鱼类GABA受体与相关药物作用机理研究及其纯化分离
目录
中文摘要 ..................................................................................................................... V I Abstract....................................................................................................................... I X 缩略语(Abbreviations)............................................................................................ X IV 第一章前言 .. (1)
1.1氟虫腈对人畜的安全性及对昆虫的高效性 (1)
1.2 氟虫腈对鱼类等水生生物的严重毒性 (2)
1.3 1,4-苯二氮卓类化合物在鱼类GABA A受体研究中的应用 (2)
1.4 1,4-苯二氮卓化合物在分离哺乳动物GABA A受体的应用 (2)
1.5 1,4-苯二氮卓化合物荧光探针与哺乳动物GABA A受体相互作用研究 (3)
1.6 配体-受体相互作用的计算机模拟 (3)
1.7 本课题的研究意义 (3)
第二章文献综述 (5)
2.1 GABA受体分类 (5)
2.2 GABA A 受体的分子结构和分布特点 (5)
2.2.1 GABA A 受体分子结构 (5)
2.2.2 GABA A 受体亚单位及分布 (7)
2.2.3 GABA A 受体的活性部位 (7)
2.3 氟虫腈及对不同生物的毒性差异 (8)
2.4 GABA A受体与配体的相互作用的研究手段 (9)
2.4.1放射性标记法研究受体与配体的相互作用 (9)
2.4.2 荧光探针法研究受体与配体的相互作用 (12)
2.4.3 计算模拟技术研究GABA A受体与配体的相互作用 (15)
2.4.4 相关计算机模拟方法简介 (16)
2.4.4.1同源模建（homology modeling） (16)
2.4.4.2分子动力学 (17)
2.4.4.3分子对接 (19)
2.5 GABA A受体分离纯化研究 (19)
2.5.1 去污剂对GABA A受体蛋白分离的影响 (20)
2.5.2 GABA A受体的纯化方法 (23)
2.5.2.1 亲和层析法在哺乳动物GABA A受体纯化中的应用 (23)
2.5.2.2 其他分离方法在哺乳动物GABA A受体纯化中的应用 (24)
2.5.2.3 亲和层析法在鱼类GABA A受体纯化中的应用 (26)
2.6 小结 (26)
第三章设计思想与合成路线 (28)
3.1 本研究的总体设计思想 (28)
3.2 1,4-苯二氮卓化合物RO7及洗脱剂合成路线设计 (29)
3.3 荧光探针合成路线设计 (30)
3.3.1 1,4-苯二氮卓化合物RO7荧光探针合成路线设计 (30)
3.3.2 氟虫腈荧光探针合成路线设计 (30)
3.4计算机模拟技术研究氟虫腈与鱼类GABA A受体的相互作用设计 (31)
3.5亲和基质琼脂糖-二氧化硅亲和载体的制备路线设计 (31)
3.5.1 非磁性二氧化硅微球路线设计 (31)
3.5.2实心和空心磁性二氧化硅微球的制备路线设计 (32)
3.5.3 琼脂糖-二氧化硅亲和载体制备过程设计 (32)
3.6 亲和层析介质的制备 (32)
3.6.1 1,4-苯二氮卓化合物RO7亲和层析介质的制备路线设计 (32)
3.6.2 氟虫腈亲和层析介质的制备路线设计 (33)
3.7鱼类GABA A受体的亲和分离实验设计 (33)
第四章1,4-苯二氮卓类化合物RO7及氟西泮的合成 (35)
4.1 实验部分 (36)
4.1.1实验试剂 (36)
4.1.2 实验仪器与设备 (36)
4.1.3 实验方法 (36)
4.1.3.1 N-苄氧羰基-3-碘乙胺的制备 (36)
4.1.3.2 1,4-苯二氮卓化合物RO7的制备 (37)
4.1.3.3 1.4-苯二氮卓化合物Ⅱ（氟西泮）的制备 (40)
4.2 结果与讨论 (41)
4.2.1 化合物最优合成条件筛选 (41)
4.2.1.1化合物3最优制备条件筛选 (41)
4.2.1.2 化合物4最优制备条件筛选 (42)
4.2.1.3 N-苄氧羰基-3-碘乙胺最优制备条件筛选 (44)
4.2.1.4 1,4-苯二氮卓化合物RO7盐酸盐最优制备条件筛选 (45)
4.2.1.5 1,4-苯二氮卓化合物Ⅱ氟西泮最优制备条件筛选 (45)
4.2.2 化合物图谱分析 (47)
4.2.2.1 N-苄氧羰基-3-碘乙胺的红外光谱图谱分析 (47)
4.2.2.2 化合物1的红外光谱图谱分析 (48)
4.2.2.3 化合物2的红外光谱图谱分析 (48)
4.2.2.4 化合物3的红外光谱图谱分析 (49)
4.2.2.5 1,4-苯二氮卓化合物RO7的红外光谱图谱分析 (50)
4.2.2.6 1,4-苯二氮卓化合物氟西泮红外光谱图谱分析 (51)
4.3 结论 (51)
第五章荧光探针法研究1,4-苯二氮卓化合物与鱼类GABA A受体的相互作用.52 5.1 实验部分 (53)
5.1.1 实验动物 (53)
5.1.2 实验试剂 (53)
5.1.3实验仪器与设备 (53)
5.1.4 实验方法 (53)
5.1.4.1 RF荧光探针的制备 (53)
5.1.4.2 组织膜受体制剂的制备 (54)
组织膜受体制剂的制备步骤如下 (54)
5.1.4.3 荧光配体RF与组织膜受体制剂的结合实验 (54)
5.2 结果与讨论 (56)
5.2.1 产物的结构鉴定 (56)
5.2.2 光学性能检测分析 (56)
5.2.3不同溶剂体系对荧光配体荧光强度的影响 (58)
5.2.4 受体与配体结合的动力学分析 (59)
5.2.5 GABA竞争性结合实验分析 (61)
5.3 结论 (62)
第六章荧光探针法研究氟虫腈与鱼类GABA A受体的相互作用 (63)
6.1 实验部分 (64)
6.1.1 实验动物 (64)
6.1.2 实验试剂 (64)
6.1.3实验仪器与设备 (64)
6.1.4 实验方法 (65)
6.1.4.1 FF荧光探针的制备 (65)
6.1.4.2 受体膜制剂的制备 (65)
6.1.4.3 荧光配体FF与受体膜制剂的结合实验 (66)
6.2 结果与讨论 (66)
6.2.1 产物的结构鉴定 (66)
6.2.2 光学性能检测分析 (67)
6.2.3不同溶剂体系对荧光配体荧光强度的影响 (69)
6.2.4 受体与配体结合的动力学分析 (70)
6.3 结论 (73)
第七章计算机模拟技术研究氟虫腈与鱼类GABA A受体的相互作用 (74)
7.1 实验部分 (75)
7.1.1 同源模建 (75)
7.1.1.1选择序列 (75)
7.1.1.2选择模板 (76)
7.1.1.3 亚基构建 (76)
7.1.1.4 将模型进行有效组合 (76)
7.1.1.5模型的优化与修正 (76)
7.1.1.6氟虫腈与受体模型结合活性口袋的确定 (76)
7.1.1.7 氟虫腈及氟虫腈荧光探针分子与受体模型对接 (77)
7.2 结果与讨论 (77)
7.2.1斑马鱼GABA A受体同源建模 (77)
7.2.2 氟虫腈及氟虫腈荧光探针分子与斑马鱼GABA A受体模型的对接 (80)
7.2.2.1氟虫腈与斑马鱼GABA A受体模型的对接 (80)
7.2.2.2氟虫腈荧光探针分子与受体模型的对接 (82)
7.2.3 氟虫腈代谢产物与斑马鱼GABA A受体模型的对接分析 (84)
7.2.4 氟虫腈与大鼠GABA A受体相互作用 (90)
7.2.4.1哺乳动物大鼠GABA A受体同源建模 (90)
7.2.4.2氟虫腈与大鼠GABA A受体模型的对接 (92)
7.3 结论 (93)
第八章琼脂糖-二氧化硅亲和载体的制备 (95)
8.1 实验部分 (96)
8.1.1实验试剂 (96)
8.1.2 实验仪器与设备 (96)
8.1.3 实验方法 (96)
8.1.3.1无磁性实心单分散二氧化硅微球的制备 (96)
8.1.3.2实心磁性二氧化硅微球的制备 (97)
8.1.3.3空心磁性二氧化硅微球的制备 (97)
8.1.3.4琼脂糖-二氧化硅复合粒子的制备 (97)
8.1.3.5 琼脂糖-二氧化硅复合粒子表面的环氧化 (98)
8.1.3.6 反应温度对环氧基密度的影响 (98)
8.1.3.7反应时间对环氧基密度的影响 (98)
8.1.3.8环氧活化剂用量对环氧基密度的影响 (98)
8.1.3.9 DMSO及NaOH浓度对环氧基密度的影响 (99)
8.1.3.10 环氧基密度的测定 (99)
8.1.3.11 样品表征 (99)
8.2 结果与讨论 (100)
8.2.1非磁性单分散二氧化硅微球的制备过程 (100)
8.2.1.1非磁性二氧化硅微球的形成机理 (100)
8.2.1.2 非磁性二氧化硅微球形貌分析 (100)
8.2.2磁性二氧化硅微球的制备过程机理分析 (104)
8.2.2.1磁性二氧化硅微球形貌及结构表征 (105)
8.2.3 琼脂糖-二氧化硅复合粒子的形貌表征 (112)
8.2.4 琼脂糖-二氧化硅复合粒子表面琼脂糖环氧活化剂活化效率的影响因素分析 (113)
8.2.4.1 DMSO和NaOH浓度对环氧活化剂活化率的影响 (113)
8.2.4.2 反应温度对环氧活化剂活化率的影响 (114)
8.2.4.3 反应时间对环氧活化剂活化率的影响 (115)
8.2.4.4活化剂浓度对环氧活化剂活化率的影响 (116)
8.2.4.5 环氧基偶联密度的确定 (116)
8.3 结论 (117)
第九章亲和层析介质的制备及鱼类GABA A受体纯化分离初探 (118)
9.1 实验部分 (118)
9.1.1实验试剂 (118)
9.1.2 实验仪器与设备 (119)
9.1.3缓冲液的配制 (119)
9.1.4 实验动物 (120)
9.1.5 实验方法 (120)
9.1.5.1 1,4-苯二氮卓类化合物Ro7亲和层析介质的制备 (120)
9.1.5.2氟虫腈亲和层析介质的制备 (121)
9.1.5.2.1氟虫腈亲和配体的合成 (121)
9.1.5.3 鱼类GABA A受体的亲和分离 (124)
9.2结果与讨论 (128)
9.2.1 氟虫腈亲和配基的制备及最优反应条件的筛选 (128)
9.2.2不同反应因素对环氧活化琼脂糖凝胶氨化率的影响 (128)
9.2.3不同反应因素对氟虫腈亲和配基的偶联率的影响 (129)
9.2.4 RO7及氟虫腈亲和配基偶联密度的测定 (129)
9.2.5不同去污剂对GABA A受体蛋白溶出量分析 (130)
9.2.6 苯二氮卓RO7亲和层析及离子交换层析分离纯化鲢鳙脑内GABA A受体 (131)
9.2.6.1 分离受体蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳 (133)
9.2.6.2 蛋白回收率的计算 (133)
9.2.7 氟虫腈亲和层析及离子交换层析分离纯化鲢鳙脑内GABA A受体 (134)
9.2.7.1 分离受体蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳 (135)
9.2.7.2 蛋白回收率的计算 (136)
9.3 结论 (136)
第十章结论与展望 (137)
10.1本论文的主要创新点 (137)
10.2本论文取得的主要研究结论 (137)
10.3 下一步工作计划 (139)
参考文献 (140)
致谢 (164)
附录 (165)
F-1 合成中间体及目标产物的1H NMR谱图 (165)
F-2 攻读博士期间发表的论文及申请专利 (168)
F-3 攻读博士期间参与的科研项目 (169)
F-4 攻读博士期间获得的奖励 (170)
原创性声明 (171)
中文摘要
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是脊椎动物和无脊椎动物体内重要的抑制性神经递质，它的传递作用是由GABA受体介导的。GABA大部分作用是通过GABA A受体介导的。GABA A受体不仅是治疗人的癫痫，失眠，精神分裂症，酒精中毒，帕金森综合症等神经系统疾病的医药作用靶点，而且是氟虫腈，林丹、硫丹等有机氯类，及阿维菌素类等杀虫剂的作用靶标。氟虫腈（Fipronil）是一种高效的的苯基吡唑类杀虫剂，为GABA A受体拮抗剂，通过作用于GABA A 受体，阻断氯离子通道，导致神经信号的损失、过度兴奋及死亡。
氟虫腈对不同生物具有毒性差异，对蝇类、鞘翅目及鳞翅目等系列害虫具有很高的杀虫活性，对哺乳动物GABA A受体具有较低的亲和力，所以对哺乳动物的毒性非常低。但氟虫腈对某些非靶标生物，如鱼类等水生生物的毒性很高，鱼类是水生生态系统中的重要组成部分，因此氟虫腈对鱼类的毒性机理研究及其重要。
本论文的主要创新点为：针对氟虫腈对鱼类高毒问题，①本论文首次利用荧光探针法探索了鱼类GABA A受体与农药氟虫腈及1,4-苯二氮卓类药物RO7的相互作用；②利用计算机模拟方法研究了氟虫腈与鱼类GABA A受体的相互作用，即采用同源模建的方法构建了斑马鱼α1β2γ2 型GABA A受体模型，运用分子对接考察氟虫腈（及其代谢物）与鱼类GABA A受体间的作用模式，阐明了氟虫腈产生鱼毒的机理。③利用生物模板法，合成了粒径分布1.5μm非磁性及磁性单分散二氧化硅，进一步采用反相悬浮包埋法成功制备琼脂糖-二氧化硅亲和层析载体。④利用氟虫腈和RO7作为亲和配基制成亲和层析色谱柱，采用亲和层析法初步分离了鱼类GABA A受体，探索了两种亲和柱对鱼类GABA A受体分离的条件。
本论文取得的主要研究结论如下：
1）1,4-苯二氮卓药物制备方面：1,4-苯二氮卓药物在脊椎动物GABA A受体研究中具有极大的重要性，本课题设计并合成了1,4-苯二氮卓药物RO7及洗脱剂氟西泮，对其合成条件进行了详细的探讨，中间产物及最终产品的结构均通过核磁共振氢谱，红外光谱、熔点仪等测试手段确证。
2）荧光探针法研究1,4-苯二氮卓药物与鱼类GABA A受体相互作用方面：