illumina miseq 二代测序在农业领域应用

DNA测序原理和方法.

DNA测序原理和方法 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。 【原理】ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA 测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。 由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】 1．BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP 和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3．M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4．DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR 反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。 5．引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。 6．灭菌去离子水或三蒸水。 7．0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离，PE公司产品。 8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。 9．70%乙醇和无水乙醇。 10．NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。11．POP 6测序胶ABI产品。

农业生物技术的现状与发展方向摘要

农业生物技术的现状与发展方向(摘要) 生物技术是战略高技术的重要领域之一，技术发展日新月异，国际竞争日趋激烈。生物技术产业也是高新技术新兴产业，是当前国际高技术产业化的重点领域，已经成为新的经济增长点。生物技术已成为解决人类面临的人口、能源、环境、粮食等重大问题的有效手段，将为保障粮食安全、能源安全、公共卫生安全、食品安全和国家安全提供重要的科技支撑。生物技术与产业已成为世界各国支持和投资的重要领域，在国民经济和社会发展中具有重要战略地位。 一、国内外发展现状和趋势 目前，生物技术进入第三次浪潮，生物技术研究开发已成为世界各国重点投资的战略高技术领域，生物技术与产业已成为国际科技乃至经济竞争的重点，生物技术产业已成为新的经济增长点，生物安全已成为国家安全的重要组成部分。随着相关学科发展及社会需求，医药生物技术、农业生物技术及工业生物技术都有了长足的发展。2001年美国生物技术产业总产值5670亿美元，利润1005亿美元。2004年全球18个国家种植转基因植物面积达8100万公顷，8年增长40倍。生产近200种生物药物，防治200多种疾病的370余种新药进入临床试验,全球3.25亿人受益。2003-2004年全球转基因农作物价值达到439亿美元，其中中国为39亿美元，预计在十年后将达到2110亿美元，增长5倍。 农业生物技术发展趋势主要体现在以下几方面：生物技术与常规技术的结合越来越紧密；作物分子育种体系正在形成；转基因植物发展十分迅猛,产业化步伐不断加快；农作物杂种优势利用进入新阶段；动物体细胞克隆技术体系已经形成，进入实用阶段；利用动植物生物反应器生产特殊药物和功能性食品；分子诊断技术和基因工程疫苗成为畜禽重大疫病防治的重要手段；生物农药和生物肥料成为产业化的重点；生物可降解材料开始进入市场；农林生物质能的开发利用方兴未艾。从战略需求的角度出发，要满足以下需求：提高农业科研水平，增强原始创新能力的需求；提高粮食产量、改善品质，确保国家粮食安全需求；调整农业产业结构、提高农业生产效益的需求；减少环境污染，确保农业生态安全的需求；提高土地资源利用率，促进可持续发展的需求；提高和改善农产品质量，增强农业综合国际竞争能力的需求；提高重大畜禽疾病防控水平，保障人民健康的需求。 针对以上需求，农业生物技术的发展方向有以下几方面：共性关键技术及平台；功能基因组和比较基因组；动植物分子标记辅助育种；作物品种设计；转基因植物及产业化；新型畜禽基因工程疫苗、诊断试剂等产品研制；农业微生物工程及产品；生物质能的关键技术及产品；动植物生物反应器；人畜共患重大疫病防控关键技术及产品。目前生物技术的应用方面，运用功能基因组学进行相关重要功能基因的克隆；蛋白质组和功能蛋白的大规模表达技术；对生物信息的收集、加工、利用；RNAi技术及其应用；生物芯片及产品开发；动物细胞的大规模培养；Knock-out和Knock-in技术及应用；化学基因组和表观基因组。 最终的目标，突破一批关键技术、提高农业生物技术的整体水平；获得一批有自主知识产权的产品，提高市场竞争能力；建立一批基地，提高成果转化能力；培养一批人才，增强创新能力；研制一批产品、提高国际竞争能力。 二、农业生物技术的突破点与应用前景 我国水稻功能基因研究取得重大突破，水稻基因组研究整体水平处于国际领先地位，完成籼稻全基因组测序和粳稻第4号人染色体测序,结果在《SCIENCE》和《NATURE》上发表；我国已建成转基因牛生物反应器基地；初步建立了棉花

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用复习过程

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用

随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不

NGS在临床中的应用

高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望 对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1 测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（single molecule realtime，SMRT）DNA测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBio RS II每次运行能够产生60 000×16条序列，每条序列的平均长度达8 500 bp。 一般来说，以上每种测序仪在序列读段长度、准确性、测序通量、价格等多个方面存在一定的差异。焦磷酸测序平台测序读段较长，测序通量较低，成本相对较高；Illumina系列平台产生的读段相对较短，测序费用相对较低，应用比较广泛；SOLiD测序平台在通量和准确性方面相对以上2种类型的测序平台有明显改善，但是测序长度更短；半导体测序平台以及SMRT测序平台相比其他测序平台运行时间较短，另外单分子测序平台减少了测序前的扩增准备工作，测序读段较长，但是测序成本和错误率都相对较高[8-10]。一些常用的测序仪的测序原理和性能见表1。

农业生物技术复习资料

1、生物技术—— 2、农业生物技术—— 3、简答：农业生物技术应用举例 P5_19 第一章植物遗传育种技术——第一节植物遗传的基础知识1、遗传—— 2、变异—— 3、同源染色体—— 4、有丝分裂—— 5、减数分裂—— 6、受精—— 7、连锁遗传—— 8、质量性状—— 9、数量性状—— 10、遗传力—— 11、细胞质遗传——

12、减数分裂的基本特点有哪些？ 13、三大遗传定律的实质分别是什么？ 14、数量性状遗传的特征是什么？ 15、遗传力在育种应用中有哪些规律？

P19-20第二节植物品种概念和育种目标1、品种—— 2、物种—— 3、简答新品种有哪些特点？ P20-23第三节种质资源 1、种质资源—— P23-25第四节引种 1、引种—— 2、简答引种的基本原理。 3、简答引种的一般规律。 4、简答引种的注意事项。

P25-30 第五节选择育种 1、选择育种—— 2、选择育种的实质是，其要点是，连续的定向选择可以显著改变。 3、选择育种的选择方法有和。 4、简答：系统育种一般程序是什么？ 5、简答：混合选择育种程序是什么？ P30-36 第六节杂交育种技术 1、杂交育种—— 2、简答：亲本选配有哪些原则？ 3、简答：杂交技术环节有哪些？

P36——42 第七节杂种优势的利用 1、杂种优势—— 2、简答：杂种优势有哪些特点？ 3、利用杂种优势的基本条件是什么？ 4、杂交种种子的生产有哪些方法？ 5、杂交制种的技术环节是什么？ P42-47 第八节良种繁育 1、引起植物品种混杂、退化的原因有哪些？ 2、如何进行原种生产？

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里，新一代DNA测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术(next-generation sequencing)，是相对于传统Sanger测 序而言的。Sanger测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷 是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新 一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA片段，然后拼接成一幅完整的图 画。 Sanger测序大家都比较了解，是先将基因组DNA片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对 于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA每个循环测序反应产生以ddNTP终止的，荧光标记的产 物梯度，在测序仪的96或384毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列(polony )。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的 荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片 段。 DNA hnginetilntion DNA fraqmentnlion fn vivo cloning and amplification Cycle sequencing 3'-... GACTAGATACGAGCGTGA.. .-5* (template) 彳-…CTGAT O 曲爭i .CTGATC^A ...CTGATCT"*^ …CTG町CTA先 _________ > .,,CTGATCTAT ..CTGATCTATC ,.CTGATCTATGC ..CTGATCTATGCT ...CTGATCTATGCTC ..CTGATCTATGCTCG — Electro pho rsesis (1 read/cnpU(ary) Cyclic array sequencing Cycle 1 (>10? reads/array) Cycle 2 Cyde 3 B- A A A Is O 0 O? What IS Ibas# 1 ? Whar is bast 卍 in vitro ndaptor ligation Generf^tiorii ol ipolony array Polymerase dNTPs Lat>0led ddNTPs

新一代DNA测序技术总览

作者：尹银亮、陈会平、毛良伟译来源：生物谷 原文刊登于《分析化学》综述Analytical Chemistry 原文标题：Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies 索引信息：https://www.wendangku.net/doc/ca5040328.html,/10.1021/ac2010857 | Anal. Chem. 2011, 83, 4327–4341 原文作者：Thomas P. Niedringhaus, Denitsa Milanova, Matthew B. Kerby, Michael P. Snyder,and Annelise E. Barro 译者资料： 尹银亮，香港华大基因研发中心有限公司email：stevenyinbio@https://www.wendangku.net/doc/ca5040328.html, 陈会平，毛良伟，武汉华大基因科技有限公司 【内容】 第二代测序 第二代测序成本 第三代测序技术 单分子测序法 边连接边测序法 边合成边测序法 纳米孔测序技术 蛋白质纳米孔测序法 固态纳米孔测序法 长距离阅读DNA的扩展方法 总结性评论 DNA测序正处在技术上天翻地覆剧变的阵痛之中，其突出特点是，测序通量（测序数据量）的大幅增长，原始数据中每个碱基的测序成本急剧下跌，并伴随着以巨资购买仪器以引进新技术的需求。以前看似高不可攀的奢侈性研究活动（如个人基因组测序，宏基因组学研究，以及对大量重要物种的测序），在短短几年之间，正以急速的步伐而变得越来越切实可行了。本篇综述将集中讨论在第三，第四代测序方法背后的故事：它们所面临的挑战；各种方法的局限性；以及它们带给我们的充满诱惑的前景。 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌 体X174的，全长5375个碱基。其测序方法和历史过程以前已做过详细回顾。 后来的四色荧光桑格测序法（每一种荧光代表四种碱基中的一种）被用在自动毛细管电泳测序系统中，此系统由应用生物系统有限公司（Applied Biosystems Inc.）推上市场，后来该公司被整合入生命技术公司(Life Technologies)和贝克曼.考尔特公司(Beckman Coulter inc.)（见表1）。发表于2001年的第一个人类基因组

农业生物技术期末试题

2017年秋唐河职专种植类基础课期末试卷 《农业生物》（满分100分） 注意：所有答案都要写在答题卡上，写在试题卷上无效 一、选择题（每小题只有一个正确答案，请将正确答案涂在答题 卡上，每小题2分，共50分。） 1.“种瓜得瓜，种豆得豆”这就是亲代与子代个体之间的（ ） A.连锁 B.分离 C.遗传 D.都不是 2. DNA 分子具有( ) A.特异性 B.互异性 C.排斥性 D.都不是 3．人类成熟细胞染色体数目为 A ．n=21 B ．2n=46 C ．2n=30 D ．n=24 4．自由组合规律是 发现并首次提出的。 A ．孟德尔 B ．贝特生 C ．达尔文 D ．摩尔根 5．减数分裂中，联会发生在（ ） A ．姊妹染色单体之间 B ．非姊妹染色单体之间 C ．同源染色体之间 D ．非同源染色体之间 6．同一单位性状在不同个体间表现出来的相对差异称装 订 线 班级 姓名 考场 考号

为 A．相对性状 B．变异性状 C．表现性状D．差异性状 7. DNA分子两条链的盘旋方向（） A、同向平行 B、反向平行 C、同向交叉 D、反向交叉 8.一个性母细胞经过一次完整减数分裂过程产生（）个子细胞 A 、1 B、2 C、4 D、8 9. 减数分裂过程中，同源染色体的配对发生在（）。A．偶线期 B．粗线期 C．双线期 D．终变期 10．减数分裂中， c 实现了染色体数目减半（） A.前期I B.中期I C.后期I D.末期I 11、水稻由高杆变为矮秆，生长在水沟边的植株比其他的高大（）。 A、两者都是可遗传的变异 B、前者是可遗传的变异，后者是不可遗传的变异

C、两者都是不可遗传的变异D 、前者是不可遗传的变异，后者是不可遗传的变异 12、下列属于相对性状的是（）。 A、大麦的高秆与小麦的矮秆 B、人的身高与体重C．玉米的黄粒与凹陷 D. 甜玉米与非甜玉米 13、已知红花豌豆与白花豌豆杂交，F1全部是红花豌豆，让F1与隐形亲本测交一代，则测交一代中红花豌豆和白花豌豆的比例是（） A、4:1 B、3:1 C、2:1 D、1:1 14、T代表（） A、胸腺嘧啶 B、胞嘧啶 C 、鸟嘌呤 D、腺嘌呤 15. 普通小麦的染色体数目（）。 A、24 B、20 C 、42 D、46 16、杂种YyRr独立遗传，自交后代群体中纯合体的比例（）。 A、1/16 B、1/12 C、1/8 D、1/4 17、下面都不属于相对性状的是（）。 A、红葡萄与白葡萄 B、黄菊花与白菊花

DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

高通量测序：第二代测序技 术详细介绍 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa 高通量测序原理 --采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry） --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究 ----将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。 ----随后在含有接头（单链引物）的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上，另一端和附近的另外一个引物互补也被固定，形成“桥” ----经30伦扩增反应，形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理，加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的基团，使得每个循环只能掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment =One bead = One read）”

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用 发布时间:2014-07-19 来源:毕业论文网 随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005 年，以Illumina 公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和Walter Gibert 发明了Sanger 测序法，并在此后的10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当DNA 链加入分子ddNTP，延伸便终止。每一次DNA 测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA 片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如，临床上采用Sanger 直接测序FGFR 2 基因证实单基因Apert 综合征和直接测序TCOF1 基因可以检出多达90% 的与Treacher Collins 综合征相关的突变。值得注意的是，Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 直接扩增测序。

生物技术在农业方面的应用

生物技术在农业方面的应用 一、生物技术概念介绍 生物技术又称为生物工程，或称为生物工程技术，是指利用生物的特定功能，通过现代工程技术的设计方法和手段来生产人类需要的各种物质，或直接应用于工业、农业、医药卫生等领域改造生物，赋予生物以新的功能和培育出生物新品种等的工艺性综合技术体系。生物技术包括传统生物技术和现代生物技术两部分，现代生物技术是在传统生物技术的基础上发展起来的，但与传统生物技术又有着质的差别。 二、现代生物技术的发展 现代生物技术的发展是以２０世纪７０年代ＤＮＡ重组技术的建立为标志。１９５３年提出了ＤＮＡ的双螺旋结构模型，阐明了ＤＮＡ的半保留复制模式，从而开辟了分子生物学研究的新纪元。１９６１年破译了遗传密码，揭开了ＤＮＡ编码的遗传信息是如何传递蛋白质这秘密。１９７２年实现了ＤＮＡ体外重组技术，标志着生物技术的核心技术———基因工程技术的开始，它向人们提供了一种全新的技术手段，使人们可以按照意愿在试管内切割ＤＮＡ，分离基因并进行重组后导入其它生物或细胞，以改造农作物或畜牧品种；也可以导入细菌，由细菌产生大量有用的蛋白质或作为药物；也可以直接导入人体进行基因治疗。显然，这是一项技术上的革命。以基因工程为核心，带动了现代发酵工程、现代酶工程、现代细胞工程以及现代蛋白质工程的发展，形成了具有划时代的意义和战略价值的现代生物技术。 农业生物技术是指运用基因工程、发酵工程、细胞工程、酶工程以及分子育种等生物技术‘改良动植物及微生物品种生产性状、培育动植物及微生物新品种、生产生物农药、兽药与疫苗的新技术。应用生物技术可以培育出优质、高产、抗病虫、抗逆的农作物以及畜禽、鱼类等新品种；可以进行再生能源的利用解决能源短缺问题；可以扩大食饲料、药品等来源，满足人类日益增长的需要；可以进行无废物的良性循环，减少环境污染，充分利用各种资源等。 三、生物技术在农业中的应用 1.植物生物技术 植物生物技术是一门研究植物遗传规律、探索植物生长发育机理，应用现代生物技术改良遗传性状、培育新品种、创造新种质的学科。 （1）植物育种和繁殖 随着生物技术的发展，人们已经可以把一个品种、品系的理想遗传性状转入另一品种、品系，以提高植物的价值、产量和质量。在番茄中导入编码ＥＦＥ酶的反义基因，使得ＥＦＥ酶活性降至正常的５％以下，成功限制了乙烯的生成，果实生理成熟后长期保持坚硬，仓贮一个月以上不会软化、不会腐烂，很大程度上提高了番茄的耐贮藏性能和经济效益。将大

一、二、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa

technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA 聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4）数据分析 第三代测序技术-高通量、单分子测序 被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪，PacificBioscience的SMRT技术和 Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量低成本长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖于DNA模板

picbio 三代测序原理

三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术 气温回升，天气渐暖， 花儿开了一簇又一簇~ 在这美好的季节里， 我们准备聊点新话题。 今天小编要来和你分享： PacBio SMRT测序那些事儿~

测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。 PacBio SMRT测序原理 Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下： 聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部 4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光 荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基 统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列 酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落 聚合反应持续进行，测序同时持续进行 PacBio SMRT测序原理 PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

农业生物技术绪论 教案

绪论 一、授课章节 绪论。 二、学时安排 2学时。 三、教学目标 1．掌握生物技术、农业生物技术定义。 2．掌握农业生物技术的应用方面。 3．了解农业生物技术的发展史。 四、教学重点、难点分析 重点： 1．农业生物技术概念。 2．农业生物技术的应用。 难点： 农业生物技术内涵。 五、教具 电化教学设备。 六、教学方法 讲授法，多媒体课件。 七、教学过程 Ⅰ导入 21世纪是一个高科技迅猛发展的世纪，生命科学和生物技术必将得到进一步发展和广泛的应用，那么什么是生物技术呢？它包括哪些方面呢？本次课我们就来学习生物技术、农业生物技术及其应用等方面的知识。 II新课 一、农业生物技术的内涵 1．生物技术的内涵 生物技术是指“利用细胞和分子过程来解决问题或制造产品的技术”。

2．农业生物技术 农业生物技术是以农业生物为主要研究对象，以农业应用为目的，以现代生物技术为主体的综合性的技术体系。 农业生物技术是生物技术的重要组成部分，农业生物技术的创新和发展，将成为推动世界农业跨越式发展的主导力量。 二、农业生物技术的发展史 农业生物技术这项新兴的高新技术孕育于古老悠久的农业生产技术之中。从“刀耕火种”的原始农业时代，不断驯化选择野生生物进行栽种和饲养，这便是生物学、栽培学、耕作学、饲养学等学科的萌芽。19世纪中期，法国伟大的微生物学家巴斯德，首先揭示了发酵作用的实质是由微生物引起的，由此奠定了发酵工程的科学基础。遗传学三大规律发明者之一孟德尔，根据８年（1857~1865）的豌豆杂交试验结果，在1866年“植物杂交的试验”论文中阐述了性状遗传是受细胞中的遗传因子控制的，并首次提出了遗传学的分离规律和独立分配规律。美国科学家摩尔根等人用果蝇做了大量试验，进一步证实了孟德尔的两个遗传规律，并把他假定的遗传因子（即基因）以直线定位在细胞核内的染色体上，进而创立了基因论。这样，摩尔根发现的连锁与交换规律和孟德尔的分离规律、独立分配规律共称为遗传学三大基本规律，也就是人们常说的经典遗传学。 1944年阿委瑞等人用生物化学方法证实了染色体上的重要组成部分DNA 是主要的遗传物质。1953年沃森（Watson ）和克里克（Crick ）通过X 射线衍射分析研究，提出了DNA 分子双螺旋结构模型，进而明确了基因是DNA 分子上的一个区段，从而奠定了分子遗传学的基础。 1973年，转基因的技术问题被解决。1983年首次获得转基因植物，至今已有35科120多种植物转基因获得成功。 1902年，德国植物学家哈伯兰特（Haberlandt ）提出了高等植物的器官和组织为多种细生物技术 生物技术

《二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版)》要点

《二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识 （2020版）》要点 1 引言 肺癌是目前全球最常见、致死率最高的恶性肿瘤。2018年全球肺癌新发病例近209.4万例，占所有恶性肿瘤的11.6%，死亡病例176.1万例，占所有恶性肿瘤的18.4%。全国肿瘤登记中心数据显示，2014年我国新发肺癌患者数为78.1万，死亡数达到62.6万，居所有恶性肿瘤发病和死亡人数首位。 随着对疾病认识的不断加深，肿瘤的治疗模式也在发生变革，个体化精准治疗模式逐渐成为主流。在非小细胞肺癌（NSCLC）领域，随着基因检测技术的进步和一系列新药临床研究的突破，近10年间新发现的肿瘤驱动基因不断增多，推动了NSCLC靶向治疗药物的研发和临床应用。近年来兴起的免疫治疗是肿瘤治疗领域的革命性突破。NSCLC的免疫治疗研发和应用速度进步显著，目前已有多个针对NSCLC患者的免疫治疗方案获批。但如何筛选出可从免疫治疗中获益的人群，仍是该疗法在临床应用中的一大挑战。研究表明，全面的分子生物学检测信息可为肺癌患者免疫治疗的方案选择、预后判断，以及为临床试验入组提供依据。 二代基因测序（NGS）又称为高通量测序，该技术能够同时对上百万

甚至数十亿 个DNA进行分析，实现了高通量测序的目标。 2 NGS检测的适用人群 2.1 常规推荐进行NGS检测的NSCLC患者 【共识1】：推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分的肺癌以及不能分型的晚期新发或术后复发的NSCLC患者常规进行基因检测。[级推荐] 对经小标本活检诊断为含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合型鳞癌，以及年轻或不吸烟/少吸烟肺鳞癌患者，也推荐进行基因检测。[级推荐] 2.2 NGS和传统检测方法的比较 【共识2】：针对敏感型突变发生率高的NSCLC患者（见“共识1”），常规基因检测结果为阴性时，建议使用中国国家药品监督管理局（NMPA）或美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NGS产品进行复检。[级推荐] 3 晚期新发或术后复发NSCLC患者首次进行基因检测的