网卡启动克隆-批量装机

批量装机与系统快速恢复

对于公司新运来的一批新机器，需要安装新的操作系统，对于网管来说，这既是挑战也是对个人能力的锻炼。按照正常思路来说，这需要我们亲手一个一个的将机器装上操作系统。十台以内还好说，一天下来也就好了，但是对于几十台的数量，估计谁都没有耐心去弄了。再有公司里边有的机器上需要安装一些软件，再去一台一台的去装，那非让人崩溃死了不可。想提高效率，改变装机方式是一个很明智的选择。现在的主板基本上都支持系统从网卡引导，所以能不能利用网卡启动？再利用交换机让几十台机器联到一台机器上做系统恢复呢？答案是肯定的！下面就来介绍一款简单实用的批量装机工具——奇东锐腾PXE全自动网克工具。

对于这一款软件，只有一个exe文件，集成度高，操作是流水式的，傻瓜但很智能。作为一批新采购的机器，他们的配置都是一样的，完全不用考虑硬件与驱动方面的不一致问题。那么首先我们需要找一台机器先安装好操作系统作为母机，同时在批量装机之前，我们要向客户公司询问机器上是否有共同的软件或者驱动要安装（比如illy公司，他们有一个Canon PCL5e/5c 打印机是集体共用的，所以所有机器上都需要安装这个驱动，那么我们就在母机上安装上这个驱动），将机器上共用的软件都装完后，确保系统是否已激活，保证装好的系统是稳定可靠安全快速的。安装完后我们利用GHOST系统盘里将母机做一个全盘备份（包括分区状况），这样我们得到一个自己命名的.gho文件，可能会稍微大了一些，需要硬盘有足够的空间存储。另外公司有多个部门，各个部门有各自的软件，根据情况可以自己选择生成镜像批量安装，或者安装完基本系统后手动依次安装。

做好了母机系统的GHO镜像备份，我们将需要装系统的机器全部打开，用网线、交换机和母机搭建成一个局域网，客户机开机选择网卡PXE启动（对于illy公司的HP一体机，开机按Esc键，进入启动菜单，然后等待不要动），之后我们启动“奇东瑞腾PXE全自动网克工具”按照下图操作：

图1：启动软件

图2：选择“本地连接”

下边右图中应该选择“对全盘进行克隆”，这张图是做系统恢复时的截图。然后点击“开始网络克隆”。

图3：GHO文件选择母机镜像。

这时服务端等待客户端的接入，这时我们可以将所有机器回车选择PXE网卡启动。界面底部有链接的详细信息，我们可以通过“已连接客户端”数核对我们所要装的机器是否一致，如果少，看客户端网口绿灯是否闪烁，检查连线是否松动，可以重启再试一遍。

图4：等候客户端接入

若核对机器数量一致，那么点击“发送”，让服务器端向客户端恢复镜像。根据数据量的大小，看软件统计的剩余时间，这段时间，我们就可以上上网，聊聊天，等待传送完毕，机器会自动重启，我们只要检查是否有异常机器就可以了。

图5：正在发送数据

软件下载地址：https://www.wendangku.net/doc/c56693820.html,/file/c2eic25n#

奇东锐腾PXE全自动网克工具(支持市面上所有网卡).rar

网络克隆技术(图解)

网络克隆技术 在很多朋友都想学到网络克隆技术。但是网络上有那么几篇网络克隆的文章，并不是一那么准确。 所以这次小申子决定推出傻瓜教程系列第二弹.网络克隆篇。 本方法经过实验，绝对通过。而且只要网络好，系统没问题，绝对不会出现问题。 恩，好，不多说废话了，现在开始我们的教程。 首先.我们做好一张母盘.并将操作系统目录里的TEMP目录里的东西,以及临时文件夹全部清空.之后将母盘系统备份到另外一块硬盘上.首先确认备份的系统有一个比较大的分区.并确认能装下你的硬盘备份. 将准备好的另外一块硬盘挂在你做好的机器上.之后重新启动到DOS模式,启动GHOST.选择LOCAL→DISK→TO IMAGE.之后选择你的母盘,按回车 '

选择你你准备好的一个足够大的分区 给文件起个名字..按回车

它会问你压缩方式.选NO是不压缩.FAST是快速压缩.HIGH是高压缩率.由于我选的都是HIGH,而且从来没出过什么问题,在这里也推荐你使用.

因为FAT32格式分区最大只能识别2G的文件.所以每到达2G时候,会提示你会重新建立文件.

好了,文件建立完了,我们该建立GHOST服务器了.启动WINDOWS打开GHOSTSRV.EXE文件.我们讲在后面提供下载,也可以在GHOST企业版里找到.之后给服务器起一个名字.我起的名字是shenzi 选择克隆客户端 之后选择你备份到另外一个硬盘的备份文件. 点击接受客户的按扭

好了,现在服务器已经进入接收状态了. 之后到客户端,就是你准备要克地机器.在GHOST.EXE文件所在的目录里,创建一个WATTCP.CFG的文件.此文件是指定IP以及网关的.如果没有此文件GHOSTT会自动扫描DHCP服务器.不推荐使用DHCP服务器.所以我们用DOS的命令,EDIT建立一个WATTCP.CFG的文件吧. 在GHOST.EXE所在的目录里输入edit空格wattcp.cfg

植物基因启动子的克隆方法及其应用

分子植物育种，２００６年，第４卷，第３（Ｓ）期，第８５－９１页 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３（Ｓ），８５－９１ 专题报告 Ｒｅｖｉｅｗ 植物基因启动子的克隆方法及其应用 尹辉李丹张毅李秋莉﹡ 辽宁师范大学生命科学学院，大连，１１６０２９ ﹡通讯作者，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ 摘要植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点，启动子是基因表达调控的重要顺式元件，启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多，从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到ＰＣＲ方法的应用，此后相继问世的一些基于ＰＣＲ的克隆启动子技术，如载体锚定ＰＣＲ、反向ＰＣＲ、接头ＰＣＲ、交错热不对称ＰＣＲ等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方法。本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法，分析了它们的优缺点，并展望了今后的研究前景。 关键词启动子，启动子陷阱技术，反向ＰＣＲ，锚定ＰＣＲ，交错热不对称ＰＣＲ ＣｌｏｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ＹｉｎＨｕｉＬｉＤａｎＺｈａｎｇＹｉＬｉＱｉｕｌｉ＊ ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬｉａｏｎｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ，１１６０２９ ﹡Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｔｈｅｈｏｔｓｐｏｔｓｔｕｄｙｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｌｏｎｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｆｒｏｍｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｕｓｅｄｗａｙｔｈａｔａｐｐｌｙｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇｆｏｒｃｈｏｏｓｉｎｇｐｒｏｍｏｔ－ｅｒｔｏｔｈｅｕｓｉｎｇｏｆＰＣＲ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｌｏｔｓｏｆｗａｙｓｆｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇ．Ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ，ａｓｅｒｉｅｓｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｂａｓｅｄｏｎＰＣＲｆｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇｓｕｃｈａｓＡ－ＰＣＲ，Ｉ－ＰＣＲ，ＬＡ－ＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｙｏｆ－ｆｅｒｅｄｍｏｒｅｒｅｌｉａｂｌｅａｎｄｒｅａｓｏｎａｂｌｅｗａｙｓｏｆｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｓｏｍｅｗａｙｓｏｆｃｌｏｎｉｎｇｐｌａｎｔｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｗａｙｓｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｐｒｏｓｐｅｃｔｗａｓａｌｓｏｄｉｓ－ｃｕｓｓｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ． ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｒｏｍｏｔｅｒ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇ，Ｉ－ＰＣＲ，ＡｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ 启动子是ＲＮＡ聚合酶能够识别并与之结合、从而起始基因转录的一段ＤＮＡ序列，是基因表达调控的重要元件。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。植物基因启动子的克隆，对研究植物基因表达调控和构建表达载体至关重要。本文就近几年来克隆植物基因启动子的各种方法做一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。 １植物基因启动子克隆的几种方法 １．１利用常规ＰＣＲ技术克隆启动子 对于序列已知的启动子，只需要根据已知的启动子序列设计引物，然后采用ＰＣＲ扩增的方法就可以获得该启动子。该方法比较简便快捷，是近年来使用较为广泛的一种方法。 王利军等（２００４）根据ＧｅｎＢａｎｋ中拟南芥基因组序列中ａｔｓ１Ａ（核酮糖－１，５－二磷酸羧化酶小亚基）基因启动子的序列设计引物，以拟南芥总ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出ａｔｓ１Ａ的基因启动子区片段，将其克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，得到重组质粒并且进行测序，序列分析表明，所克隆的片段为１１１７ｂｐ，与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ａｔｓ１Ａ基因启动子序列比较，发现只在－７７６位缺失１个碱基。 该方法简便、快捷、操作简单，但不能克隆到全新的启动子。

整个基因克隆实验流程完整

一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

用3com dabs实现网络ghost详细教程

网络克隆软件或硬件一般都是利用多播服务来实现的，这些软件有好多，GHOST企业版应该是属于老大了，国产也有几个，但用得人似乎也不多，还原卡里自带的网络克隆挺好，但购买的人太少了，破解的又不能用。 要实现网络客户机的安装维护，网络克隆应该是个非常好的方法，不仅是初始安装还是日后维修维护，都不需要拆机，但没有软驱、光驱几乎是每一个网吧都这样，公司也并不一定都会有的，特别是一些人手一台且人很多的，BOSS都知道如何去省下这笔银子。 所需软件: 1. 3com dabs (提供TFTP无盘启动) 2. ghost 7.5/8.0企业版，为方便英文不好的朋友，在此使用7.5中文版 3. vmware虚拟PC的软件，不要用VIRTUAL PC，它不支持PXE ROM，此软件不是必需，是用来提供虚拟客户，相信很多朋友不会有二台以上机器的。 4. 操作系统，要NT以上的SERVER版，提供DHCP服务，好象XP PRO也有，不记得了。 这次要讲几个软件了，挺辛苦的。 所需硬件： 1. 一台电脑应该是需要了，作为服务器。 2. 客户机，要有支持PXE启动的ROM，写在主板里也可，此文不讲如何去写，如朋友有兴趣，我以后再贴。如果是网吧或公司那就正好了，够你玩得了。这才是实用的，并非测试了。 安装步骤： 这里可能要分三步来完成了， 一、软件安装； 二、服务器设置； 三，软件测试及使用。 先来讲一下预先需安装的软件： 一、VMW ARE WORKSTATION 4.5.1是一个虚拟PC的软件，可以让你一下子多出一个或N个电脑。很多情况下我们要测试系统或者玩黑客软件时及不想搞乱自己的系统来测试软件的，都用到这类软件，之所以选择它，是因其速度还可以，且支持PXE ROM启动，但其需要内存大，如果内存小的朋友请建虚拟机时把内存调小一点，否则启动不了虚拟机。 下载这个软件，直接点那个安装文件即可以了。出现安装向导，点“NEXT”，

DNA启动子概述

启动子概述 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子是一段位于结构基因5’-端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，并具有转录起始的特异性。基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物。启动子分三类：启动子Ⅰ、启动子Ⅱ、启动子Ⅲ.只有启动子Ⅱ指导mRNA的转录。真核生物启动子Ⅱ由两大部分组成：上游元件(upstream element)和启动子核心(core promoter)。上游元件与转录的效率有关；启动子核心包括3部分：TATA 盒、起始子(initinator)及下游元件(downstream element)。TATA盒为转录调控因子包括各种调节蛋白的结合区，与转录起始位点的精确选择及转录有关，起始子是转录起始所必须，下游元件作用尚不清楚。原核生物启动子区范围较小，包括TATAAT区(Pribnow区)及其上游的TTGACA区。 启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合位点的DNA序列，位于基因上游。启动子具有如下特征： 1序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框，序列框中碱基的变化会导致转录启动活性的改变。 2方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件，有单向启动子和双向启动子两类。 3位置特性。启动子一般位于所启动转录基因的上游或基因内的前端。处于基因的下4种属特异性。原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动 没有启动子，基因就不能转录。原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。启动子区域：（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T， 故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。 质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7,pMC1，PGK启动子等。一下介绍几个常见的启动子。 （1）U6启动子 U6是二型启动子，一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列。由Ⅲ类RNA聚合酶启动子U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果。这一类 启动子在腺病毒和慢病毒干扰载体的构建中应用很多。U6更多的是用在shRNA的启动，来达到敲低一个基因的作用。

基因克隆、假病毒操作步骤

实验名称：基因克隆 实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、 NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等； 操作步骤： 1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化， 在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）； 2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接 T4lages 1.0 10×T4buffer 2.0 EZ-T 1.0 目的基因8.0 DdH2O 8.0 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 20ul 3、取100μl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下 面的操作），加入10μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min； 4、加入500μl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并 使转化体产生抗药性； 5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200μl重悬菌体， 并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时； 6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振 荡培养3h； 7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定； 8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充 分混匀，-80℃保存；

基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/c56693820.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体

三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒

启动子克隆方法研究进展

启动子克隆方法研究进展 随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。 1启动子克隆的几种方法 1.1利用启动子探针载体筛选启动子 启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，包含2个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。 利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。 当插入段同时满足(1)具有基因启动子序列；(2)具有翻译启始区；(3)具有启始密码子；(4)插入方向正确；(5)插入片段3'端编码区序列抗性基因编码区读码框一致，则有可能形成有功能的抗性融合基因，从而启动抗性基因的表达。 最早由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核启动子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作为报告基因，Fodor等以大肠杆菌LacZ为报告基因，构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。构建启动子探针型载体，较为常见的检测标记基因有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、四环素抗性基因(Tet')和卡那霉素抗性基因(Kan')。近年来，人们渐渐较多地使用潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因作为检测标记基因。李维等曾构建了含有hph抗性基因的启动子探针型载体pSUPV8，直接在大肠杆菌中分离黄孢原毛平革菌基因的启动子。先用Sau3AI酶切黄孢原毛平革菌基因总DNA，再与用BamHI酶切后的pSUPV8相连，转化大肠杆菌，用间接筛选法从氨苄青霉素和潮霉素抗性平板上筛选重组子，得到6个双抗重组子(pCH1～pCH6)，电泳检测插入片段分别命名为CHl～CH6；再用原生质体转化法将重组子分别转化黄孢原毛平革菌，对获得的转化子进行复筛，仅pCH6的转化平板上有稳定生长的菌落，说明了CH6片段在黄孢原毛平革菌中具有启动基因表达的功能。该方法不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了引物设计，能获得大量的启动子片段。

植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤

植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means

based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

启动子克隆及活性分析

第6章CpLTP3、CpLTPI.4基因启动子克隆及瞬时表达分析 为了深入探索蜡梅nsLTPs基因家族4个成员CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3 、CpLTP4在表达和功能上存在差异的原因，需要进一步克隆各个成员的启动子，以便寻找调控方面的差异。我们利用hiTAIL-PCR法分离得到了CpLTP3、CpLTP4基因的启动子区域，并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析，另外两个基因启动子暂时没有得到成功分离，所以没有进行分析。 6.1 实验材料 6.1.1 植物材料 供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅，种植于西南大学校园内,常规管理。蜡梅小苗通过种子繁殖培育，种子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度85％，16h光照(2000Lx)，温度25℃，8h黑暗，温度20℃。烟草W38（Nicotiana tobacum cv. Wisconsin 38）由本实验室保存扩繁。 6.1.2 菌种和载体 大肠杆菌（Esherichia coli）菌株TOP10，为质粒转化受体菌由本实验室保存。 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404，用于农杆菌介导的烟草遗传转化，由本实验室保存。 克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121，具有Km抗性和完整的GUS基因表达元件，用于构建瞬时表达载体。 6.1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mgcl2、dNTP、T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司；DL2000、DNA Maker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成；氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)和卡拉霉素(Kanamycin,Km)均购自上海生物工程有限公司。 6.1.4 主要设备 紫外分光光度仪（岛津），高速冷冻离心机（HITACHI），台式冷冻离心机（Eppendoff），TGL-16B型台式离心机（上海安亭），Eppendorf PCR仪，IKA型 涡旋器（德国产），高压灭菌锅（日本产），超低温冰箱（sanyo），DYYIII型电泳 仪（北京六一厂），超净工作台（苏州净化设备厂），FR-1型凝胶成像系统（上海复日），722型分光光度计（重庆川仪九厂），恒温振荡摇床，恒温培养箱，水浴锅。

基因克隆步骤

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。

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网管必学：诚龙网维全自动PXE网刻工具图文教程 软件界面 设置完毕后，我们单击这里的“开始网克”，出现以下提示时，单击"确定"，服务器就准备完毕了； Ghost网克服务器 二、客户机的设置

现在的主板中，基本上都已经集成了网络启动功能，因此，我们只需要在BIOS 中，将第一启动设置为网卡启动就可以了； （小知识：有关主板如何设置网络启动，可以在主板说明书中找到；大家可以参考下说明书；如有任何问题，您也可以到： ask 来提问，我们将尽量详细为您解答；） 下面，我们将以老式REL8139网卡为例，说明如何进行网卡设置： Realtek RTL 8139网卡设置 按下电源开关，系统开始自检，当自检完硬盘、光驱后，出现以下提示： Realtek RTL 8139 (A/B/C)/RTL8130 Boot Agent Press Shift-F10 to configue…… 此信息默认为停留3秒钟，此时，按下SHIFT--F10进入网卡配置菜单，共有四个选择： 1． Network Boot Protocol (PXE RPL)按空格改变网络引导协议 2． Boot order (Rom Disable禁止BOOR ROM引导 Int 18h先从BIOS设置中的次序引导 Int19h先从BOOT ROM引导 PnP/BEV从BBS引导) 3． Show config Message (Enable Disable)启动时是否显示SHIFT—F10 4． Show Message time (3 seconds 4seconds 5seconds 8seconds 10seconds) 启动时shift—f10提示信息停留的时间。 新网卡的Boot order 选项为禁止BOOT引导，所以，所有新网卡必须进入设置程序，将其设为INT18 或INT19设置完毕后，按F4保存退出。

启动子(Promoters)克隆方法研究进展

启动子（Promoters）克隆方法研究进展 1启动子克隆的几种方法1.1利用启动子探针载体筛选启动子1.2利用PCR技术克隆启动子1.3环状PCR 1.4利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子1.5YADE法1.6TAlL-PCR 关键词：研究进展方法启动子Promoters克隆方法 随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。 1启动子克隆的几种方法 1.1利用启动子探针载体筛选启动子 启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，包含2个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。 利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。

当插入段同时满足(1)具有基因启动子序列；(2)具有翻译启始区；(3)具有启始密码子； (4)插入方向正确；(5)插入片段3'端编码区序列抗性基因编码区读码框一致，则有可能形成有功能的抗性融合基因，从而启动抗性基因的表达。 最早由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核启动子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作为报告基因，Fodor等以大肠杆菌LacZ为报告基因，构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。构建启动子探针型载体，较为常见的检测标记基因有β-半乳糖苷酶基因(lac Z)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、四环素抗性基因(Tet')和卡那霉素抗性基因(Kan')。近年来，人们渐渐较多地使用潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因作为检测标记基因。李维等曾构建了含有hph抗性基因的启动子探针型载体pSUPV8，直接在大肠杆菌中分离黄孢原毛平革菌基因的启动子。先用Sau3AI酶切黄孢原毛平革菌基因总DNA，再与用BamHI酶切后的pS UPV8相连，转化大肠杆菌，用间接筛选法从氨苄青霉素和潮霉素抗性平板上筛选重组子，得到6个双抗重组子(pCH1～pCH6)，电泳检测插入片段分别命名为CHl～CH6；再用原生质体转化法将重组子分别转化黄孢原毛平革菌，对获得的转化子进行复筛，仅pCH6的转化平板上有稳定生长的菌落，说明了CH6片段在黄孢原毛平革菌中具有启动基因表达的功能。该方法不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了引物设计，能获得大量的启动子片段。 1.2利用PCR技术克隆启动子 即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。 苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5'启动子序列的引物，以水稻叶绿体DNA为模板，PCR扩增出16SrRNA基因5'启动子区的片段，酶切克隆到p SK的SacI和SphI位点，构建测序载体质粒pZ16S，进行序列测定，结果表明所克隆的片

植物基因克隆实验指导

植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。

整个基因克隆实验流程(完整)

整个基因克隆实验流程(完 整) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研 钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置 3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相； RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个 新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心 5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室 温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，