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HPLC测定阿魏酸含量的探讨[5]

[成分分析]

HPLC 测定阿魏酸含量的探讨

黄罗生1, 郭健新2, 刘咏梅2, 张峻颖1, 平其能2

(1.中国药科大学中药制剂教研室,江苏南京210038;2.中国药科大学药剂教研室,江苏南京210009)

收稿日期:2003204221

作者简介:黄罗生(1964~),男,助理研究员,主要从事中药制剂研究,电话:025********。

关键词:阿魏酸;当归;高效液相色谱法

摘要:目的:探讨阿魏酸稳定性及高效液相色谱法测定当归中阿魏酸含量的方法。方法:以甲酸∶水(5∶95)为阿魏酸对照品的溶剂,甲酸∶甲醇(5∶95)为样品的溶剂,固定相:Shimpack CLC -ODS (150mm ×6mm ),流动相:0.2%甲醇乙腈20.1%磷酸0.1%三乙胺水溶液(20∶80),检测波长:324nm ,流速:1.0mL ?min -1。结果:阿魏酸在0.704~17.6μg ?mL -1范围内线性良好(r =0.9998),平均加样加样回收率为99.33%,RSD 为0.60%。结论:该方法简便快速,适用于含阿魏酸的药材及复方制剂的含量测定。

中图分类号:R927.11 文献标识码:A 文章编号:100121528(2004)022*******

Studies on determination of ferulic acid by HPLC

HUAN G Luo 2sheng 1, GUO Jian 2xin 2, L IU Y ong 2mei 2, ZHAN G J un 2ying 1, PIN G Qi 2neng 2

(1.Depart ment of Pharmaceutics of TCM ; 2.Depart ment of Pharmaceutics ,Chi na Pharmaceutical U niversity ,N anji ng 210038,Chi na )

KE Y WOR DS :ferulic acid ;angelica sinensis ;HPLC

ABSTRACT :AIM :The purpose is to study the stability of ferulic acid and develop a method for determining the content of ferulic acid in angelica sinensis by HPLC.METH ODS :The solvent of reference ferulic acid was HCOOH 2H 2O (5∶95),but the solvent of the sample was HCCOH 2CH 3OH (5∶95).The separation was per 2formed on Shimpack CLC -ODS column with acetonitrile (containing 0.2%methanol )20.1%triethylamine (containing 0.1%phosphate )(20∶80)as mobile phase.Ferulic acid was detected at 324nm with flowing rate as 1.0mL ?min -1.RESU LTS :The calibration curve was linear (r =0.9998)in the range of 0.704217.6μg ?mL -1for ferulic acid.The average recovery was 99.33%and RS D 0.60%,respectively.CONC L USION :The method is quick and convenient for determination of ferulic acid.

阿魏酸存在于多种中草药中,如:阿魏、川芎、当归、升麻等。它本身具有明显的生理活性,有抑制胶原和ADP 诱导的血小板降集作用,对脑血管和血细胞减少有较好的疗效[1]。其含量测定方法的研究报道很多,主要有薄层洗脱比色法[2]、薄层显色扫描法[3]、直接扫描法[4]及高效液相色谱法[5]。但阿魏酸不稳定,遇光和热迅速分解,采用上述报道的溶剂系统,阿魏酸对照品含量迅速分解降低,不能保持其相对的稳定性,在实际测定过程中,难以获得准确的测定结果。故本文就提高阿魏酸的稳定性及高效液相色谱法测定阿魏酸含量的方法进行了探讨。

1 仪器与试剂

Shim 210A 高效液相色谱仪;ShimSPD 210AVP 紫外检测

器;Shim LC 210A TVP 泵(日本岛津公司);阿魏酸对照品(中

国药品生物制品检定所);甲醇、乙腈均为色谱纯;当归(饮片)为2伞形科植物当归A ngelica sinensis Oliv Diels.的干燥根

(炮制品),产地:甘肃岷县、甘肃武都和云南昆明,分别为20000101,20000102,20000103。2 色谱条件

色谱柱:Shimpack CLC -ODS (150mm ×6mm );流动相:

0.2%甲醇乙腈20.1%磷酸0.1%三乙胺水溶液(20∶80);检测波长:324nm ;流速:1.0mL ?min -1。

3 方法与结果3.1 流动相的考察

称取批号为20000103的当归药材粉末(过80目筛)约0.2g ,于10mL 量瓶中,用甲醇∶甲酸(95∶5)加至刻度,50HZ 超声30min ,静置。取上清液过0.45

μm 滤膜,取续滤液,进样20μL 。流速1.0mL ?min -1,检测波长:322nm ,流动相选用0.2%甲醇乙腈20.1%磷酸0.1%三乙胺水溶液(20∶80)[6],保留时间为14min 左右,另称取阿魏酸对照品约1mg 于250mL 棕色量瓶中,用甲醇∶甲酸(95∶5)加至刻度,在相

4

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同色谱条件下进样20μl ,分离度良好,结果见图1

。Fig 1 HPLC Chrom atograms of Ferulic Acid

A.Ferulic Acid in Angelica Sinensis

B :reference Ferulic Acid

3.2 波长的选择

称取阿魏酸对照品约1mg 于250mL 棕色量瓶中,用甲醇∶甲酸(95∶5)加至刻度,分别在320,322,324,326mm 处

进样20μL 。流速1mL ?min -1。测定其峰面积,可知阿魏酸在324nm 处有最大吸收,结果见表1。

T ab 1 Peak areas of Ferulic Acid at different

detective w avelength

波长(nm )

320

322

324

326峰面积

238506.703242824.000248533.703

236035.703

3.3 不同溶剂对阿魏酸稳定性的影响

称取阿魏酸对照品约1mg 于250mL 棕色量瓶中,用甲醇∶甲酸(95∶5)定容至刻度,吸取1mL 于10mL 棕色量瓶中

(5份),再分别用比例为1∶99,2∶98∶96,5∶95的甲酸∶水

及甲醇∶甲酸(95∶5)稀释至刻度,测定其1h ,20h ,48h 时的峰面积,用外标法计算其含量。结果表明:选用甲酸∶水(5∶95)作为溶剂,阿魏酸对照品在48h 内稳定(上述溶液均在避光及4°C 的冰箱中保存,测定时从冰箱中取出),结果见表2。

T ab 2 

Changes of the content of Ferulic Acid in different solvents

溶剂

HCOOH ∶H 2O

(1∶99)HCOOH ∶H 2O (2∶98)

HCOOH ∶H 2O (4∶96)

HCOOH ∶H 2O (5∶95)CH 3OH ∶HCOOH

(95∶5)

1h 含量(%)

98.9599.0099.07100.0098.873h 含量(%)98.9798.9699.03100.0397.955h 含量(%)97.2696.6398.6499.9892.1610h 含量(%)97.0996.5898.3699.9986.0220h 含量(%)97.0296.6098.36100.0269.0248h content (%)

-

--99.35

-

3.4 样品稳定性的考察称取批号为20000103的当归药材粉末(过80目筛)约

0.2g 于10mL 棕色量瓶中,用甲醇∶甲酸(95∶5)将其稀释至

刻度,50HZ 超声30min ,静置。1h ,20h 后分别测定,20h 后阿魏酸含量几无变化。故可选用甲醇∶甲酸(95∶5)作为当归药材的溶剂。

3.5 溶剂及色谱条件的确定

综上所述,故以甲醇∶水(5∶95)作为阿魏酸对照品的溶剂,甲酸∶甲醇(5∶95)作为样品的溶剂,色谱条件为:固定相:

shimpack CLC 2ODS ,流动相:0.2%甲醇乙腈20.1%磷酸0.1%三乙胺水溶液(20∶80),检测波长:324nm ,流速:1mL ?min 。

3.6 样品提取条件的选择

称取批号为20000103的药材粉末(过80目筛)约0.2g 于10mL 棕色量瓶中(3份),用甲醇∶甲酸(95∶5)加至刻度,50HZ 分别超声10,20,30min ,静置,取上清液过0.45μm 滤膜,取续滤液,色谱条件下进样20μL 。结果见表3。

T ab 3 

I nfluence of different extractionmethods

on the contents

提取时间

样品(g )

含量(μg ?g -1)

10min

0.4226219.9720min 0.4097233.2930min

0.4007

233.64

由表3可知,超声提取20min 与30min ,含量基本无变化,因此选用超声提取20min 。

3.7 对照品溶液的制备

精密称取阿魏酸对照品(4.4mg )于250mL 棕色瓶中,

用5%甲酸水补足至刻度。再依次取1,2,4,10mL ,于10

mL 棕色瓶中用5%甲酸水补足至刻度得2,3,4,5号液。再

从3号液中取2mL 于10mL 棕色瓶中,用5%甲酸水补足至刻度得1号液。

3.8 样品溶液的制备

精密称取批号为20000103的当归饮片粉末(过80目筛)约0.2g 于10mL 的棕色瓶中,加入甲醇∶甲酸(95∶5)至刻度,50HZ 超声20min ,静置。取上清液过0.45μm 滤膜,取续滤液,即得。

3.9 标准曲线的制作

分别取浓度为0.704,1.76,3.52,7.04,17.6μg ?mL -1的对照品溶液20μL 进样。阿魏酸浓度在0.704~17.6

μg ?mL -1间与峰面积有良好的线性关系。回归方程为Y =-3936.228+72606.715X (r =0.9998,n =5)

Fig 2 Peak area 2concentration curve of refer 2

ence Ferulic Acid

3.10 对照品溶液的稳定性试验

用浓度为1.76μg ?mL -1对照品溶液测日内稳定性,每

3h 测一次,共测6次,RSD 为2.41%(n =6),说明对照品在

5

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15h内,稳定性良好。

3.11 精密度试验

用浓度为1.76μg?mL-1对照品溶液进样,共6次,RSD 为1.67%(n=6),精密度良好。

3.12 样品溶液的稳定性试验

取样品溶液测日内稳定性,每3h测1次,共测6次, RSD为2.01%(n=6),说明15h样品内稳定性良好。

3.13 重现性试验

精密称取批号为20000103的当归饮片粉末(过80目筛)约0.2g(6份),按3.8制备样品溶液,测含量,结果见表4。

T ab4 R ecurrence of the samples

样品(g)含量(μg?g-1)

0.1943233.56

0.1943235.25

0.2005228.93RS D=1.67%(n=6)

0.2005236.46

0.2220226.40

0.2220230.72

3.14 加样回收率试验

精密称取已知阿魏酸含量的当归饮片80目粉末(批号为20000103)约0.1g6份,于10mL的棕色量瓶中,加入阿魏酸对照品17.6μg,加甲醇∶甲酸(95∶5)至刻度,50HZ超声20min,静置,取上清液过0.45μm滤膜,取续滤液,进样20μl,RSD为0.6%(n=5)结果见表5。

T ab5 R ecoveries of Ferulic Acid

样品(g)加样量

(μg)

测得量

(μg)

回收率

(%)

平均回收率

(%)

0.102517.641.0499.20

0.105817.641.9899.63

0.099617.640.0698.4499.33

0.090617.638.1998.91

0.102917.641.3499.70

0.102917.641.50100.09

3.15 样品的含量测定

取不同产地不同批号当归药材粉末(过80目筛),甘肃岷县批号为20000101、甘肃武都批号为20000102和云南昆明批号为20000103(过80目筛)约0.2g(每批3份),按3.8项制备样品溶液,进样20μL。结果见表6。T ab6 Content of Ferulic Acid

批号含量(μg?g-1)

RS D(%)

(n=6) 20000101413.05 1.41

20000102479.58 1.27

20000103232.60 1.87

4 讨 论

4.1 文献报道的高效液相色谱法测定阿魏酸的方法较多,多用甲醇∶甲酸(95∶5)、50%甲醇、50%乙醇等作溶剂[7],但在实际测定过程中,采用上述溶剂,阿魏酸对照品含量迅速降低,即使在避光及冰箱(4°C)保存的条件下,也只能保持1~3h的稳定性,难以获得准确的测定结果,现采用少量甲醇∶甲酸(95∶5)将阿魏酸溶解后,用甲酸∶水(5∶95)作溶剂,可抑制阿魏酸分解,在避光及冰箱(4°C)保存的条件下,可保持48h以上的稳定性,但仍应避免强光照射及过高温度。4.2 测定药材时因用水∶甲酸(95∶5)作溶剂,杂质较多,污染色谱柱,用甲醇∶甲酸(95∶5)作溶剂,阿魏酸稳定性良好,表明当归中含有阿魏酸稳定因子。本法适用于当归药材及其复方制剂中阿魏酸含量的测定。

4.3 试验中所用的当归药材来自甘肃岷县、甘肃武都和云南昆明,测定结果表明产于甘肃武都的当归,阿魏酸含量最高,产于甘肃岷县的当归,阿魏酸含量略低,产于云南昆明的当归,阿魏酸含量最低,其阿魏酸含量比甘肃武都的低51. 5%,可见不同产地的当归,阿魏酸含量差异很大。

参考文献:

[1] 江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海人民出版社,

1997:1286.

[2] 李光华,罗西湘,张砚农,等.当归制剂中阿魏酸测定方法[J].

中成药研究,1986,10:43.

[3] 吕瑞绵,何丽一,罗淑荣,等.当归中阿魏酸含量测定的研究

[J].中草药,1980,11(9):395.397

[4] 曾庆煌,王兰霞,张伯崇,等.当归静脉注射液中阿魏酸的薄层

扫描测定[J].中成药研究,1986(3):7.

[5] 陈汉平,刘素香,李桂梅,等.高效液相色谱法测定当归及其炮

制品中的阿魏酸含量[J].中草药,1988,19(10):15216.

[6] 台湾中国医药学院.中国药学研究所研究报告,1992.

[7] 王宝 .中成药质量标准与标准物质研究[M].中国医药科技

出版社.1994:3832401.

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