光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及表达
热休克蛋白70
本科生毕业论文（设计）册 学院生命科学院 专业生物科学 班级（届） 2015届 学生张川 指导教师李东明 任务书编号 2015届103
河北师范大学本科毕业论文（设计）任务书 编号： 2015届103 论文（设计）题目：急性低氧刺激下树麻雀HSP70基因的适应性变化 学院：生命科学院专业：生物科学班级（届）： 2015届 学生姓名：张川学号： 2011012028 指导教师：李东明职称：副教授 1、论文（设计）研究目标及主要任务 研究目标：在急性低氧刺激下，树麻雀肝脏组织中HSP70基因水平的变化。 主要任务：分析低氧刺激对树麻雀HSP70基因水平的影响。 2、论文（设计）的主要内容 热休克蛋白是一种高度保守的应激蛋白，在受到外界刺激时，机体的HSP70会有一定变化，以保护组织器官等。本研究以树麻雀为研究对象，研究其在低氧刺激下肝脏组织中HSP70基因的变化。 3、论文（设计）的基础条件及研究路线 基础条件：本实验室主要研究动物对环境的适应性，具备研究树麻雀HSP70的基础条件，实验室仪器设备齐全，并具有野外取材的条件和能力。 研究路线：将树麻雀放入模拟各种海拔高度低氧的环境生活一定时间，然后提取其肝脏组织，对肝脏组织中HSP70基因的mRNA表达量进行分析对比。 4、主要参考文献 [ 1 ] Welch WJ. Mammalian stress response: cell physiology, struc2 ture / function of stress p roteins, and imp lications for medicine and disease[ J ]. Physiol Rev, 1992, 72 (4) : 1063 - 1081. [ 2 ] Suzuki k, Sawa Y, Kagisaki k, et a l. Reduction in myocardial apop tosis associated with overexp ression of heat shock p rotein 70 [ J ]. Basic Res Cardiol, 2000, 95 (5) : 397 - 403. [ 3 ] 任宝波,王玉艳,王纯净,等. HSP70 家族的分类及基因结构与功能[J ]. 动物医学进展,2005 , (26) :98 - 101. [ 4 ] Ishii T ,VdonoH ,Yamano T ,et al. Isolation of MHC class I - restricted tumor antien peptide and its precursors asso2 ciated with heat shock proteins HSP70 , HSP90 and gp96 [J ]. Immunol ,1999 ,162 :1303 - 1309. [ 5 ] 陈劲松. 热休克蛋白的分子遗传学研究进展[J ] . 国外医学一遗传学分,2001 ,24 (3) 128 - 132. 指导教师：年月日 教研室主任：年月日
热休克蛋白hsp70
1、热休克蛋白的发现 热休克蛋白最初是在果蝇中发现的。早在1962年Ritossa把25℃下培养的果蝇幼虫无意间置于32℃的环境中30min后在其巨大唾液腺染色体上发现了3个新的膨突，说明该区域基因转录增强，可能在热休克时有某种蛋白合成的增加。人们将该现象称为热休克反应。1974年Tissieres等用SDS凝胶电泳技术和放射自显影技术首次证明，热休克反应产生一组特殊的蛋白质，即热“休克蛋白”。近年研究表明，HSP的生成，不仅见于果蝇，而且是普遍存在于从细菌直至人类的整个生物界（包括植物和动物）的一种现象 2 热休克蛋白的分类及特性 热休克蛋白按照蛋白的大小共分为以下几个家族，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 以及小分子热休克蛋白，每个家族各有很多成员。其中HSP70家族成员最多，共有21种蛋白质，是一组在进化上高度保守的应激蛋白。主要包括HSP68、72、73。、HSC70、GRP75、78、80、Bip等 HSP70有许多重要的生物学特性：第一、存在的普遍性，从原核生物到真核生物都有表达。第二、高度的保守性，不同来源的HSP氨基酸序列有50%-90%的同源性。第三、正常情况下HSP70在细胞内表达水平很低，只有在应急条件下，HSP70的合成才显著，以提高其本身的抗应急能力。第四、正常情况下HSP70位于细胞浆内，只有当细胞受到应急作用时，才迅速移入细胞核。 3、HSP70的表达与调控 随着研究的深入，人们发现真核生物HSP70的转录需要三个步骤：在应急条件下，如热休克，导致热休克转录因子（HSTF）的激活。活化的HSTF与HSP70
基因的HSE区域结合，从而诱导基因的转录。HSTF是一种蛋白质，HSE是位于HSP70基因启动子TATA盒上游的一段保守序列，具有增强子的一些特性。HSP70可作为一种负性调节物来调节HSP的表达：在正常情况下HSP70蛋白与HSTF结合，以单体的形式存在，此时HSTF的活性被抑制，不具有与HSE 结合的能力。热应急条件下，细胞内大量增加的非稳定蛋白等与HSP70有高度的亲和力，可竞争性地结合HSP70使大量的HSTF游离出来，形成三聚体，进入细胞核【1】]。HSTF三聚体与HSE快速、高效地结合，保证HSP基因的高效转录，从而HSP70蛋白的合成增多。当产生的HSP70的水平到一定量，足够结合HSTF的时候，使其活性降低，从而关闭热休克基因的表达. [1] 陈劲松. 热休克蛋白的分子遗传学研究进展[J ] . 国外医学一遗传学分,2001 ,24 (3) 128 - 132. 正常情况下HSP70的mRNA很不稳定，半衰期很短，只有20min左右，而在热应激下可长达几个小时之久。HSP70 mRNA常温下的不稳定由mR2 NA 降解系统控制,而热应激影响了系统的活性[ 2 ]。热应激下细胞内其他的mRNA 虽不被降解，但翻译停止，HSP70mRNA大量翻译。 [2] 孙克年 .能提高牛乳品质的饲料添加剂[J ].《中国奶牛》 4 热休克蛋白70家族的功能 4.1分子伴侣功能 分子伴侣,是一类帮助新合成或解折叠蛋白质正确折叠和成功组装而本身非最终装配产物的组成蛋白,HSP70是目前发现的主要的分子伴侣之一,在细胞内分
人热休克蛋白90α
人热休克蛋白90α，即Hsp90α，是热休克蛋白家族中的重要成员。1989年国外专家首次报道了Hsp90α的基因序列，确认了该蛋白的身份。1992年外国科学家发现，Hsp90α能被肿瘤细胞分泌到细胞外，但其分泌调控机制在此后很长时间里并不清楚。[1] 热休克蛋白，英文简称HSPs，它是细胞在某些环境因素或应激条件刺激下形成的一类具有分子伴侣特性的蛋白质，广泛存在于从细菌到哺乳动物的各类细胞中。 热休克蛋白90α 清华大学发布消息，山东籍归国博士罗永章研究组，在国际上首次发现热休克蛋白90α为一个全新的肿瘤标志物，并自主研发出试剂盒，只需要采一滴血液，就可以对肿瘤进行预警和诊断。热休克蛋白90α，是一种与肿瘤相伴的物质，早在24年前，科学家就发现了这种蛋白。但这种物质与肿瘤的关系却是罗永章团队率先发现的，项目研发初期曾得到国家、山东省科技资金和平台支持。 清华大学教授罗永章：“肿瘤恶性程度越高它分泌到细胞里的量越多而且还发现在血液里面它的含量明显多于健康人基于这个发现我们就想能不能作为一个肿瘤标志物就是利用肿瘤病人血液里面含量的变化来测量一个病人是不是得了肿瘤”与其它检测手段相比，肿瘤标志物更加方便快捷，成本大大降低，但如何以这个标志物为基础，生产出临床试剂，是一项更为困难的科技攻关。罗永章团队与普罗吉生物公司合作，用四年时间，研发出了性能稳定的“定量检测试剂盒”，只需要采一滴血，就可以进行肿瘤检测、和疗效评价。[ 中国科技网北京11月17日电（记者朱丽）记者今天从清华大学获悉，该校生命学院罗永章教授研究组在国际上首次发现热休克蛋白90α（Hsp90α）为一个全新的肿瘤标志物，自主研发的Hsp90α定量检测试剂盒已通过临床试验验证，并获准进入中国和欧盟市场。这是人Hsp90α被发现24年来，全球首个将其用于临床的产品，对于提高肿瘤患者的病情监测和疗效评价水平、实现肿瘤个体化治疗具有重要推动作用。 热休克蛋白（Heat shock proteins, HSPs）是细胞在某些环境因素或应激条件刺激下形成的一类具有分子伴侣特性的蛋白质，广泛存在于从细菌到哺乳动物的各类细胞中。1974年，Tissieres 课题组首先从果蝇中分离得到了HSPs。按照蛋白的大小，HSPs分为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 和小分子HSP。人热休克蛋白90α（Hsp90α）是热休克蛋白家族中的重要成员。1989年，Weber课题组首次报道了人Hsp90α的全长基因序列，使该蛋白的身份得到了确认。1992年，Ferrarini课题组发现，人Hsp90α能被肿瘤细胞分泌到细胞外，但其分泌机制在过去的近二十年间却并不清楚。 Hsp90α这一全新肿瘤标志物的确认，源于罗永章课题组首次揭示癌细胞分泌Hsp90α调控机制的重大科学发现。2009年，该课题组在世界上首次报道了肿瘤细胞特异分泌Hsp90
绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
热休克蛋白-hsp70
热休克蛋白-hsp70
1、热休克蛋白的发现 热休克蛋白最初是在果蝇中发现的。早在1962年Ritossa把25℃下培养的果蝇幼虫无意间置于32℃的环境中30min后在其巨大唾液腺染色体上发现了3个新的膨突，说明该区域基因转录增强，可能在热休克时有某种蛋白合成的增加。人们将该现象称为热休克反应。1974年Tissieres等用SDS凝胶电泳技术和放射自显影技术首次证明，热休克反应产生一组特殊的蛋白质，即热“休克蛋白”。近年研究表明，HSP的生成，不仅见于果蝇，而且是普遍存在于从细菌直至人类的整个生物界（包括植物和动物）的一种现象 2 热休克蛋白的分类及特性 热休克蛋白按照蛋白的大小共分为以下几个家族，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 以及小分子热休克蛋白，每个家族各有很多成员。其中HSP70家族成员最多，共有21种蛋白质，是一组在进化上高度保守的应激蛋白。主要包括HSP68、72、73。、HSC70、GRP75、78、80、Bip等 HSP70有许多重要的生物学特性：第一、存在的普遍性，从原核生物到真核生物都有表达。第二、高度的保守性，不同来源的HSP氨基酸序列有50%-90%的同源性。第三、正常情况下HSP70在细胞内表达水平很低，只有在应急条件下，HSP70的合成才显著，以提高其本身的抗应急能力。第四、正常情况下HSP70位于细胞浆内，只有当细胞受到应急作用时，才迅速移入细胞核。 3、HSP70的表达与调控 随着研究的深入，人们发现真核生物HSP70的转录需要三个步骤：在应急条件下，如热休克，导致热休克转录因子（HSTF）的激活。活化的HSTF与HSP70基因的HSE区域结合，从而诱导基因的转录。HSTF是一种蛋白质，HSE是位于HSP70基因启动子TATA盒上游的一段保守序列，具有增强子的一些特性。HSP70可作为一种负性调节物来调节HSP的表达：在正常情况下HSP70蛋白与HSTF结合，以单体的形式存在，此时HSTF的活性被抑制，不具有与HSE结合的能力。热应急条件下，细胞内大量增加的非稳定蛋白等与HSP70有高度的亲和力，可竞争性地结合HSP70使大量的HSTF游离出来，形成三聚体，进入细胞核【1】]。HSTF 三聚体与HSE快速、高效地结合，保证HSP基因的高效转录，从而HSP70蛋白的合成增多。当产生的HSP70的水平到一定量，足够结合HSTF的时候，使其活性降低，从而关闭热休克基因的表达. [1] 陈劲松. 热休克蛋白的分子遗传学研究进展[J ] . 国外医学一遗传学分,2001 ,24 (3) 128 - 132. 正常情况下HSP70的mRNA很不稳定，半衰期很短，只有20min左右，而在热应激下可长达几个小时之久。HSP70 mRNA常温下的不稳定由mR2 NA降解系统控制,而热应激影响了系统的活性[ 2 ]。热应激下细胞内其他的mRNA虽不被降解，但翻译停止，HSP70mRNA大量翻译。 [2] 孙克年 .能提高牛乳品质的饲料添加剂 [J ].《中国奶牛》
热休克蛋白22的研究现状
内容摘要：【关键词】小热休克蛋白（shsp）; 热休克蛋白22（hsp22）;细胞骨架疾病;缺血-再灌注 【关键词】小热休克蛋白（shsp）; 热休克蛋白22（hsp22）;细胞骨架疾病;缺血-再灌注 1 热休克蛋白的概述 热休克蛋白heat shock proteins (hsps),是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。当组织或者细胞对应激状态、非应激状态、病理生理或疾病状态的应激信号产生应答反应时，热休克转录因子就结合到热休克蛋白基因上游的热休克元件上使热休克基因表达上调、热休克蛋白表达增高，发挥分子伴侣的作用从而增强机体对各种应激的抵御能力［１］。热休克蛋白是在细胞合成或合成增加的一组蛋白质，非由细胞分泌到血浆或组织液中发挥作用，而是在细胞内发挥作用，属于非分泌性蛋白质。热休克蛋白不仅在于真核生物而且也在于原核生物中表达［２］。根据它们的分子量、结构、性质特点可以分为hsp100，hsp90，hsp70，hsp60和小热休克蛋白shsp( small heat shock protein）。 2 小热休克蛋白家族的共性 2.1 低分子量蛋白质：小热休克蛋白单体分子量在12 kda～43 kda之间［３］。 2.2 具有保守的中央“晶体蛋白结构域”：这个亚家族的标志性特点是在c-端有一个由80～100个氨基酸残基组成的功能单位称为‘α-晶体结构域［４］’，‘α-晶体结构域’连接在n-端和c-端之间也可以说是c-端的延伸,它的主要功能是形成二聚体；n-端主要影响低聚物的结构和分子伴侣作用；c-端主要是增加四级结构的稳定性和蛋白/底物复合物的溶解性。 2.3 小热休克蛋白通过亚基可以形成一些大的低聚复合物［５］。 2.4 小热休克蛋白具有非atp依赖的分子伴侣活性［６］，参与蛋白折叠、转运、降解、信号转导等多种细胞生物过程。 2.5 与变性蛋白质形成大的具有特点的复合物［７］。 到目前为止一共发现了十种哺乳动物小热休克蛋白称作hspb1-hspb10，根据shsp分子的结构特征和功能，shsp家族被划分为两个家族。ⅰ类亚家族成员（hspb1、hspb5、 hspb6、 hspb8 ）呈现泛素化表达，ⅱ类亚家族成员(hspb2、 hspb3、 hspb4、hspb7、 hspb9、 hspb10)则被严格限定于肌原性组织和睾丸组织中［８］。 3 hsp22的分子特点 人类的hsp22是一种分子量是21.6 kda小热休克蛋白，也被称为hspb8、h11激酶和e2ig1，由位于12q24.23的基因编码。这种小热休克蛋白由196个氨基酸组成，等电点是4.7，是已发现的十种哺乳动物小热休克蛋白中等电点最低的一种［９］,属于shsp亚家族成员。虽然hsp22和其他小热休克蛋白具有同源性,也有标志性的‘α-晶体结构域’，但是它以单体的形式存在［１０］。 4 hsp22的组织分布 hsp22蛋白广泛存在于哺乳动物的很多组织中，在肌肉、胎盘、心脏和脑组织中高度表达，在子宫、前列腺、肺和肾脏中度表达，在卵巢、睾丸、肝脏、胰腺、血液和脾脏还没有发现表达［４，９，１１］。 5 hsp22的临床研究 hsp22具有丝/苏氨酸激酶活性,是一种磷蛋白。在体外hsp22主要被蛋白激酶c和p44mapk 磷酸化［１１］。hsp22不仅有分子伴侣的作用还有激酶活性［１２］、促凋亡或抗凋亡的作用［１３］，在延长生物体的寿命［１４］、抗缺血再灌注损伤［１５］、肿瘤［１３，１６］和神经系统疾病变等很多方面发挥着重要作用［１７］。
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.wendangku.net/doc/cc8732540.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.wendangku.net/doc/cc8732540.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.wendangku.net/doc/cc8732540.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.wendangku.net/doc/cc8732540.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.wendangku.net/doc/cc8732540.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
第四章 热休克蛋白与免疫
第四章热休克蛋白与免疫 (Heat Shock Protein and Immunity) 一、概述 热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一类具有重要生理功能，参与免疫应答的高度保守的蛋白质分子大家族。根据其分子量大小和同源程度，可将其分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP等几个家族。生理、病理(如创伤和感染)及环境因素(如温度突然升高)等都可诱导一切生物细胞包括原核细胞和真核细胞产生HSP，又称应激蛋白(stress protein，SP)。 HSP的生物学功能广泛，不仅表现在应激条件下维持细胞必需的蛋白质空间构象，保护细胞生命活动，以确保细胞生存，而且在蛋白质折叠、跨膜运输、转位、细胞骨架及核骨架稳定等基本功能方面发挥重要作用，以调节这些蛋白质的活性和功能。HSP自身又不参与大分子蛋白质的组成，又被称为“分子伴侣”(molecular chaperon)。 最先发现HSP的是Ritossa(1962年)，他观察到正常果蝇暴露于高温，发生休克后，其唾液腺染色体变得疏松膨胀，对此现象的发生原因，他未能作深入的研究。12年后，Tissieres等(1974年)证实，增高温度时果蝇染色体蓬松是由热休克激发染色体内基因转录合成特异蛋白质引起的，遂将该蛋白称为热休克蛋白(HSP)。 Nover(1984年)与Soger等(1987年)先后阐明编码这种蛋白质的基因序列、基因结构及位点，如编码HSP70的基因在人类MHC基因位点图上介于补体成分基因与肿瘤坏死因子(TNF)基因之间；在大鼠，则靠近MHC-Ⅲ类抗原基因，在小鼠，HSP84基因与MHC连锁。 除了温度刺激以外，还发现其它一些有害的理化因素，如氧化剂、重金属、乙醇或代谢抑制物等亦可促使HSP的合成增加。在机体遭遇组织损伤、病原体感染、炎症或遇有某些细胞因子(IL-1、IL-2、TNF、IFN)的刺激，皆会伤害细胞，使其蛋白质构型发生改变及功能消退，从而引起细胞的应激反应，诱导机体某些细胞合成HSP，以保护细胞和对抗有害因子。 Ames等(1986年)及Filds等(1986年)分别用小剂量H 2O 2 预先处理能高表达HSP、细胞 内感染的鼠伤寒沙门氏菌，使其合成HSP，结果能耐受致死量H 2O 2 或高热度攻击而不死；另 一方面用同量的H 2O 2 预先处理缺乏HSP基因表达的感染该菌的变异株，随后用高剂量的H 2 O 2 或热攻击，结果病原体和感染细胞皆失活，因缺乏产生HSP之故。 Srivastava(1996年)从甲基胆蒽诱发的小鼠纤维瘤细胞上分离得到HSP70，并证实可作为一种肿瘤转移性抗原诱发宿主的抗肿瘤免疫反应。Tamura等(1993年)也在H-ras转化的小鼠纤维肉瘤细胞W31上证实其表达HSP70，并发现一种CD8-CD4-双阴性T细胞介导了HSP70诱发的抗肿瘤免疫反应，这种CD8-CD4-双阴性T细胞后来被证实为γδT细胞。近年来证实HSP及其相关复合物是γδT细胞能识别的配体。 近十几年来，发现某些HSP具有分子伴侣作用后，HSP研究工作产生了一次飞跃，成为目前生命科学的热点课题。 HSP广泛分布于生物界，在动物、植物、微生物及人类中普遍发现了HSP，其功能也是多种多样的。