果是无菌要求的实验还得注意无菌操作。 5)向下按加样器芯时会遇到两个阻力点。到达第一个阻力点 时为量取液体的体积。继续按会遇到第二个阻力点,只在

T淋巴细胞分离技术

T淋巴细胞分离技术 (免疫细胞的分离、纯化和鉴定) 免疫细胞的分离、纯化技术 各种免疫细胞的分工与协作,共同完成免疫应答及其调控,因此,各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞分离的方法有很多,主要是根据细胞的理化性状、功能,以及细胞表面标志等的差异而设计的。粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性(如粘附)和功能不同,旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为:巨噬细胞或单核细胞>树突状细胞=抗体产生细胞>B淋巴细胞>T淋巴细胞=红细胞。粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞,如补体细胞毒分离法,洗淘分离法(panning)、流式细胞术分离法,以及免疫磁珠法分离细胞技术等。一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC) 外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation),用此方法分离PBMC纯度可达95%,淋巴细胞约占90%,其中T淋巴细胞占80%,B淋巴细胞占4~10%。ficoll-hypaque 混合溶液,又称淋巴细胞分层液,在分离人PBMC时,要求其比重为1.077;分离小鼠单个核细胞时比重为1.080;分离大鼠单个核细胞时比重为1.084~1.087;分离马单个核细胞时比重为1.090。 【原理】 血液中各有形成分的比重存在差异,利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque 混合溶液(又称淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液,故位于分层液界面上,这样就可获得PBMC。【器材与试剂】 1.刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等。 2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理盐水溶液,淋巴细胞分层液。(8.2%的聚蔗糖溶液28份,35.7%泛影葡胺10份) 【方法】 1.静脉取血2ml,加入含肝素溶液(10~50u/m1血样本)的试管中,混匀,使血液抗凝。用pH7.2 Hanks液或生理盐水将抗凝血稀释1倍。

淋巴细胞分离液

使用美国Mediatech公司的cellgro淋巴细胞分离液,可显著提高分离率,分离层间隔清晰。货号:25-072-CV Lymphocyte Separation Medium(淋巴细胞分离液) Density(密度) = 1.077-1.080 g/mL at 20oC 【分离目的】 方便在人体外对机体各种免疫细胞分别作鉴定,计数或功能测定。 淋巴细胞分离以后可以做淋巴细胞抗原片制备,E花环试验,淋巴细胞转化试验,淋巴细胞培养(需无菌操作) 【分离原理】 人淋巴细胞的方便来源是外周血,分离的原则是收率较高,纯度较好,失活较低,根据不同试验有相对纯度,无论采用哪种方法,应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计,根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。此次实验采用的1就是密度梯度离心法。其原理是:人外周血中各种细胞的密度不同,人红细胞密度为1.093,粒细胞为1.092,淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异,利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心,使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带,从而达到分离的目的。 【材料】 1、肝素抗凝管,普通管(负压),采血针,血清收集管 2、淋巴细胞分离液(比重1.077– 1.080 g/mL)。 3、无Ca++、Mg++、Hank's 液 4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。 5置于冰箱的冷丙酮(固定细胞,保持细胞的完整性) 【方法】 1.采静脉血2ml加入肝素抗凝管(或枸橼酸钠),3ml加入普通管。 2.普通管斜面放置30MIN,此时可分离淋巴细胞。用竹签将血块轻轻剥离管壁(主张用玻璃棒),2000rPm离心20分钟,用毛细吸管吸取上清(血清)于血清收集管中,于4℃冰箱保存备用,用于以后的ELISA实验,对流免疫电泳实验和伤寒试管凝集实验,溶血反应,免疫比浊测定补体C3或C4等等。 (剥离时也可用毛细吸管轻轻剥离)

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 【实验目的】 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法,并对小鼠脾细胞进行原代培养; 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用; 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法; 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数; 【实验原理】 A.细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下,把动、植物细胞从组织中取出,在体外模拟体内的生理环境,使离体的细胞在体外生长和繁殖,并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞,在无菌条件下,用胰蛋白酶消化或机械分散等方法,将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度,形成致密的单层细胞时,用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞,从一个容器中以1:2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法,称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体,在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究,则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料,对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律,探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制,也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性,使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段,被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点;培养条件易改变和控制,便于单因子分析;便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察;在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被广泛应用。 细胞培养的局限性:在脱离机体复杂环境下,细胞培养条件与躯体环境有一定距离;观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况;细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境,最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 B.细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异: ①细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用,只允许物质选择性地通过;而细胞死后,细胞膜受损,其通透性增加。基于此,发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法,上述染料能使死亡细胞着色,而活细胞不被着色。此外,应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性,死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏,故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。 ②代谢上的差异:活细胞中新陈代谢作用强,细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此,发展处了以荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法,上述酯化的荧光素亲脂性提高,容易被细胞吸收进入,活细胞内的酯酶具有较强的活性,可将

达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案

小鼠淋巴细胞分离液说明书 Cat#:DKW33-R0100 本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。主要成份为Iodixanol ,分子量为1550。它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物,不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰任何细胞表面膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。 EZ-Sep?Mouse 1×小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。小鼠脾脏淋巴细胞分离方法操作简单、易学,对实验者的经验要求不高。 本实验室的研究表明,小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达1小时,离心分离后,淋巴细胞的数量和质量没有明显变化,随后的ELISPOT 检测结果同其它组完全一致。 产品信息: 商品名:EZ-Sep?Mouse 1×(英文) 易得小鼠淋巴细胞分离液(中文) 规格:100mL/瓶 密 度:1.0810±0.0005g/mL (20oC) 渗透压:280±15mOsm 主要成份:Iodixanol ,化学惰性,无生物毒性 内毒素:≤0.5EU/mL 适用范围:分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞 分离大鼠/兔子血液中的PBMC 保存方法:4oC 避光保存,保持无菌保质期:12个月 使用方法: 自备材料:35mm 培养皿、10mL 玻璃注射器内活塞、200目尼龙网——裁 成90mm×90mm 正方形(以上材料均为无菌要求)、其他常用器材:离心管,移液管,加样枪,离心机等 实验步骤:1.断颈处死小鼠,浸泡于75%的乙醇中。2.在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3.在35mm 培养皿中放入4-5mL EZ-Sep?Mouse 1×淋巴细胞分离液(取用前摇匀)。研磨(研磨操作请参考图二)。 4.把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL 离心管中,覆盖200-500uL 的1640培养基(保持液面分界明显)。 5.室温,800g 离心30min 。设置较慢的加速度和减速度,如果有十档,设为第三档。离心结束后细胞分层如图一所示。 6.吸出淋巴细胞层,再加入10mL 1640培养基,颠倒洗涤。室温,250g 离心10min 收集细胞。 7. 倾倒上清液,用无血清培养基或其他培养液重悬细胞,细胞计数。 注意 : 若小鼠饲养时间较长,或者小鼠脾脏异常肿大,导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时,须将细胞悬液用小鼠

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