小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答cDNA差异表达分析(论文)
小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答cDNA 差异表达分析!
单
雷!!!
!赵双宜"!权太勇!夏光敏#!
（!山东大学生命科学学院济南250100）
（!
!山东省农业科学院高新技术中心济南250100）
摘要用银染DDRT-PCR 技术分析了小麦济南177和小麦与高冰草体细胞杂种耐盐品
系杂3号在盐胁迫前后基因的差异表达情况。并通过反向Northern 杂交筛选，获得27个阳性片段。从中选出10个候选片段进行序列分析，这些序列信息表明，其表达与盐胁迫应答有一定关系。Northern 杂交验证了差异片段wrsi-1在耐盐品系杂3号的根中受盐诱
导，可能为胁迫早期应答基因。关键词
盐胁迫，体细胞杂种小麦，mRNA 差异显示，差异表达
0引言
近年来，对盐渍胁迫下植物基因表达整体概况
的研究较对单个基因表达的研究更为引起人们的兴趣。目前已从模式植物拟南芥菜、水稻中分离了一
些受盐胁迫诱导的基因及上游调控序列［1，2］
。大规
模的表达分析丰富了人们对盐胁迫下基因表达的认识。研究发现与盐胁迫应答相关的基因涉及到代谢、细胞防御、能量、离子平衡和转运、细胞生长和分裂等诸多方面，另外还有很大一部分至今未知其功
能［3，4］。这些基因以某种协调的机制发挥作用，维
持盐胁迫下植物正常的生长发育。
Liang 和Pardee 等
［5］
于1992年最早报道了差异显示法（mRNA differential display ，DDRT-PCR ）
。其一般原理是：选取不同的组织样品、不同发育阶段的同一组织样品或同一组织经不同处理诱导的样品，经总RNA 提取后，
进行mRNA 反转录合成OD-NA ，
在此基础上对每一类ODNA 的PCR 选择性扩增产物进行凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因在时间和空间上组织特异性的表达。Nemoto 等利用改进的银染DD-RT-PCR 技术从普通小麦中分离了5个新的盐胁迫反应相关基因，定名为WESR1-
5
［6］
。Khaled 等采用DDRT-PCR 方法从硬粒小麦（Triticum durum ）根中分离了一个ODNA 片段，经鉴定该ODNA 属于小麦脱水素（dehydrin ）蛋白基因家族（group 2LEA protein ）的一员［7］。
利用不对称体细胞杂交技术可向小麦转移异源植物的耐盐性［8］
。本实验室以普通小麦（Triticum
aestioum L.2n =42）
济南177胚性悬浮细胞来源的原生质体为受体，野生耐盐近源植物高冰草（Agropyron elongatum ，Host Nevski 2n =10X =70）悬浮细胞系原生质体经紫外线照射后为供体，进行不对称体细胞
杂交，在国际上首次获得了体细胞杂种后代株系［9］。
经过连续多年的实验室及大田耐盐实验，已筛选出耐盐性强的品系杂3号，可在0.3%~0.5%的盐地种植。本实验利用改进的DDRT-PCR 技术分析盐胁迫下耐盐杂3号与其小麦亲本间基因表达的差异，以期获得盐胁迫相关的序列信息，为进一步深入研究该杂种的耐盐机理奠定基础。
1
材料与方法
1.1
植物材料
小麦与高冰草（Agropyron elongatum ，2n =70）体
细胞杂种耐盐品系杂3号及亲本小麦（Triticum aes-tioum L ，2n =42）
品种济南177由本实验室保存。小—
92—单雷等：小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答ODNA 差异表达分析
$!"#联系人。
（收稿日期：2004-01-09）
男，
1963年生，博士，副教授；研究方向：分子遗传学。本作者与第一作者有同等贡献。女，
1965年生，博士生，副研究员；研究方向：植物遗传工程。863计划
（2001AA241032）和国家自然科学基金（30370857）资助项目。
麦种子室温下萌动3天后，转至1/10~oagiand 培养液中室温下光照培养，小苗生长至两叶一心期时用200mmoi /L NaCi 胁迫处理3天，对照生长在1/10~oagiand 培养液中。1.2
mRNA 差异显示分析
分别用赵双宜等［10］
的方法和TRIZoi 法提取小麦幼叶RNA 和小麦根RNA 。取胁迫24小时、48小时和72小时的小麦幼叶RNA ，等量混合。取胁迫6小时、12小时、24小时、48小时和72小时的小麦根RNA ，
等量混合。同时分别以胁迫0小时小麦叶和根RNA 为对照。
DDRT-PCR 参照GENOMYX 公司fiuoroDD 试剂盒操作指南进行。逆转录锚定引物APs 为长度31nt 的12个引物，PCR 的随机引物为长26nt 的12个引物。扩增产物在6%的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离（恒定功率50W ）后，银染显色。
从聚丙烯酰胺凝胶中切下ODNA 差异片段，回收并以其作为模板，以下列引物进行2次扩增。再扩增引物为：P15’GTAATACGACTCACTATAGGGC 3’和P25’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3’。将电泳分离的再扩增差异片段转移至尼龙膜上，以!-32P-dCTP 标记的逆转录合成
（TaKaRa ）的一链总ODNA 为探针，进行反向Northern （Reverse Northern ）杂交。X 光片-70C 曝光。差异表达的ODNA 片段连接到pGEM-T easy 载体上，
进行测序分析。1.3Northern 杂交分析
30"g 总RNA 经1.5%的甲醛变性琼脂糖凝胶分离后，转移至尼龙膜上。用随机引物标记法（promega ）制备!-32P-dCTP 标记的差异ODNA 片段探针，并进行Northern 杂交。
2
结果与分析
2.1
mRNA 差异显示分析
本研究选用12个31nt 的锚定引物和12个26nt
的随机引物进行DDRT-PCR 分析。图1显示了引物组合AP5/ARP6在供试材料中的扩增结果。经统计从序列胶上数千个显示条带中共获得的差异表达ODNA 片段106个，
其中从根获得的差异片段87个，叶中获得的差异片段仅有19个（数据未列出）。根中盐诱导差异表达的ODNA 片段称wrsi （sait-induOed
ODNA fragment of wheat root ）
；叶中盐诱导差异表达的ODNA 片段称为wisi （sait-induOed ODNA fragment of
wheat ieaf ）
。所有引物组合为AP5/ARP6；箭头表示盐胁迫表达增强的ODNA 片段。1.未经胁迫耐盐3号；2.盐胁迫后的耐盐3号；3.未经胁迫济南177；4.盐胁迫后的济南177。
图1小麦济南177与耐盐3号盐胁迫前后mRNA 差异显示
2.2反向Northern 杂交分析
将耐盐品系杂3号盐胁迫下显示的53个差异
条带分别进行二次PCR 扩增。取适量扩增产物电泳分离，转移至尼龙膜上，用于杂交分析。同时制备两组第一链ODNA 探针，一组为未经盐胁迫的，另一组为盐胁迫后的，分别与同一组差异片段杂交。结果初步鉴定出27个阳性差异片段，其中13个为盐胁迫下表达量增加，14个为盐胁迫抑制其表达（部分结果见图2）。其余26个ODNA 片段被视作假阳性。但DDRT-PCR 获得的差异片段中很多片段组成
并不单一［11］
，往往包含长度相同而序列组成不同的
若干条ODNA 片段。我们用二次扩增产物直接进行测序的结果也显示了这种片段不均一性（结果未显示）。因此，不能排除上述表现假阳性的ODNA 片段中存在差异表达ODNA 的可能性。另外受反向Northern 检验灵敏度的限制，
一些表达丰度低的差异
片段很可能因没有杂交信号而不能鉴别。
1，2，3，4，5，6为盐胁迫表达增强的片段；7，8，9为盐胁迫表达抑制的片段；4，6为wrsi-1、wrsi-5。
图2反向Northern 杂交分析结果
—
03—高技术通讯2004.7
2.3差异表达cDNA片段序列分析
分析反向Northern差异较显著的l0个cDNA片段，测序结果进入Genbank进行查询、序列比对，结果见表l。其中wrsi-l与来源于小麦根cDNA文库中的一个EST克隆的同源性达97%，推测其编码过氧化物酶；wlsi-l与水稻推测的编码3-羟基丁酰辅酶A脱氢（3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase）的基因的同源性为84%，所推导的60个氨基酸与水稻3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶的同源性为98%；wris-4与玉米编码核小体/染色质装配因子C（MSI typenucleo-some/chromatinassembly factor C）的基因同源性为72%；wrsi-2（down-regulated）推导的54个氨基酸与推测的水稻根毛缺陷基因（root hair defective3，RDH3）同源性为5l%；wrsi-3可能编码一种核糖体蛋白。其余几个片段（wrsi-5、6、7、8和wlis-2）尽管经氨基酸序列比对没有得到同源信息，但其EST序列信息表明，其表达与胁迫应答也有一定关系。
表1差异显示的cDNA片段在Genbank中的blast结果
类型编号引物组合片段大小表达类型Genbank中的同源基因及基因编号E值与氧化胁迫相关的基因wrsi-l AP5/ARP65l9bp SIU X85228.l，小麦过氧化物酶基因pox20.023与细胞防御相关的基因wrsi-2AP8/ARP9442bp SID NP9l8504.l，根毛缺陷基因le-04与蛋白质合成与代谢相wrsi-3AP5/ARPl0294bp SIU NP906005.l，核糖体大亚基3e-24关的基因wrsi-4APl0/ARP20426bp SIU AF4402l9，核小体与染色质装配因子4e-07 wlsi-l APl0/ARP20500bp SIU AK060287.l，3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶2e-28其他wlsi-2AP8/ARP20540bp SIU NP567470.l，拟南芥菜表达的蛋白9e-24 wrsi-5AP5/ARPl03l3bp SIU bO838252，小麦铝胁迫的根尖EST e-ll7
wrsi-6AP6/ARP9297bp SID bO744lll，小麦盐胁迫的根EST e-l25
wrsi-7APl0/ARPl04l3bp SIU AL502805，大麦根EST e-l02
wrsi-8AP7/ARP9450bp SID CA6l2489，小麦EST0.0 SIU：盐诱导上调
SID：盐诱导下调
2.4Northen杂交验证
以wrsi-l片段为探针进行亲本小麦和耐盐品系杂3号根系在盐胁迫0、6、l2、24、48、72小时的Northern杂交分析。亲本小麦未出现阳性结果。杂3号根系在盐胁迫处理6小时出现阳性杂交结果（见图3）。表明wrsi-l基因在耐盐品系杂3号的根中转录受盐诱导，推测该基因为胁迫早期应答基因。进
一步的研究正在进行。
图3差异显示cDNA片段wrsi-1Northern杂交结果
3讨论
随着基因组学研究的发展和后基因组时代的到来，基因差异表达研究的方法和技术也在不断涌现和完善。尽管mRNA差异显示技术因其假阳性多、获得的差异片段小，其应用受到了一定限制，但这一技术难度低、所用材料少，同时可比较多个材料或多个不同处理间基因的差异表达，另外，不仅可获得表达增强的差异片段，而且可同时显示表达受抑制的片段，这些优势也是抑制性消减杂交、代表性差异显示等新技术无法替代的。本研究中为了克服假阳性比例高的缺点，采用了较长的引物长度（锚定引物3lnt，随机引物26nt）和较高的退火温度（60C），使显示的扩增产物的可靠性增强。二次PCR和反向Northern杂交的结果也间接地证实了扩增产物确实是表达的序列。同时利用反向Northern杂交分析也可有效地去除假阳性片段，大大减少了后续工作量和研究费用。但其最大的不足就是一些表达量较低的差异片段有可能被排除在外。
甜土植物受到盐渍的胁迫，其光合作用明显降低，细胞生长和分裂受到严重抑制，能量消耗增加，细胞内活性氧增加，膜结构完整性和膜功能改变［l2］。耐盐植物在盐胁迫下其体内发生一系列的生理生化反应以适应胁迫，维持植物正常的生长发育。参与盐胁迫反应的相关序列涉及植物生长发育的诸多方面，包括渗透保护物质生物合成的基因［l3，l4］编码与水分胁迫相关的功能蛋白的关键基因［l5-l7］，与细胞排毒、抗氧化相关的酶基因，与信号转导和基因表达相关的调控序列［l8，l9］等，这些基因
—
l
3
—
单雷等：小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答cDNA差异表达分析
协调的时空表达以及精确的调控共同完成了对胁迫的适应反应。
目前，对异源6倍体小麦及其野生近源种的耐盐相关研究较少。本实验室曾对小麦与高冰草早代的杂种株系进行过耐盐实验及一些耐盐生理生化指
标的鉴定［21］
。Guiick 和Dvo'r k
（1992）从一种小麦近源兼性盐生植物二倍体高冰草Lophopyrum elongatum （2n =2X =14）cDNA 克隆中分离了11个盐胁迫诱导基因。所有这11个基因在植物的根浸入250mmoi /L NaCi 2小时开始诱导表达，6小时表达达到峰值，且这些基因的表达主要在植物根部，这些基因被定名
为ESI （eariy sait stress induced ）基因［20］。陈桂平等利用cDNA-AFLP 技术从小麦耐盐突变体中分离了一
些与盐胁迫相关的基因，例如与阳离子转运ATP 酶有较高同源性的SIR 38及与蛋白激酶同源的基因片段SIN 25［22］
。本研究通过差异显示、反向Northern 和Northern 分析获得了部分与小麦体细胞杂种品系杂3的盐胁迫相关的序列信息。较为明显的结果是推测的编码过氧化物酶的基因（见表1，图3），此基因的转录受盐诱导。我们对杂种耐盐品系杂3与对照小麦亲本济南177的02-含量及过氧化物酶活性的比较分析也证明了，在200mmoi /L NaCi 胁迫下，杂种根和叶02-含量明显降低而过氧化物酶活性明显增强（王军等，私人通讯）。表明在体细胞杂种的耐盐机制中，过氧化物酶基因的活化和在盐胁迫下的早期表达，对于清除盐胁迫引起的细胞中02-及其他有毒物质的积累有重要作用。从本实验结果也可以看出，盐胁迫还调动了蛋白质合成与代谢及其他的细胞排毒和细胞防御因子等方面。还有一些未知功能的基因还需进一步研究，如wrsi-5这一表达序列在小麦的多种胁迫下均有表达，本研究的反向Northern 结果表明盐胁迫下其转录显著提高（见图2）
。此外，对小麦杂种耐盐品系杂3在200mmoi /L NaCi 胁迫下的K +、Na +含量和K +/Na +比值的分析表明，杂种叶中K +含量和K +/Na +比值明显高于亲本小麦；Na +含量则明显低于亲本小麦；而根中的Na +
含量却高于亲本小麦［23］
。表明耐盐杂种根系细胞有较强的储钠功能，并且有更有效的选择性运输机制限制Na +而促进K +由根部向茎叶部运输。因此，体细胞杂种小麦的耐盐性是受多基因控制的多种生理功能共同作用的结果。
我们在研究中发现，实验的设计、取材与采用的方法对实验结果影响较大。用DDRT-PCR 方法在序列胶上显示的在叶中获得的转录本的总数远远大于在根中获得的转录本数，但盐胁迫诱导出的差异而是根中远大于叶中。这与Gaivez 等人的研究结果相
似［24］。用于大规模筛选转录变化的cDNA 芯片技术的发展，已经在胁迫应答基因的研究方面展示了它的优势［4，25］。当然仅有技术的发展还远远不够，
随着我们对不同发育阶段的转录图（transcipt pro-fiies ）
的认识，对胁迫信号识别、转导和相应的生理生化途径的进一步了解，我们将更好地从整体上认识盐胁迫应答的分子机制。
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23—高技术通讯2004.7
Isolation and Analysis of cDNA Fragments Responded to Salt-stress
from a New Somatic Hybrid Line between Triticum aestivum and
Agropyron elongatum by Differential Display
Shan Lei !!!，Zhao Shuangyi !，Ouan Taiyong !，Xia Guangmin !
（!SchooI of Life Sciences ，Shandong University ，Jinan 250100）
（!
!~itechnoIogy Center ，Shandong Academy of AgricuIturaI Sciences ，Jinan 250100）Abstract
cDNA fragments ，differentiaIIy expressed in saIt-stressed and unstressed sensitive parent wheat Iine JN177and saIt-toIerant Iine Za3from asymmetric somatic hybridization between wheat and Agropyron elongatum ，were isoIated by
DDRT-PCR （mRNA differentiaI dispIay ）
.Out of 27positive cDNA fragments screened by reverse northern bIotting ，10cDNA fragments were seguenced and anaIyzed.wrsi-1showed 97%homoIogy to an EST isoIated from wheat root ，and was suggested encoding a peroxidase.wIsi-1showed 84%homoIogy to rice putative 3-hydroxybutyryI-CoA dehydrogenase gene ，and its deduced 60amino acid seguence was homoIogous to this enzyme with 98%freguency.wrsi-4showed 72%homoIogy to maize nucIeosome /chromatin assembIy factor C.The deduced 54amino acid seguence of wrsi-2exhibited 51%identity to that of root hair defective gene.wrsi-3positiveIy encoded a ribosomaI protein.Other cDNA fragments in-cIuding wrsi-5.6.7.8and wIsi-2did not show homoIogy to any known functionaI genes ，but it ’
s possibIe that the expres-sion of these genes is reIated to saIt-stress response according to their EST information.The up-reguIated expression of wrsi-1induced by saIt was further confirmed by northern bIotting ，and it may be an earIy saIt responsive gene.
Key words ：SaIt stress ，Somatic hybrid Iine of wheat ，mRNA differentiaI dispIay ，DifferentiaI expression
—
33—单雷等：小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答cDNA 差异表达分析
小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答cDNA差异
表达分析
作者：单雷， 赵双宜， 权太勇， 夏光敏
作者单位：单雷(山东大学生命科学学院,济南,250100;山东省农业科学院高新技术中心,济南,250100)， 赵双宜,权太勇,夏光敏(山东大学生命科学学院,济南,250100)
刊名：
高技术通讯
英文刊名：HIGH TECHNOLOGY LETTERS
年，卷(期)：2004,14(7)
被引用次数：2次
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引用本文格式：单雷.赵双宜.权太勇.夏光敏小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答cDNA差异表达分析[期刊论文]-高技术通讯 2004(7)