体外磷酸化实验

In vitro phosphorylation of HsSgo1 by NEK2A The GST-tagged wild-type HsSgo1 and non-phosphorylatable (HsSgo1S14A, HsSgo1S507A and HsSgo1S14/507A) mutants were expressed in Escherichia coli strain BL21 (DE3) and purified by using glutathi-one-agarose beads (Sigma) as previously described [13]. Briefly, 1liter of LB media was inoculated with bacteria transformed with GST-HsSgo1. The expression of protein was induced by addition of 0.5 mM isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside at 30 °C for 3 h. After the induction, bacteria were harvested by centrifugation and re-suspended in phosphate-buffered saline (PBS) containing proteinase inhibitors (leupeptin, pepstatin, and chymostatin; 5 μg/ml), and sonicated for four bursts of 10 s each by using a probe-tip sonicator. The lysis solution was cleared by centrifugation for 20 min at 10 000 × g. The soluble fraction was applied to a column packed with glutathione-agarose beads, followed by extensive washes with PBS.

For in vitro phosphorylation assay, aliquots of wild-type GST-HsSgo1 and mutant HsSgo1 proteins (20 μg each) were incubated with 200 ng of active NEK2A in kinase buffer (25 mM HEPES, pH 7.2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 2 mM EGTA, 5 mM MgSO4) with 50 μM ATP and 0.5 μCi of [32P]-ATP. The reaction mixtures (50 μl) were incubated at 30 °C for 30 min and terminated by add-ing SDS-PAGE sample buffer. Proteins were

then fractionated on SDS-PAGE. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue and quantified by a PhosphoImager (Amersham Biosciences) as previously described [Zhou R, Cao X, Watson C, et al. Characterization of protein kinase A-mediated phosphorylation of ezrin in gastric parietal cell activation. J Biol Chem 2003; 278:35651-35659.].

八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必

免疫组化步骤

免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记

免疫组化超详细步骤

免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020

免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。

医学检验实验室基本标准

医学检验实验室基本标准 医学检验实验室指以提供人类疾病诊断、管理、预防与治疗或健康评估得相关信息为目得,对来自人体得标本进行临床检验,包括临床血液与体液检验、临床化学检验、临床免疫检验、临床微生物检验、临床细胞分子遗传学检验与临床病理检查等,并出具检验结果,具有独立法人资质得医疗机构。 一、诊疗科目 医学检验科;提供病理相关医疗服务得,应当参照病理诊断中心基本标准、 二、科室设置 包括临床血液与体液检验专业、临床化学检验专业、临床免疫检验专业、临床微 生物检验专业、临床细胞分子遗传学专业与临床病理专业等。有病案信息、试剂、质 量与安全管理等专门部门或专职人员,以及辅助检查部门与消毒供应室(可以设置也可以委托其她医疗机构承担相应得服务)、 三、人员 (一)至少有1名具有副高级以上专业技术职称任职资格得临床类别执业医师。 (二)临床检验各专业至少有5名以上医学检验专业卫生技术人员,其中至少有1名具有 副高以上、2名中级以上专业技术职称任职资格得技术人员。 (三)标本采集人员应当有相应资质、 (四)开展产前筛查与产前诊断项目得实验技术人员应具备产前筛查与诊断得相应资质、开展二代基因测序项目得,至少有1名生物信息分析专业技术人员;开展遗传相关基因检测项目得,至少有１名医学遗传学专业人员、 (五)配备质量安全管理人员;设置试剂室、辅助检查与消毒供应室得,应当配备相应得卫生专业技术人员。 (六)应当制定人员培训考核与继续教育得相关制度与实施记录。 四、房屋与设施 (一)医疗用房使用面积不少于总面积75%,房屋应当具备双路供电或应急发电设施,重要医疗设备与网络应有不间断电源、 (二)设置1个临床检验专业得,建筑面积不少于500 平方米;设置2个以上临床检验专业得,每增设1个专业建筑面积增加３０0平方米。

体外细胞实验方法

细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。 从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。 #22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司 (12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反 γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572) 从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和 anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体 购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。 CRISPR / Cas9敲除 (sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。 LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染 sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆 抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。 重组蛋白表达和下拉试验。 构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列 被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞 然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物 用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化 分别是GST和GST- uchl3蛋白。 体外GST-UCHL3拉试验,50μg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50μg His-UCHL3额外2 h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3 体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验 对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除 U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1

免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较

IVD-体外诊断产品-行业记录资料

IVD-体外诊断产品-行业记录 (2014-03-22 16:59:43) 转载▼ 标签： 总要 防疫站 生产商 生产厂家 护城河 1. 什么是体外诊断（IVD）行业？ IVD是指在人体之外通过对人体的血液等组织及分泌物进行检测获取临床诊断信息的产品和服务。我国医院里俗称的“检验检查”中的“检验”包括了IVD的大多数细分种类——如①生化诊断（clinical chem）、②免疫诊断（immunoassay）、③分子诊断（MDx）、元素诊断、微生物诊断、尿液诊断、凝血类诊断、组织诊断、血液学和流式细胞诊断等。其中前三类为我国医疗机构的主流IVD方式。 诊断试剂分类 体外诊断主要细分领域情况

国内主要IVD企业 国内IVD上市公司各自优势领域和市场地位 上市公司传统优势领域目前市场地位 科华生物免疫诊断在国内率先研制出酶联免疫法乙肝二对半试剂盒，标志着中国酶免疫试剂盒开始进入大规模商品化生产时代。目前生化和核酸诊断业务成为公司发展亮点。 达安基因分子诊断始终立足于核酸诊断，目前国内临床最大的PCR试剂供应商，市场占有率60%左右。拥有先进的技术平台。 利德曼生化诊断走高端路线的生化诊断试剂供应商。目前正在向化学发光领域进军。 中生北控生化诊断曾经是国内生化诊断领域的领军企业，目前市场地位逐渐被科华生物、利德曼和深圳迈瑞所取代。 阳普医疗耗材（第三代国内第三代真空采血管生产企业，面对国内、外市场。产真空采血管）品在部分国家和地区的市场占有率较高。博晖创新微量元素检测国内微量元素检测领域的龙头，产品市场占有率超过50% 九安医疗血压计和POCT 主要从事血压计生产和销售，目前重点领域在快速血糖检测。主要面对国外市场。 三诺生物 POCT 国内血糖快速检测龙头，主要面向国内市场 迪安诊断独立医学实验室浙江地区最大的罗氏诊断试剂代理商；国内主要的综合性连锁独立医学实验室之一，净利润率最高。

免疫组化超详细步骤

免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序

体外细胞培养

第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等

免疫组化入门实验操作

免疫组化入门实验操作 一、实验目的： 1.了解免疫组化基本原理。 2.了解免疫组化实验操作及注意事项。 3.免疫组化结果判定。 通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。 二、实验原理： 三、实验材料： 一抗：CD5、CK8、Ki67 二抗：MaxVision3 其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。 四、实验步骤：

1.脱蜡水化 二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。 2.抗原修复 高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时 1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。 3.过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴）过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3×3min。 4.一抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3×3min。 5.二抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3×3min。 6.DAB 甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色5分钟，自来水冲洗。 7.苏木素复染 每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30秒后自来水冲洗30s以上，或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。 8.封片 梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。

USP87细胞毒性体外试验

87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified

免疫组化原理、步骤及要注意的事项

免疫组化 一，免疫组织化学简介 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 三，免疫组化步骤 1，切片，烤片60℃，1h； 2，脱蜡及复水 二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min； 3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min； 4，微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次； 5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；

体外诊断试剂行业一定要知道的几个概念

一、关于试剂盒的两个必须搞清楚的概念 关于体外诊断试剂盒我认为最重要的就是下面这两个概念，如果你深刻的理解了这两个概念，对于今后的产品研发、实验室检测都会有很大的帮助。 1、体外诊断试剂：是指按医疗器械管理的体外诊断试剂，包括在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的试剂、试剂盒、校准品、质控品等产品。可以单独使用，也可以与仪器、器具、设备或者系统组合使用。 2、体外诊断试剂盒：顾名思义就是具有上述体外诊断功能，可以方便实验人员使用的将各检测组分组成起来配有进行分析或测定所必需的全部试剂的成套用品。 二、关于产品必须搞清楚的概念 体外诊断试剂盒是经过原材料采购、生产过程转化之后的一个产品，无论这个生产过程多么的简单，多么的手工化，作为经历过一个生产过程的产品，我们必须清楚的知道： 1、产品：在百度百科中对产品是这样解释的：人们向市场提供的能满足消费者或用户某种需求的任何有形物品和无形服务。而狭义的产品是指被生产出的物品。针对体外诊断试剂盒来说，应该是符合产品的狭义的概念的。

2、产品标准：既然产品是经生产出来的物品，那么原材料经过这样一个生产过程之后，是否符合产品的预期要求呢？该如何评估一个特定的产品的内在质量呢？于是，就建立了产品标准这样的概念。 对产品结构、规格、质量和检验方法所做的技术规定，称为产品标准。产品标准按其适用范围，分别由国家、部门和企业制定；它是一定时期和一定范围内具有约束力的产品技术准则，是产品生产、质量检验、选购验收、使用维护和洽谈贸易的技术依据。 3、产品标准和企业标准的区别 产品标准就是针对产品而制定的技术规范，在我国针对产品而制定的技术规范有国家标准、行业标准、地方标准和企业标准四种。 企业标准就是企业是对企业范围内需要协调、统一的技术要求、管理要求和工作要求所制定的标准，它是企业组织生产、经营活动的依据。企业标准一般分为产品标准、方法标准、管理标准和工作标准。 产品标准和企业标准是相互联系、相互包含的关系，即产品标准有企业标准，企业标准中有产品标准。但是，产品标准和企业标准的根本区别是从不同角度来定义的，即产品标准是从制定标准的客体(对象)——产品而定义的，企业标准是从制定标准的主体——企业而定义的。 在我们日常生活中，所常见的企业标准大多是产品标准，实际上准确的说法应该是企业产品标准，也就是企业对所生产的产品而制定的技术规范。 三、关于产品标准中几个相关概念 1、准确度 准确度是指在一定实验条件下多次测定的平均值与真值相符合的程度，以误差来表示。它用来表示系统误差的大小。在实际工作中，通常用标准物质或标准方法进行对照试验，在无标准物质或标准方法时，常用加入被测定组分的纯物质进行回收试验来估计和确定准确度。 在一个特定的产品中，其有可能会被符合率（定性产品）和回收率（定量产品）这样的指标代替。 2、精密度 化学分析中，精密度是指使用特定的分析程序，在受控条件下重复分析测定均一样品所获得测定值之间的一致性程度。精密度决定于偶然误差（过失除外），表

细胞克隆形成实验

机密提醒：这份文件及其传真件、复印件所包含的机密或法律保护信息是只提供给这份文件上所指定的个人或机构。如果您不是预定接受者，我们提醒您严禁以披露、拷贝、散发或任何形式利用这份文件及其传真件、复印件的内容。如果您错误的接收到这份文件及其传真件、复印件，请立即通知我们以便我们可以安排文件及其传真件、复印件返还并不会让您负担任何费用。 第 1 页 共 1 页 细胞克隆形成实验 一、 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。[晶莱生物] 二、实验方法 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 三、注意事项 (a)琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装； (b)细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； (c)软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞； (d)接种时细胞密度适度，不可过高。 细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 四、周期 1-2个月

免疫组化实验步骤

免疫组化实验步骤 Revised final draft November 26, 2020

石蜡切片免疫组化实验步骤 石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）： 1）材料的准备 在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存： 无水乙醇50ml 冰醋酸5ml 37%甲醛10ml 水35ml 第一天：组织固定 用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。 第二天：脱水 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。 *组织可在70%ethanol4℃可存放几个月 第三天：进一步脱水和浸蜡 以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇

以下所有步骤在室温进行并不时轻摇 准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡 第四天：浸蜡2 将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。 第五天：浸蜡3 换蜡两次（ParaplastPlus） 第六天：浸蜡4 换蜡两次（ParaplastPlus） 第七天：浸蜡5 换蜡两次（ParaplastPlus） 准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）

第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后： 开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。 用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。 第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol） （用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升） 抗原修复： 在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！！！） 将片子浸入PBS（PH=7.4）5min。

医学检验实验室管理方案计划规范标准设计

医学检验实验室管理规范 （试行） 为加强对医学检验实验室的管理工作，提高医学检验水平，保证医疗质量和医疗安全，根据《执业医师法》、《医疗机构管理条例》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《医疗废物管理条例》、《医疗器械监督管理条例》及《医疗机构临床实验室管理办法》等有关法律、法规，制定本规范。本规范适用于独立设置的对人类血液、体液、组织标本开展临床检验的医疗机构，不包括医疗机构内设的医学检验科。 一、机构管理 （一）医学检验实验室应当制定并落实管理规章制度，执行国家制定颁布或者认可的技术规范和操作规程，明确工作人员岗位职责，落实医院感染预防和控制措施，保障临床检验工作安全、有效地开展。 （二）医学检验实验室应当设置独立实验室质量安全管理部门或配备专职人员，负责实验室质量管理与控制工作，履行以下职责： 1.对规章制度、技术规范、操作规程的落实情况进行检查； 2.对医疗质量、医院感染管理、器械和设备管理、一次

性医疗器具管理等方面进行检查； 3.对重点环节，以及影响诊断质量和医疗安全的高危因素进行监测、分析和反馈，提出预防和控制措施； 4.对工作人员的职业安全防护和健康管理提供指导； 5.预防控制医学检验实验室的污染物外泄及医院感染； 6.对医学检验实验室的诊断报告书写、保存进行指导和检查，对病理检查病例信息登记进行督查，并保障登记数据的真实性和及时性； 7.对设置的试剂、仪器耗材、辅助检查和消毒供应部门进行指导和检查，并提出质量控制改进意见和措施。 （三）医学检验实验室质量安全管理人员应当具有中级以上专业技术职务任职资格，具备相关专业知识和工作经验。 （四）财务部门要对实验室业务费用和检验项目费用结算进行检查，并提出调控措施。 （五）后勤管理部门负责防火、防盗、医疗纠纷等安全工作。 二、质量管理 医学检验实验室应当按照以下要求开展医疗质量管理工作： （一）应当以ISO15189：2012为质量管理的标准，建立并实施医学检验质量管理体系，遵守相关技术规范和标

《分子实验》06 免疫组化实验

免疫组化操作步骤 （一）、仪器设备 1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉. 2. 水浴锅 （二）、试剂 1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用 10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml. 4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。 5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制 7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制 8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟

b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95%乙醇中浸泡五分钟 d 75%乙醇中浸泡五分钟 2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： A 抗原热修复 a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等 B 酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等 3、免疫组化染色SP法 （1）脱蜡、水化 （2）PBS洗2-3次各5分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟