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高通量测序问题

高通量测序问题
高通量测序问题

第二代高通量测序常见问题

1. 你们做不做第二代高通量测序?

Answer:我们是国内最早从事第二代高通量测序的单位之一,2007 年初就引入了454 测序系统,至2011 年底已经运行了300 多个完整反应,是目前国内运行量最大的454 测序平台。而2010 年引入Solexa 测序系统后,已经先后完成过包括人的肿瘤基因组测序,外显子捕获测序,RNAseq,小RNA 测序,大型真核生物基因组测序等不同的任务,基本处于饱和运转的状态。

2. 我想做第二代测序,你们是怎么收费的?

Answer:所有测序都是根据客户要做哪类测序(基因组、转录组还是分子生态等),选择哪种测序系统,测序的量,以及对分析的要求来确定收费标准的;所以需要客户先说明他想做的内容。微生物基因组部分:

3. 我有个细菌想测序,你们怎么收费?

Answer:细菌基因组测序,分为草图和完成图两种类型。

(1)草图:就是测序后直接拼装,得到的彼此没有关系的contigs 就称为基因组草图;如果做基因组草图,可以选择Solexa 或者454:用solexa 测序的话,一般我们是做100 倍覆盖率的pair-end 测序,通常是建300bp 插入片段的文库;用454 测序的话,就是做20 倍覆盖率的shotgun 文库。通常solexa 价格便宜,但得到的contigs 数目也多,并且拼装不够准确,不能用来构建完成图。而454测序拼装的结果非常准确,contigs 数目也少,一般会在100 个左右(只是统计值,不能向客户保证),而且能够在这个基础上做完成图。

(2)完成图:就是把所有的contigs 接起来,一般是通过PCR 等方法确定contigs之间的关系,并通过对PCR 产物进行常规测序,填补所有gap,最终得到一条完整的环状基因组序列(链霉菌是线性染色体,有些细菌是多条染色体)。在填补完所有gap 后,我们还会对测序中的低值区域进行补测,最后得到的序列精确度在99.99%以上,即错误率低于万分之一(1bp/10kb)。我们是目前国内做细菌完成图最多的单位,已经完成了近80 株细菌的完成图,合作单位发表的SCI 文章已有20 余篇。

(3)精细图:这是对真核基因组测序来说的,严格来说细菌不应该存在精细图这个概念,即使存在1 个gap,也应该称为草图。但由于市场上很多公司做gapclosing 做到最后有些gap 关不掉,就提出了这么一个概念。如果客户提出做精细图,想要向他讲明我们一般就是做草图和完成图,然后他如果需要精细图,我们就会在草图的基础上,加测一个solexa 的3kb 插入片段mate-pair,构建一个scaffold,即客户要求的精细图。价格根据客户需要做哪种测序来确定。

4. 你们细菌基因组测序,包括哪些分析?

Answer:我们一般测序完成后,无论草图还是完成图,都会帮助客户做基因预测,功能注释,COG 分析和代谢通路构建这几项基本分析。但如果客户需要更深入的比较基因组学分析,就需要收费。对于细菌基因组来说,所有的分析工作我们都可以完成,但除非是有科研合作的单位,否则我们不参与客户的文章写作。

5. 你们做不做真菌基因组测序?

Answer:我们至今已完成30 余株真菌的基因组测序工作。由于真菌一般是多条线性染色体,存在着丝粒和端粒等极难克隆和测序的区域,所以通常对真菌基因组都是以获得精细图为主。我们的做法有两种:

(1)以454 做20 倍覆盖率的shotgun 测序(一般先估计真菌的基因组大小为40Mb),拼装获得contigs;然后在此基础上,加测一个100 倍覆盖率的solexamate-pair 测序(3kb 插入片段),用以搭建scaffold。最终给客户的结果就是这个scaffolds,即精细图。

(2)以solexa 做100 倍覆盖率的pair-end 测序(一般建2 个不同插入片段的文库,我们通常做170bp 和500bp 两种),拼装获得contigs;然后再加测一个100 倍覆盖率的solexa mate-pair 测序(3kb 插入片段),用以搭建scaffold。最终给客户的结果就是这个scaffolds,即精细图。

(3)以454 为基础的精细图效果要好于以solexa 为基础的精细图,通常454拼装的contigs 数目在1000 个左右,scaffold 在50 个左右;而solexa 的结果就很难估计。

6. 做基因组草图或者精细图,你们能保证的contigs 或scaffold 数目是多少?

Answer:基因组测序拼装,受多个因素影响,包括基因组大小,覆盖率,重复序列等,其中重复序列影响最大,所以同样大小的基因组,拼装结果都会差异很大。因此除完成图外,通常我们不向客户承诺拼装的contigs 数目,只能告诉客户,一般细菌拼出来的contigs 数目在100 个左右(链霉菌会更高一些)真菌用454;测序,拼出来的contigs 在1000 个左右。

7. 高GC 含量的细菌如何做?

Answer:目前我们做的最多的细菌类群就是放线菌,包括链霉菌,结核分枝杆菌等,都是高GC 的。在早期我们向Roche 公司提出454 对高GC 的DNA 测序效果不好后,它们专门开发了additive,目前这个试剂已经添加在所有的454 测序试剂中,因此对于高GC 含量的细菌测系效果特别好。如果客户做链霉菌测序,尽量选用454 测序。如果是做结核分枝杆菌这种高度保守的细菌的重测序,可以考虑用solexa,但要告诉客户,像PE/PPE/PE-PGRS 等高GC 的区域是测不到的,或者说即使测到了也mapping 不上去。

8. 测序的完成时间,样本要求:

Answer:做细菌的草图都是2 个月以内,但454 基本可以在1 个月左右出来结果(建库和上机只要3 天,主要是要排队),solexa 由于在机器上就要10 多天,所以一般都要2 个月左右才能得到数据。对于细菌的完成图,我们的平均时间是6 个月;但像链霉菌等高GC 的菌,时间平均要9 个月。一般我们向客户承诺的时间都是8-12 个月。这个工作我们可以保证质量,但毕竟是实验的东西,无法保证时间。对于测序的样本,我们要求客户提供抽提好的DNA,浓度最好在50ng/ul左右,总量要达到5ug(通过凝胶电泳定量)。如果要做完成图,需要提供20ug以上的DNA。对DNA 要求是没有明显降解,OD260/280>1.8。

转录组测序部分:

9. 我要做RNA 测序或者转录组测序,如何做?

Answer:首先要明确客户的目的,是为了发现新基因,还是做表达谱分析(用测序代替芯片);再就是要询问客户要做的物种有没有已知的基因组序列。

(1)转录组测序:如果是全新的物种,还没有基因组,那么最好是用454 做转录组测序,即获得EST 序列,然后我们会对EST 序列进行拼装和注释,得到这个物种的转录本信息。如果客户不想做时期/组织间的比较,只是为了获得尽量多的基因信息,那么就推荐客户把几个不同处理/时期的样本混合在一起,做一份转录组测序。如果客户还想做丰度比较,就需要把几个样本分开,我们分别建库和测序。

(2)RNAseq:如果客户要做表达谱分析,基本就可以用solexa 做RNAseq,但前提是他的物种有已知的基因信息;否则我们得到的数据只能与近源物种做比对,匹配效率会低很多。一般RNAseq,每个样品测序得到500 万条序列,就可以达到饱和,代表这个样品的多数表达基因。因为目前我们solexa 测序都是做pair-end,所以承诺客户500 万条序列,我们实际是测500 万对(1Gb 的数据量)。

10. 用454 做转录组测序,我需要做多少测序量?平均长度是多少?可以保证拼出多少unigene?

Answer:一般来说,一个物种做一个完整反应的454 测序,可以获得80 万条以上的有效序列;通过拼装可以获得约2-3 万个EST cluster。但这些EST cluster有些是属于同一个基因的,只是中间没有测到或可变剪接的原因,导致无法拼到一起。对于新的物种。这样的情况我们是无法确定哪些EST cluster 是属于同一个基因的。因此,我们无法保证客户获得的unigene 数目,只能承诺测序得到的数据量。转录组测序序列平均长度要比基因组测序短,因为很多RNA 本身就很短,所以一般转录组测序我们承诺的平均长度要比基因组短100bp。目前我们是承诺客户平均长度为300bp;等到升级后我们可以承诺500bp。对于发现新基因来说,一般一个完整反应拼装得到的EST cluster 可以代表多数基因;但对于低丰度的基因还是难以发现,因此多数客户会选择做1-2 个run 的454 反应。

11. 转录组测序的分析内容:

Answer:对于454 的转录组测序,我们会负责拼装,CDS 预测,功能注释,GO分析和代谢通路构建;如果是多个样品需要比较,我们会负责丰度分析和富集分析。对于RNAseq,我们除提供丰富分析和富集分析,还会统计测序的饱和度等基本信息;并且也可以对一些无参考序列的RNAseq 进行拼装等类似454 的工作,但与454 使用的软件不同。

12. 我们需要提供给你们什么样品:

Answer:无论RNA 还是DNA 测序,我们都希望客户提供抽提好的核酸样本。对于基因组DNA,我们会进行16s/ITS 检测,以确保无污染;对于客户提供的RNA,我们会进行2100 检测,根据图谱和RIN 值来判断样本有无降解。

13. 需要的RNA 量是多少?

Answer:我们做454 转录组测序,需要2ug 的mRNA,所以最少需要客户提供100ug 的total RNA 给我们;如果是用Solexa 做RNAseq,需要的量可以少些,但最好也能提供到20ug 以上的总RNA。

14. 从提供样本到获得分析数据的时间?

Answer:454 测序和solexa 测序,一般是2 个月内完成;而分析则是在数据产生后的1 个月内完成。

宏基因组/分子生态部分:

15. 你们能否做宏基因组测序?

Answer:目前多数客户说的宏基因组测序,其实不是真正的宏基因组,而是16s测序,或称分子生态。所以客户询问这类问题时,先要向他确认他是要做16s/18s测序,即菌群结构分析;还是做宏基因组DNA 的测序,即功能分析。

(1)分子生态:即通过16s 测序来研究环境中的细菌种群组成,或通过18s/ITS研究环境中的真菌/原生动物等的组成。客户需要提供给我们扩增的PCR 产物;我们通过454 来对PCR 产物进行测序。

(2)宏基因组:通过对环境样本DNA 的测序,获得其中的遗传信息,特别是不可培养微生物的基因信息,以研究其功能。客户需要提供给我们抽提好的基因组DNA(要求与基因组DNA 一致);我们可以通过454 或者Solexa 进行测序。由于454 的序列相对较长,每个序列都可以代表一个基因,因此推荐客户进行454 测序。

16. 我要做16s 测序,最多一个反应可以做多少个样品?每个样品测多少数据量合适?我如何准备16s 测序的样本?

Answer:我们454 测序现在的通量是一个1/4 反应保证15 万条序,1/2 个反应保证40 万条,一个完整反应保证80 万条。序列的平均长度为400bp,但对于16s样本,多数人选择V3 或别的可变区,PCR 产物大小就只有200bp,所以这种情况我们签合同只保证数目,不承诺平均长度的。一般16s 测序是多个样品混在一起测序,每个样品平均获得2000 条以上序列就可以满足分析要求了。我们需要客户把样品等量混合好,如果他有100 份样本,最好对每份样本通过切胶纯化,定量后,等量混合,然后作为一份样本提供给我们,样本之间就靠在PCR 引物外侧连上barcode 来区别。一般PCR 产物大小在200-400bp 之间,总量需要达到2ug。等升级后,可以选择2-3 个可变区进行扩展那个。至于barcode,根据我们的经验,最好设计成8 个碱基,第一个碱基不能是G,不要出现碱基重复,如AA 这样的序列。并且以后面6 个碱基作为真正的标签使用,前面两个碱基就作为类似保护碱基一样的东西。这是一个barcode 的例子:ACTCGTCT。标签最好由客户设计,我们也可以提供一部分经常用的标签序列。

17. 多个样本混合在一起测序,能否保证样本间测序数量的均一性?

Answer:由于定量的误差,样本中小片段的存在,样本数目之间还是会有差异的,基本上从几百条到上万条都会有,所以要让客户计算的时候预先流出一个浮动的空间。

18. 做16s 测序,我的引物如何合成?

Answer:客户合成引物,一般有多少个样本,就需要合成多少对引物(引物序列都是一样的,差异就是加在引物5'末端的barcode 序列)。另外454 测序加上接头后,测序方向是随机的。所以客户如果想做定向测序,就必需在PCR 引物上加上454 的测序接头。即:

454Adaptor+barcode+16sPrimer 这样一个顺序。如果客户要做定向测序,我们可以提供序列;但如果客户是根据文献自己合成的,那么一定要在做前发来由我们确认。

19. 进行16s 测序你们一般进行哪些分析?

Answer:如下图所示,我们首先会根据barcode 区分样本,然后构建OTU,计算稀释曲线,Ace 等各种值,并进行物种分类。

20. 做宏基因组测序,一般多少数据量合适?

Answer:宏基因组测序,如果选择454,那么1-2 个run 的数据,可以得到多数中高丰度的基因序列;但要获得低丰度序列,可能做到100 个run 也拿不到,因为建议客户做1-2 个run 即可。如果选择做solexa 测序,一般做Hiseq2000的一个lane,即可得到30Gb 的数据。

21. 宏基因组的分析包括哪些内容?

Answer:我们的宏基因组分析包括菌群分析和功能分析两部分内容。菌群分析是利用数据中的16s 序列等进行OTU 分析,功能分析主要是CDS 预测,功能注释,COG 分类,代谢通路构建等工作。一般宏基因组数据我们是直接对所有reads 进行分析,但如果是solexa 测序结果,我们会先进行拼装。所有分析在数据产生后的一个月内完成。

真核基因组测序部分:

22. 基因组重测序,一般会进行哪些分析?

Answer:重测序的主要目的是把测序的reads mapping 到参考基因组序列上,看其中的SNPs 变化;所以我们的分析主要是mapping,鉴定SNPs,确定SNPs 对基因造成的影响等;并可根据拼装结果寻找SSR 序列。

23. 真核基因组拼装的覆盖率是多少?

Answer:向客户讲明,我们除了保证测序量的覆盖率(即基因组大小20 倍或者100 倍的测序覆盖率外),一般只有精细图才承诺拼装结果覆盖实际基因组的覆盖率,基本是保证,覆盖基因组的95%,基因区的98%。

24. 一个真核全基因组测序要多少钱?

Answer:因为真核基因组比较大,所以测序的费用较高,一般需要客户先确认基因组大小,至少估计出一个大小。然后看客户能否提供待测样品的单倍体(或自交系),以避免杂合对拼装的影响。我们测序一般都会采取454 和solexa 结合的方式,并且通过构建BAC 库或fosmid 库,来增加拼装的准确性。目前我们已经做过的真核基因组测序包括寄生虫,昆虫,植物等,基因组大小从100Mb-2.5Gb。

25. 一个测序反应的通量是多少?

Answer:对于454 系统,一个完整反应我们保证80 万条序列,1/2 反应保证40万,1/4 反应保证15 万。

对于Solexa 的Hiseq2000,一个lane 我们保证30Gb 的数据,序列长度是2x100bp。一个反应板有8 个lane,一次可以做2 块板,所以一个反应最多可一次产生500Gb 的数据。我们基本上有10 个左右的MID,可以保证一个lane 做10个不同的样本。

26.数据如何给客户?

Answer:我们所有的结果,包括原始数据,分析结果等都会以光盘形式提供给客户,并附有一个结题报告和文件说明。

高通量测序基础知识

高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序? 高通量测序技术(High-throughput sequencing,HTS)是对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing,NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序(一代测序) Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序(Genome Re-sequencing) 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序,并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低,人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序,实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点,以及结构变异等,具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序:其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序,利用生物信息学分析手段对序列进行拼接,组装,从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展,基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低,大规模基因组测序渐入佳境,基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力,可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序(whole exon sequencing) 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势,但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。

DNA测序结果分析

学习 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成,代表不同的碱基序列。测序图的两端(本图原图的后半段被剪切掉了)大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大,无法判读,这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时,要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近(通常要大于50个碱基距离),以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的,因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上,要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。由于临床专业的研究生,这些东西是没人带的,只好自己研究。开始时大概的知道等位基因位点在假如在测序图上出现像套叠的两个峰,就是杂合子位点。实际比对了数千份序列后才知道,情况并非那么简单,下面测序图中标出的两

个套峰均不是杂合子位点,如图并说明如下: 说明:第一组套峰,两峰的轴线并不在同一位置,左侧的T峰是干扰峰;第二组套峰,虽两峰轴线位置相同,但两峰的位置太靠近了,不是杂合子峰,蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成,此处的序列被机器误判为“C”,实际的序列应为“A”,通常一个高大碱基峰的前面1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰,峰的高度大约是高大碱基峰的1/2,离得越近受干扰越大。一个摸索出来的规律是:主峰通常在干扰峰的右侧,干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较;一个位点的多个样本相比较;你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。通常,对于一个疑似突变位点来说,即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话,那么单纯通过测序结果就判定它是突变点,是并不严谨的,因一份PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同,很难避免不产生误差的。对于一个未知

DNA测序技术的发展和其最新进展

DNA测序技术的发展及其最新进展 摘要:自从诺贝尔奖得主桑格于1977年发明了第一代DN测序技术以来,DNA测序技术已经作为重要的实验技术广泛的应用于现代生物学研究当中。经过了几十年的发展,DNA测序技术日臻成熟,并且以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经诞生。本文主要就每一代测序技术原理和特点及其最新进展做简要介绍。 关键词:DNA测序技术;第三代DNA测序技术;最新进展 The Development and New Progress of DNA Sequencing Technology Abstract: Since Nobel Prize Winner Sanger have founded the first generation of DNA Sequence technology in 1977, DNA sequencing technology has been widely used in modern biological researches as an important experimental. Over decades of year’s development, DNA sequence technology mature gradually and the third generation sequencing technologies characterized by single-molecule sequencing have also emerged. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their latest progress will be discussed here. Key Words: DNA Sequence technology ; third generation DNA sequencing ;latest development 1.引言 DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后[1],人类就开始了对DNA序列的探索,在世界各地掀起了DNA测序技术的热潮。1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法[2]。同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法[3]。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,推进相关领域生物学研究。本文主要介绍DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点,并针对目前新一代DNA测序技术及目前国际DNA测序最新进展做简要综述。

高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)

基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序,是首次对一个物种的基因组进行测序,用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装,从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种: 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序; 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序; 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序,搭建骨架,再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序,完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件,并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究,为后续的相关研究奠定基础。 实验流程: 公司服务内容 1.基本服务:DNA样品检测;测序文库构建;高通量测序;数据基本分析(Base calling,去接头, 去污染);序列组装达到精细图标准 2.定制服务:基因组注释及功能注释;比较基因组及分子进化分析,数据库搭建;基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求?

(1) 对于细菌真菌,样品来源一定要单一菌落无污染,否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上), OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;每次样品制备需要10 μg样品,如果需要多次制备样品,则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物,样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品,最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上),OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;样品总量不小于500 μg,详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物,样品来源应选用肌肉,血等脂肪含量少的部位,同一个体取样,最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上),OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;样品总量不小于500 μg,详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证,用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454,Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中,Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp,经常用于基因组骨架的组装,而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例,对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段,引物序列连接到DNA片段的一端,然后末端加上接头,将片段固定在flow cell上生成DNA簇,上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点,在第一轮测序完成后,去除第一轮测序的模板链,用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增,以达到第二轮测序所用的模板量,进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法

转录组测序技术的应用及发展综述

转录组测序技术的应用及发展综述 摘要:转录组测序(RNA-Seq)作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序,通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量,发现新的转录本;如果有基因组参考序列,可以把转录本映射回基因组,确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息,已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台,着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析,并就RNA-Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容,为今后该技术的研究与应用提供参考。 关键词: RNA-Seq;原理应用;方法;挑战;发展前景 Abstract:Transcriptome sequencing (RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome. RNA-Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads) numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence, the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information, has been widely used in biological research, medical research, clinical research and drug development. This paper compared several methods of platform transcriptome studies and several kinds of RNA-Seq in recent years, RNA-Seq focuses on the principle, purpose, steps and bioinformatics analysis, and discusses the RNA-Seq technology challenges and future development prospect and the application in related field and other content, provide the reference for the research and application of the technology future. Key word:RNA-Seq ;application; principle; method; challenge; development prospects

高通量测序RNA-seq数据的常规分析

案例一 虽然RNA-seq早已被大家所熟知,特别是在高通量测序越来越便宜的今天,但是RNA-seq数据的分析仍令多数小菜抓狂。多个软件的使用,参数设置,参考基因组准备,输出结果的解读等等,都让很多初次接触测序数据或者非生物信息专业的人头疼不已。 哈哈,不用怕,有云生信,这都不是事儿!今天我就向大家简单介绍一下如何用云生信做RNA-seq数据的常规分析。不过在此之前,我要稍稍啰嗦一下RNA-seq的常规分析流程,请不要拍砖头。图1是RNA-seq数据从产生到分析的常规分析流程:根据实验设计,提取细胞RNA,并将RNA提交给测序公司,就可以坐等测序数据了。测序公司会根据客户提供的RNA进行建库,上机测序。拿到测序数据后,就到了我们大显身手的时候了。首先,我们要对测序结果做个简单的质量评估,剔除低质量的数据。然后,根据基因组数据(这里我们讲的是基因组数据已知的物种,基因组未知的有套独立的流程,这里不讲),将测序数据组装。根据组装结果,计算基因或转录本的表达量。最后,同芯片数据一样,我们可以根据表达量数据做很多分析,如差异表达分析,网络分析(包括蛋白互作网络,共表达网络等),也可以结合临床数据做分析(如预后,亚型分类、关联,药效等)。 图1. RNA-seq常规分析流程

叨叨完毕,进入正题。 进入尔云后,打开“测序数据处理”模块,我们会看到图2的结果。在这一模块,我们可以完成RNA-seq数据分析的前两步:1、数据质控和过滤低质量数据;2、基因组组装,计算基因表达量。对于上面两部,尔云又根据是双端测序还是单端测序,分了两块。以edgeR 为例,输出的DEGs.txt就是根据我们设定的参数得到的差异表达基因的列表,有geneSymbol, logCPM, PVlue信息。 图2. 测序数据处理模块 质控结束后,尔云会给出全部的质控结果。图3是以demo数据为例的双端测序的质控结果,好多好多呀,可以下了慢慢看。建议主要关注一下xxx_qc_TABLE,该表格是对质控前后的数据统计,反应了测序的好坏。Clean_xxx.fq是质控后的干净的fastq数据,是第2步组装的输入文件。 图3.质控结果 组装完成后,会返回一个expression.txt的表达矩阵文件,该文件是下一步差异表达分析的输入分析。 得到表达矩阵后,我们就可以进入到第3步差异表达数据分析。进入尔云的“差异分析”模块(如下图所示),它针对芯片和测序两种检测技术提供了不同的分析方案。对于RNA-seq

高通量测序的生物信息学分析

附件三生物信息学分析 一、基础生物信息学分析 1.有效测序序列结果统计 有效测序序列:所有含样品barcode(标签序列)的测序序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 注:合同中约定测序序列条数以有效测序序列为准。 图形示例为: 2.优质序列统计 优质序列:有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 图形示例为:

3.各样本序列数目统计: 统计各个样本所含有效测序序列和优质序列数目。 结果示例为: 4.OTU生成: 根据序列的相似性,将序列归为多个OTU(操作分类单元),以便后续分析。 5.稀释曲线(rarefaction 分析) 根据第4条中获得的OTU数据,做出每个样品的Rarefaction曲线。本合同默认生成OTU相似水平为0.03的rarefaction曲线。 rarefaction曲线结果示例:

6.指数分析 计算各个样品的相关分析指数,包括: ?丰度指数:ace\chao ?多样性指数:shannon\simpson ?本合同默认生成OTU相似水平为0.03的上述指数值。 多样性指数分析结果示例: 注:默认分析以上所列指数,如有特殊需要请说明。 7.Shannon-Wiener曲线 利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线,反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时,说明测序数据量足够大,可以反映样品中绝大多数的微生物信息。绘制默认水平为:0.03。 例图:

8.Rank_Abuance 曲线 根据各样品的OTU丰度大小排序作丰度分布曲线图。结果文件默认为PDF格式(其它格式请注明)。 例图: 9.Specaccum物种累积曲线(大于10个样品) 物种累积曲线( species accumulation curves) 用于描述随着抽样量的加大物种增加的状况,是理解调查样地物种组成和预测物种丰富度的有效工具,在生物多样性和群落调查中,被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度( species richness) 的估计。因此,通过物种累积曲线不仅可以判断抽样量是否充分,在抽样量充分的前提下,运用物种累积曲线还可以对物种丰富度进行预测。

DNA测序常见问题及分析

DNA测序过程可能遇到的问题及分析 对于一些生物测序公司(如Invitrogen等),我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题,但几天后的测序结果却无法另人满意。 为什么呢? PCR产物直接进行测序,在PCR产物长度以后将无反应信号,机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基,我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理,通常PCR产物结束的位点,PCR产物测序一般末端的一个碱基为A(绿峰),也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。 N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起,有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时,在序列的起始端的小片段容易丢失,导致起始区信号过低,机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基(ABI3730可以达到1200bp),但是,只有一般600bp以前的碱基是可靠的,理想条件下,多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列,由于测序毛细管胶的分辩率问题,会有许多碱基分不开,就会产生N值。测序模板本身含杂合序列,该情况主要发生在PCR产物直接测序,由于PCR产物本身有突变或含等位基因,会造成在某些位置上有重叠峰,产生N值。这种情况很容易判断,那就是整个序列信号都非常好,只有在个别位置有明显的重叠峰,视杂合度不同N值也不同。 测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的,所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物 (<600bp),可以用另一端的引物进行测序,从另一端测序可以一直测通,可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列,一个测序反应测不通,就只能将PCR产物片段克隆到载体中,用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间

三代测序原理技术比较

导读从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)1,发展至今三十多年时间,测序技术已取得了相当大的发展,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再从短到长。 摘要:从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)1,发展至今三十多年时间,测序 技术已取得了相当大的发展,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置,但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革,也都对基因组研究,疾病医疗研究,药物研发,育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1:测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上(图1)所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来,整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格(Sanger)和考尔森(Coulson)开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)发明的化学法(链降解). 并在1977年,桑格测定了第一个基因组序列,是噬菌体X174的,全长5375个碱基1。自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年,完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础,Sanger法核心原理是:由于ddNTP的2’和3’都不含羟基,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA 合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列(图2)。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片,形象而生动。 值得注意的是,就在测序技术起步发展的这一时期中,除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术,如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中,焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4,但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

高通量测序及分析

高通量测序与功能分析 微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序,通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系,寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类,一类是通过16s rDNA,18s rDNA,ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性;还有一类是宏基因组测序,是不经过分离培养微生物,而对所有微生物DNA进行测序,从而分析微生物群落构成,基因构成,挖掘有应用价值的基因资源。 以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析,目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析,大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。 目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种(species)(一般只能对部分菌进行种的鉴定),甚至对亚种级别进行分析, 几个概念: 16S rDNA(或16S rRNA):16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为1542bp,其分子大小适中,突变率小,是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系,而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。 OTU:operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到,通过提取样品的总基因组DNA,利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增,通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性,那怎么区分这些不同的序列呢,这个时候就需要引入operational taxonomic units,一般情况下,如

DNA测序结果分析比对(实例)

DNA测序结果分析比对(实例) 关键词:dna测序结果2013-08-22 11:59来源:互联网点击次数:14423 从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式的测序图两个文件,下面是一份测序结果的实例: CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1 CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq .seq文件可以用系统自带的记事本程序打开,.ab1文件需要用专门的软件打开。软件名称:Chromas 软件Chromas下载 .seq文件打开后如下图: .ab1文件打开后如下图: 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成,代表不同的碱基序列。测序图的两端(下图原图的后半段被剪切掉了)大约50个碱

基的测序图部分通常杂质的干扰较大,无法判读,这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时,要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近(通常要大于50个碱基距离),以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的,因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上,要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰,就是杂合子位点。实际比对后才知道,情况并非那么简单,下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点,如图并说明如下:

说明: 第一组套峰,两峰的轴线并不在同一位置,左侧的T峰是干扰峰;第二组套峰,虽两峰轴线位置相同,但两峰的位置太靠近了,不是杂合子峰,蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成,此处的序列被机器误判为“C”,实际的序列应为“A”,通常一个高大碱基峰的前面 1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰,峰的高度大约是高大碱基峰的1/2,离得越近受干扰越大。 一个摸索出来的规律是:主峰通常在干扰峰的右侧,干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较;一个位点的多个样本相比较;你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。 通常,对于一个疑似突变位点来说,即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话,那么单纯通过测序结果就判定它是突变点,是并不严谨的,因一份 PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同,很难避免不产生误差的。对于一个未知突变位点的发现,通常还需要用到更精确的酶切技术。 (责任编辑:大汉昆仑王)

测序技术的发展历程

测序技术的发展历程 随着1953年沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构,到2001年,首个人类基因组图谱的绘制完成,人们越来越多的认识到测序在生物医学中的重要作用。 测序技术的发展历史 Sanger测序技术 1975年由桑格和考尔森开创的链终止法测序技术标志着人类第一代DNA测序技术的诞生。1977年,人类历史上第一个基因组序列噬菌体X174由桑格团队测序完成。自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步入基因组学时代。 SangerJ.D. Waston、F.Crick

虽然第一代测序技术的测序读长可达1000bp,准确性高达99.999%,但其测序成本高,通量低等方面的缺点,严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。从那时起人们开始了二代测序技术的探索。 第二代测序技术 第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis),在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。 现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX(已宣布停产)、Illumina Hiseq Miseq等系列和Applied Biosystems SOLID system。 Roche/454 FLX Illumina Hiseq 2500 AB SOLID 第三代测序技术 第二代测序技术虽然较Sanger测序有了巨大的突破,但是其测序的理论基础仍然建立在PCR扩增的基础之上。为了有效的避免测序过程中由于PCR扩增带来的偏差,科学家们积极投身到第三代单分子测序仪研究当中。目前最具代表性的包括Heliscope单分子实时合成测序法,纳米孔测序技术等。

高通量测序:第二代测序技术详细介绍

在过去几年里,新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展,各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术(next-generation sequencing),是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确,可以产生长的读长而被广泛应用,但是它的致命缺陷是相当慢。十三年,一个人类基因组,这显然不是理想的速度,我们需要更高通量的测序平台。此时,新一代测序技术应运而生,它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段,然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解,是先将基因组DNA 片断化,然后克隆到质粒载体上,再转化大肠杆菌。对于每个测序反应,挑出单克隆,并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的,荧光标记的产物梯度,在测序仪的96或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时,四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中,片断化的基因组DNA 两侧连上接头,随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列(polony)。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行。同样地,每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa高通量测序原理

--采用大规模并行合成测序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术(ReversibleTerminatorChemistry) --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究 ----将接头连接到片段上,经PCR扩增后制成Library。 ----随后在含有接头(单链引物)的芯片(flowcell)上将已加入接头的DNA片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上,另一端和附近的另外一个引物互补也被固定,形成“桥” ----经30伦扩增反应,形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序(Sequencing By Synthesis)的原理,加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”,其3’羟 基末端带有可化学切割的基团,使得每个循环只能掺入单个碱基。此时,用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后,将这些基团化学切割,恢复3'端粘性,继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样,统计每轮收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp,更长的读长也能实现,但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响,如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段= 一个磁珠= 一条读长(One fragment =One bead = One read)”1)样品输入并片段化:GS FLX 系统支持各种不同来源的样品,包括基因组DNA、PCR 产物、BAC、cDNA、小分子RNA 等等。大的样品例如基因组DNA 或者BAC 等被打断成300-800 bp 的片段;对于小分子的非编码RNA 或者PCR 扩增产物,这一步则不需要。短的PCR 产物则可以直接跳到步骤3)。 2)文库制备:借助一系列标准的分子生物学技术,将A 和B 接头(3’和5’端具有特异性)连接到DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化,扩增和测序步

高通量测序中常用的生物信息分析名词解释

高通量测序中常用的生物信息分析名词解释 1. 什么是Read? 高通量测序平台产生的序列就称为reads。 (测序读到的碱基序列片段,测序的最小单位;) 2. 什么是Contig? 拼接软件基于reads之间的overlap区,拼接获得的序列称为Contig(重叠群)。 (由reads通过对overlap区域拼接组装成的没有gap的序列段;) 3. 什么是Scaffold? 基因组de novo测序(没有参考基因组的测序,需要研究人员从头拼接得到的序列),通过reads拼接获得Contigs后,往往还需要构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库,以获得一定大小片段(如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb)两端的序列。基于这些序列,可以确定一些Contig 之间的顺序关系,这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。 (通过pair ends信息确定出的contig排列,中间有gap) 4. 什么是Contig N50? Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加,能获得一个Contig总长度。然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序,如获得Contig 1,Contig 2,Contig 3...………Contig 25。将Contig按照这个顺序依次相加,当相加的长度达到Contig总长度的一半时,最后一个加上的Contig长度即为Contig N50。举例:Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig总长度*1/2时,Contig 4的长度即为Contig N50。

基因芯片与高通量测序

基因芯片: 将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400 )探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说,就是通过微加工技术,将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA 片段(基因探针),有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片等支持物上,构成的一个二维DNA探针阵列,与计算机的电子芯片十分相似,所以被称为基因芯片。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度最强的探针位置,获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因探针是人工合成的碱基序列。,所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列,在探针上连接一些可检测的物质,根据碱基互补的原理,利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术,把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面,可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析 基因芯片制作 、芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体,采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外,还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。 2、样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体,除少数特殊样品外,一般不能直接与芯片反应,有时样品的量很小。所以,必须将样品进行提取、扩增,获取其中的蛋白质或DNA、RNA,然后用荧光标记,以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 3、杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中,减少生物分子之间的错配率。 4、信号检测和结果分析 杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像,将荧光转换成数据,即可以获得有关生物信息。基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统(micro total analytical system)或称缩微芯片实验室(laboratory on a chip)。使用缩微芯片实验室,就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。

高通量测序(NGS)数据分析中的质控

高通量测序错误总结 一、生信分析部分 1)Q20/Q30 碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标,质量值越高代表碱基被测错的概率越小。Q30代表碱基的正确判别率是99.9%,错误率为0.1%。同时我们也可以理解为1000个碱基里有1个碱基是错误的。Q20代表该位点碱基的正确判别率是99%,错误率为1%。对于整个数据来说,我们可以认为100个碱基里可能有一个是错误的, 在碱基质量模块报告的坐标图中,背景颜色沿y-轴将坐标图分为3个区:最上面的绿色是碱基质量很好的区,Q值在30以上。中间的橘色是碱基质量在一些分析中可以接受的区,Q值在20-30之间。最下面红色的是碱基质量很差的区。在一些生信分析中,比如以检查差异表达为目的的RNA-seq分析,一般要求碱基质量在Q在Q20以上就可以了。但以检查变异为目的的数据分析中,一般要求碱基质量要在Q30以上。 一般来说,测序质量分数的分布有两个特点: 1.测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。 2.有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高,质量值相对较低。

在图中这个例子里,左边的数据碱基质量很好,而右边的数据碱基质量就比较差,需要做剪切(trimming),根据生信分析的目的不同,要将质量低于Q20或者低于Q30的碱基剪切掉。

2)序列的平均质量 这个是碱基序列平均质量报告图。横坐标为序列平均碱基质量值,纵坐标代表序列数量。通过序列的平均质量报告,我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普遍过低的情况。一般来说,当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于30,可以判断序列质量较好。如这里左边的图,我们可以判断样品里没有显著数量的低质量序列。但如果曲线如右边的图所示,在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰,说明测序数据中有一部分序列质量较差,需要过滤掉。

高通量测序技术及原理介绍

高通量测序技术及原理介绍 高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(“Next-generation”sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 高通量测序技术应用测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展,科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(de novo sequencing),获得该物种的参考序列,为后续研究和分子育种奠定基础;对有参考序列的物种,进行全基因组重测序(resequencing),在全基因组水平上扫描并检测突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序(whole transcriptome resequencing),从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究;或者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing),通过分离特定大小的RNA分子进行测序,从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上,与染色质免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合,从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。 这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术(Targeted Resequencing)。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针,这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合,从而富集到特定区段,然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ,应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势,不仅仅是费用较低,更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小,与生物学表型结合更为直接。 目前,高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变,Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用Agilent SureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序,平均覆盖度为43倍,读长为50 nt,每

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