CHO细胞无血清培养基技术手册

CHO细胞无血清培养基技术手册

1 CHO细胞

CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck 从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。

ATCC提供的CHO-K1细胞照片

CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO细胞。

二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用dhfr基因进行筛选时，首先将重组DNA分子导入dhfr-表型的受体细胞，然后撤除原培养基中的的次黄嘌呤和胸苷，即可获得dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。因此在挑选表达外源基因的阳性克隆细胞时需选用不含次黄嘌呤和胸苷的培养基。另外，氨甲喋呤（MTX）选择压力可使CHO/dhfr-细胞的外源基因的拷贝数扩增并得到较高水平的表达。

CHO-GS细胞是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞CHO，再通过L-氨基亚砜蛋氨酸(methionine sulphoximine，MSX)等化合物选择加压促使GS基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺培养基中生长、增殖，可避免或减少细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积累的氨对细胞的损伤、抑制作用。

ATCC提供的CHO/dhfr-细胞照片

2 CHO细胞表达系统的优势与特点

由于哺乳动物细胞结构、功能和基因表达调控的复杂性，外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较大差异，因而外源基因在哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细胞中的表达所需的元件。外源基因在哺乳

动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质的加工等过程，如蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成以及蛋白质分子内或分子间二硫键的形成等比较复杂，要表达具有生物学功能的蛋白质如膜蛋白、抗体和具有特异性催化功能的酶需要在哺乳动物细胞中进行。

哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则是来源丰富、转化效率高、表达效果好，CHO细胞作为表达系统除具有上述的特点要求外，还有以下优势：

1）外源基因被整合到宿主染色体上后，在没有选择压力的情况下能稳定保持；

2）适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；

3）对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；

4）细胞可进行贴壁培养也可进行悬浮培养，且具有较高的耐受剪切力和渗透压能力；

5）可进行高密度大量培养，进行较大规模生产时其培养量可放大到20000L以上，是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一。

另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在无血清培养基（SFM）中生长良好。

3 CHO细胞在生物制药中的应用

目前已有多种外源基因如人组织性纤溶酶原激活剂（tPA）、人促红细胞生成素（EPO）、乙肝表面抗原（HBsAg）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素β（IFNβ）、白细胞介素2（IL2）、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。在美国已注册的大约73种蛋白药物生产中，应用哺乳动物细胞培养的有35种，CHO细胞培养的就占27种，其中包括10种单克隆抗体。下表是以CHO细胞培养为基质生产的重组制品。

4 无血清细胞培养基

无血清培养基的出现是培养基发展历程上的一个里程碑，其一般是在合成培养基的基础上，引入成分完全明确的或部分明确的血清替代成分，使培养基能满足动物细胞培养的要求，又可有效的克服因使用血清所引发的问题。进入20 世纪80 年代后，新的无血清培养基不断问世，人们经过研究发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白（fibronectin）、转铁蛋白（Transferrin, TRF）、胰岛素（Insulin）和表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）等，不少细胞即能在无血清供应的情况下生长，尤其是CHO、杂交瘤、骨髓瘤细胞以及BHK21 细胞等。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。

目前，无血清培养基的研究有两个方向：一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分；二是培养基中不含有不明确的添加组分。依此可以将当前应用较多的无血清培养基归纳为以下四种：

(1)无血清培养基，为一般意义上无血清培养基，用各类可替代血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白(BSA) 、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高,添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。

(2)无动物来源培养基，许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全考虑，培养基中的添加组分无

动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。

(3)无动物蛋白培养基，培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。

(4)化学组分限定培养基，此类培养基是目前最安全、最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组份。其特点是培养基的性质明确，有利于进行细胞培养的代谢研究，同时分离纯化也比较方便。

研究者对CHO细胞无血清培养基的开发比较深入，目前有多种用于CHO细胞无血清培养的培养基面世，形成了很多固定的商业配方，这些配方有的是专利保护的，有的是商业秘密。国外有部分优秀的无血清培养基，但价格昂贵。

CHO细胞存在多种克隆细胞系，仅ATCC保存的CHO细胞就多达38种，再加上各公司或研究单位构建的细胞，其克隆细胞数量远不止这些。对于CHO细胞无血清培养而言，由于构建的各种高性能CHO细胞系不同，不同克隆细胞的营养要求也都非常的不同，对营养要求往往是个性化的。另外，CHO细胞培养过程的不同培养阶段、重组CHO细胞构建的各个阶段，细胞代谢所需的营养或限制因素也是不同的，即同一细胞系在整个培养过程也需要使用不同的培养基，需要与之相对应的个性化培养基（Customed Cell Culture Medium）。

5 CHO细胞无血清无动物组分培养基（SAF-CHO-G-004）

其实个性化培养基并不新鲜，在国外生物制药企业普遍采用个性化培养基，世界著名的生物制药公司（如Amgen、Genetech）往往和培养基企业合作，通过细胞培养基的客户定制方式，研制最适合自身细胞特点的个性化细胞培养基应用于生产实践，用于提高细胞产率和生产效率。另有数据显示，国际上的细胞培养基生产企业，个性化、定制培养基占其培养基业务的90%以上，目录培养基不足10%。

北京清大天一生物技术有限公司依托于在细胞培养基研发和动物细胞大规模培养方面具有丰富经验的研发团队，潜心研究，开发研制了多种个性化培养基，通过在生产实践中的应用已取得可喜的成果，如CHO细胞无血清无动物组分细胞培养基（SAF-CHO-G-004）就是其中之一。

5.1 CHO细胞无血清无动物组分培养基（SAF-CHO-G-004）的特点

SAF-CHO-G-004（代码：SAF108）是北京清大天一生物技术有限公司开发的新一代CHO细胞无血清无动物组分细胞

培养基，能支持多种CHO细胞的生长维持，可广泛应用于CHO细胞的无血清悬浮培养及抗体、重组蛋白的生产过程。细胞培养基产品的生产、检验严格执行GMP管理和ISO9001管理体系，符合生物制药原辅料要求，质量稳定可靠。

1）SAF-CHO-G-004细胞培养基系无血清无动物组分培养基，不含有血清替代物、动物来源蛋白等动物来源组分，化学成分明确，保证了细胞培养中原辅料的使用安全性；

2）SAF-CHO-G-004细胞培养基能支持多种CHO细胞的生长、维持，具有较为广泛的适用性；

3）适用于实验研究和大规模培养应用；

4）根据用户的不同使用，可定制SAF-CHO-G-004培养基，以满足CHO/dhfr-、GS-CHO等不同系统的应用需求；

5）有多种包装规格可供选择，满足不同用户的使用需求。

5.2 CHO细胞无血清无动物组分细胞培养基培养效果

使用SAF-CHO-G-004细胞培养基培养已驯化过的CHO细胞，图1是CHO细胞接种密度为2×105cells/ml时的细胞生长曲线，可以看到，经过3－4天的培养过程，细胞密度可提高到细胞4-5×106cells/ml，细胞活率超过90％，细胞扩增了二十多倍。图2是细胞批培养的葡萄糖和乳酸代谢情况。图3和图4分别表示培养了96小时（4天）的CHO台盼蓝染色和细胞显微照片，细胞形态饱满、健康。

图1.CHO细胞生长曲线图2. CHO细胞批培养葡萄糖和乳酸代谢情况

图3 培养96hr的台盼蓝染色的CHO细胞图4 培养第96hr的CHO悬浮细胞

5.3 CHO细胞无血清无动物组分细胞培养基使用说明

5.3.1 成分

SAF-CHO-G-004细胞培养基毎升标示量27.80g，含L-谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸苷，可根据客户使用需求定制不含谷氨酰胺或次黄嘌呤、胸苷的无血清培养基，具体的成分、标示量等详见对应产品的说明书。

5.3.2 贮存

2℃－8℃冷藏，干燥、密封、避光贮藏。【贮存期限】：暂定一年。

5.3.3配制方法（以1L包装为例）

1.1)将一袋粉末培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器，加注射用水（水温20℃

-30℃）到950毫升，轻微搅拌溶解；

2.2)加入1.9克碳酸氢钠；

3.3)轻微搅拌溶解，加注射用水至1升；

4.4)如有必要，用1mol / L 氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH至所需值；

5.5)用0.2μm滤膜正压过滤除菌；

6.6)溶液应在2℃-8℃下避光保存。

5.3.4 SAF-CHO-G-004培养基不同NaHCO3加量的pH、渗透压参考对照表

5.4 CHO细胞无血清驯化

在含血清培养基中生长的CHO细胞可经过一定的细胞驯化过程，适应SAF-CHO-G-004细胞培养基，进行细胞的无血清培养。已经适应无血清培养的CHO细胞可直接在SAF-CHO-G-004中实现无血清培养培养，建议前二代的细胞密度不低于4×105cells/ml。

细胞的无血清驯化过程如下：

1.取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95%，开始进行无血清驯化。

2.细胞驯化可以在方瓶（T-flask）、摇瓶（shake-flask）或转瓶（spinner-bottle）中进行。

3.将无血清细胞培养基和含血清培养基的按1：1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2－4×105cells/ml的细胞，

在37℃、5％CO2培养箱进行培养。

4.根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一阶段可稳定传代1－3代，接种密度维持在2- 4×105cells/ml。

5.逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维

持为2- 4×105cells/ml。

6.直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在CHO无血清

无动物组分培养基中。

7.在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO种子细胞库。

清大天一个性化细胞培养基主要特点

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人干细胞无血清培养基

人干细胞无血清/无饲养层培养基 Stemmera TM人无血清/无饲养层培养基（SFM）是在无血清和饲养层情况下，用于培养人的干细胞能支持干细胞的生长，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。 规格: 500ml 产品描述： Stemmera TM人ESCs/iPSCs无血清/无饲养层培养基(hStemSFM)是一种成分明确的即用型培养基，特殊的配方，在完全无血清和无饲养层环境下能用于人诱导多能干细胞（hiPSCs）和胚胎干细胞(hESC)的重编程、增殖和维持。 产品成分： 两种成分混合后是一种即用型完全培养基 存储和运输： Stemmera TM hStemSFM中的两种成分是分开运输的，基本培养基在室温下运输然而SFM添加物是在干冰环境下运输。在收到产品后基本培养基需存储在2-8°C环境中而SFM 需要存储在-20°C，避免多次冻融。完全培养基储存在2-8°C的黑暗环境中能使用长达1个月。完全培养基分成等份的供每日使用，避免反复预热，避光保存最佳。 产品使用：该产品是仅用于体外使用和研究使用。不可用于人类或动物的诊断或治疗使用。 使用注意事项： 1.使用aerosol barrier枪头，每次用完更换新的枪头。 2.要用新的，干净的手套和穿实验服。 3.材料安全数据表（MSDS）可在网站下载。

4.用70%乙醇或其他合适的消毒剂清洁工作空间。 培养条件: 培养基：Stemmera TM hStemSFM。 细胞：人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）。 培养类型：单细胞传代和贴壁培养。 温度范围：37°C。 孵育器的环境：在含5% CO2或5% O2的潮湿环境中，确保适当的气体交换，减少与外界接触。 建议培养容器：基质胶包被的板子、皿或烧瓶（Corning，货号：356231，稀释比1:100），根据容器的大小，调整细胞数量。 操作手册: ?完全SFM培养基的制备：添加3.5ml冷冻SFM添加物（货号 ST02001-S1）到500ml 基础培养基中（货号st02001-bm 500ml），搅拌均匀，0.22μM滤膜过滤。 ?将完全培养基分成等份并在室温下预热SFM供每天使用。。 ?Corning基质胶包被培养容器：使用Corning基质胶（货号356231，稀释比1:100）包被容器，在5% CO2或5% O2（低氧孵育器）的孵育器中37 o C孵育至少30min或过夜。 已包被的容器能在一周内使用。使用前，立即倒掉所有的基质胶，更换预热的完全Stemmera TM hStemSFM培养基。 注意：所有成分在有效期内存储在黑暗的2-8o C环境中，完全培养基StemmeraTM hStem SFM 能稳定储存时间长达4周。 在完全培养基hStemSFM 中hiPSCs 和hESCs的复苏 1.37°C水浴迅速解冻一小瓶冷冻人干细胞。 2.用移液管轻轻将小瓶中的所有干细胞都吸入含完全培养基的15ml无菌离心管中。 3.在1000转下离心5min。 4.吸弃上清液，尤其小心避免干扰细胞颗粒。 5.在含10nM Rock 抑制剂Y27632（Fisher Scientific, 货号50-863-7）的1ml预热完全培 养基中重悬细胞。

无血清培养基的研究进展

[17]　FDA news FDA add boxed waming for heart2related risk to antrdinbetes drug A vandial[E B/OL].2007211214.http// www.fdagov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW0173him1. [18]　EMEA:Questions and answers on the benefits and risk of rosiglitazone[EB/OL].2007210218[2007212215]. http//www.emeaeuropaeu/pdfs/human/press/pr/48446407 en pdf. [19]　张杰.罗格列酮心血管安全性问题尚需监测与进一步 评价[J].中国临床药理学杂志,2008,24(1):92294. [20]　Lars Slordal,Olav Spigset.Heart Failure Induced by Non2Cardiac Drugs[J].Drug Safety,2006,29(7):5672 586. (收稿日期:2009202219)无血清培养基的研究进展 梁　菁,李多伟(西北大学生命科学学院,陕西西安710069) 摘要:目的　总结无血清培养基的组成、主要补充因子及作用、应用以及新近研究进展,为细胞培养等研究工作提供参考。方法　查阅国内外文献资料进行整理和归纳。结果　无血清培养基克服了完全培养基的种种弊端,且关于无血清培养基的研究取得了诸多进展。结论　无血清培养基在生产实践中已得到广泛应用,进一步提高其通用性、降低成本、用于大规模生产的方法有待探索。 关键词:无血清培养基;补充因子;研究进展 中图分类号:R97 文献标识码:A 文章编号:100422407(2009)0420325203 动物细胞培养技术近年来发展迅速。传统的含血清培养基中的血清给生产与科研带来多种不利因素。血清的主要作用在于给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质,但其存在多种缺点:具有批间差异、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化、容易被病毒和支原体感染;血清昂贵,可能发生供应紧张,血清的来源不稳定等问题。无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分,既能满足细胞的培养要求,又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因而无血清培养基得到了越来越普遍的应用,而且无血清培养基技术也迅速发展并取得了许多进展。1　无血清培养基的发展过程 无血清培养基的发展大致经过了三代,第四代培养基的研制开发并投入市场将成为发展趋势[1](见表1)。 表1　无血清培养基的发展过程 成分优缺点 第1代不含血清,但含有大量的动物或 植物蛋白如BSA和动物激素等。蛋白含量高(低于有血清培养基),不利于目标蛋白的分离纯化,降低回升率,增加成本。 第2代完全不用动物来源蛋白(无动物 衍生蛋白)。降低生产成本,加快报批的速度(目前市面上销售的主要产品)。 第3代完全没有蛋白或含量极低。化学成分确知,细胞培养与生产容易做到恒定, 分离纯化容易,成本低,管理容易。仅限于应用 几株细胞系。 第4代无血清,无蛋白。适合多种不同细胞生长并可高温消毒。2　无血清培养基的组成及其主要补充因子 无血清培养基一般认为是由两部分组成,即基础培养基和替代血清的补充因子。 2.1　基础培养基　无血清培养基的基础培养基一般为与所需培养细胞相应的合成培养基,是按细胞生长需要由一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等组成的。在对不同的细胞进行培养时可根据需要对基础培养基和某些组分进行相应的调整。 2.2　补充因子　补充因子是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称。这些补充因子可使培养基既能满足动物细胞培养的要求,又能有效避免血清培养基成分不明确、有批间差异、常被病毒和支原体污染、血清来源不稳定、细胞产品不易纯化等问题。补充因子可分为如下几类[2]。 2.2.1　激素和生长因子　激素可分为多肽类激素和甾体类激素。多肽类激素有胰岛素、生长因子、胰高血糖素等;甾体类激素有孕酮、氢化可的松、雌二醇等。多肽类生长因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等[3]。 在细胞无血清培养中,胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成,抑制细胞凋亡,是重要的细胞存活因子[3]。Jan等[4]认为在批式培养中胰岛素迅速耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。氢化可的松能促进细胞贴壁和细胞分离,在某些情况下会诱导细胞生长和诱导细胞分化[3]。 2.2.2　结合蛋白　无血清培养基中的结合蛋白主要是白蛋白和转铁蛋白。白蛋白可通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定并调节上述物质在无血清培养基中的活性,此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用[1,5]。大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体,受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源,此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其它微量元素如钒等结合[6]。 2.2.3　贴壁和铺展因子　绝大多数的动物细胞在体外生长时需要固着于适宜生长的基质上,并铺展成一单层,才能开始增殖。目前在无血清培养中常用的贴壁和铺展因子有纤黏蛋白、胶原、聚赖氨酸、昆布氨酸、血清铺展因子等[1,2]。 2.2.4　微量元素和低相对分子质量营养元素　一些细胞系的无血清培养还需要补充某些低相对分子质量的化学物质,如微量元素、维生素、脂类等。微量元素能消除过氧化物酶和氧自由基对细胞的损害,维生素参与代谢、抗氧化等[3],维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢,维生素C和维生素E 具有抗氧化作用。丁二胺和亚油酸等提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质[1]。 2.2.5　酶抑制剂　有时将细胞用酶处理后会有一些酶残留,此时若不对残余的酶加以处理可能会对细胞不利,应加入相应的酶抑制剂终止残余酶的作用以达到保护细胞的作用。 3　无血清培养基的研究进展 由于近年来动物细胞体外培养技术的迅速发展以及无血清培养基在动物细胞培养中的广泛应用,与无血清培养基相关的研究在近几年来也取得了很大的进展,主要表现在以下方面。 3.1　有关无血清培养基的新方法　在人牙龈上皮细胞培养

动物细胞培养及无血清培养研究进展

动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容

2019-2025年全球及中国无血清培养基行业调研报告

2019-2025年全球及中国无血清培养基行业调研报告 喵咪产业服务（微信公众号） 第一章产业概述 1.1 无血清培养基定义 无血清培养基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顾名思义，就是在细胞培养中不需要添加血清，但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可简化纯化和鉴定各种细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。 1.2 无血清培养基分类 目前，无血清培养基的研究有两个方向：一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分；二是培养基中不含有不明确的添加组分。依此可以将当前应用较多的无血清培养基归纳为以下四种： 1.一般意义上的无血清培养基，用各类可代替血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白（BSA），转铁蛋白，胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高，添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。 2.无动物来源培养基：许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。 3.无动物蛋白培养基：培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。 4.化学组分限定培养基，此类培养基是目前最安全的，最为理想的培养基，首先可以保

无血清培养人脐带间充质干细胞的文献整理

无血清培养人脐带间充质干细胞的文献整理 人间充质干细胞培养基的发展 第一代培养基+牛血清 第二代培养基+牛血清替代品：人血清、血小板裂解液和脐带血清 第三代无血清、无动物源、成分确定的培养基 第三代人间充质干细胞培养基不含牛血清或人血清之类的血清替代品，无动物源而且成分确定，免除了异种血清带来的病原体污染风险，而且批次稳定，适合干细胞治疗的临床研究。 一知网 搜索方法 使用题名“脐带”、“间充质干细胞”和“培养”，摘要“无血清”在中国知网搜索，共18篇文献。 人脐带间充质干细胞无血清培养相关整理

二Pubmed 搜索方法 使用(Umbilical Cord[Title] AND Mesenchymal Stem Cells[Title]) AND serum free[Title/Abstract] 在Pubmed搜索，共20篇。 人脐带间充质干细胞无血清培养相关整理 参考文献 一知网 [1]赵艳坤,邵伟,雒诚龙,余雄.无血清共培养条件下脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用（英文）[J].中国实验动物学报,2017,25(04):391-398. [2]屈玟,宋磊,赵瑶,胡振波.人脐带间充质干细胞不同培养方案的比较与优化[J].海南医学院学报,2017,23(08):1009-1013. [3]孙亚如,张炳强,王福斌,许评,王二朴,李翠翠.培养体系对维持人脐带间充质干细胞特性及其体外扩增效率的影响[J].中国组织工程研究,2017,21(13):2023-2028. [4]刘宇,马明,侯俊,高雪华,陈思翔,刘月,邓银,郑东明,田奕,张蓉,陈静娴.体外培养传代人脂肪、脐带、胎盘间充质干细胞的遗传特性比较研究[J].中国细胞生物学学报,2015,37(12):1616-1622. [5]吴洁莹,陆琰,陈劲松,吴韶清,汤雪薇,李焱.脐带血血浆分离培养脐带间充质干细胞及体外扩增人脐血CD34~+细胞的研究[J].中国实验血液学杂志,2015,23(04):1112-1119. [6]任春红,张昕.无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究[J].延安大学学报(医学科学版),2015,13(01):1-4. [7]陈林,张坤,董伟,杨珂,艾辉,陈禄华.脐带间充质干细胞无血清和含胎牛血清培养体系比较[J].重

vero细胞无血清培养基培养技术与应用

V ero细胞是日本学者Y asumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴附依赖性细胞系, V ero一词由世界语中的verde(意为绿色的)和reno意为肾脏的)两个词合并而成。V ero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，V ero细胞具有以下特点:①来源方便，可连续传代，生长速度快;②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高;③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高;④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。疫苗的接种对象主要是大范围的健康人群，其质量和安全性一直是备受关注的首要问题。疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程。血清是一种组分复杂而尚不完全明确的混合物，至少含有1 000种不同的蛋白质，总蛋白量高达60~150g/L，它能为细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分。受V ero细胞自身的贴附依赖生长特性和动物细胞培养技术发展进程的影响，本世纪之前的V ero细胞培养及病毒疫苗生产均存在着对血清的依赖。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度;从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，如引起牛海绵状脑炎的阮病毒，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患阎。 由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括V ero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势问。2010年，美国、欧盟和日本等发达国家将全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。 V ero细胞无血清培养基的研究和商业开发 1.1 V ero细胞无血清培养基的研究 培养基是影响体外培养细胞生长代谢、增殖乃至生存的最直接和最重要的环境因素。V ero细胞无血清培养的技术关键在于无血清培养基的设计和优化。 设计V ero细胞无血清培养基组成配方的技术核心是筛选和确定具有促进细胞贴附生长、维持细胞存活、提高病毒扩殖效果的培养基组成成分。基于细胞生长和代谢的高通量分析及Plackett-Burman实验设计和Box-Behnken响应面设计是V ero细胞无血清培养基设计和优化的主要技术。V ero细胞的培养需要在适宜的介质表面贴附、铺展才开始有丝分裂、增殖，病毒的有效感染和增殖也有赖于细胞的贴附生长状态。此外，在某些病毒疫苗(如流感病毒疫苗)的生产过程中，需要在培养基中加人一定浓度的胰蛋白酶以提高病毒的感染和增殖效率。另一方面，病毒的感染和增殖不仅是细胞代谢负荷不断加大的过程，也是细胞病变、以致凋亡和坏死、甚至裂解的渐进性过程。V ero细胞无血清培养基的设计和优化相对于应用于动物细胞悬浮培养工艺生产重组蛋白、特别是治疗性抗体生产的无血清培养基更具挑战性。 设计V ero细胞无血清培养基的较为便捷和有效的策略是以DMEM,F-12,M199和RPMI1640等商品化的合成培养基的单独使用或联合使用为基础培养基，以反映细胞生长和代谢的主要参数为评价指标，结合统计学方法确定向其中添加生长因子、激素、结合蛋白及豁附因子、微量元素、脂类和脂类前体物等的种类和浓度。无血清培养基中常用的黏附因子主要是存在于细胞间质和血清中的胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白，如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原等。其中，纤粘连蛋白和层粘连蛋白不仅具有提高细胞的砧附力及活力的作用，同时在促进有丝分裂中也起着重要的作用。某些含有精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)序列的短肤也能够有效地促进V ero细胞贴附到以聚苯乙烯和醋酸纤维素为材

什么是“真正的无血清”间充质干细胞培养基

什么是“真正的无血清”间充质干细胞培养基 近几年，随着细胞治疗的进展，对细胞体外培养的关注热度也在不断提高，作为药品监管的细胞制品，跟所有的药品一样，其评价标准也是“安全性、有效性”。因此培养间充质干细胞的培养基，就成为了研究、应用MSC细胞的企业、科研机构的核心关注点。 市场上突然多出了许多“无血清”培养基，价格从1000-4000不等。弄得用户一头雾水，不知所以。 友康生物作为中国无血清培养基领域的领先企业，经常被客户问起这个问题，换位思考，也觉得确实有必要把这个问题给用户说清楚。 “无血清”间充质干细胞培养基，是指某种培养基可以培养MSC细胞，不需额外添加任何组分，并且这种培养基中没有添加血清。 市场上的“无血清”间充质干细胞培养基产品，可分为三类。第一种是“假的无血清”MSC 培养基；第二种是“揣着明白装糊涂的无血清”MSC培养基；第三种是“真正的无血清”MSC 培养基。以下就简要介绍下这三种产品的历史由来及如何简单的去区分。 一、“假的无血清”间充质干细胞培养基，产品形式一般为1瓶450ml的培养基，培养一瓶50ml的添加剂。销售方称之为无血清添加剂，但其是货真价实的血清。做过细胞实验的都清楚，使用基础培养基一般都要添加10%比例的血清。这种产品来源于实验室的发现，由于不同批号的血清，来自不同种群的牛，血液的成分有所不同是自然的事情，有的血清中的EGF的含量相当低，而EGF对促进细胞生长的作用又很大。所有有经验的实验室老师一般在用血清培养基培养MSC细胞时额外添加一些EGF,会有更好的培养效果。一些企业在血清中额外添加了EGF，称之为“无血清添加剂”。这种产品，在市场上比较少，也比较容易辨识。 二、“揣着明白装糊涂的无血清”MSC培养基。这种产品，很有迷惑性。他确实没有添加血清，因此，从字面理解，是无血清。但他加了牛血，更具体说是牛的血小板。我们都清楚，血液笼统可分为血清、血浆、血小板。在10年前，有人就发现，通过将血小板冷冻、再融化；再冷冻、再融化这种反复冻融的形式，可促使血小板裂解，将其中的物质释放出来，加入培养基中，可以收到与血清相类似的培养效果。由于血小板的含量比较少，一直以来都是作为血清生产的下脚料，后来伴随血清价格的上升，处理下脚料在经济上显得划算了起来。所以，就出现了血小板裂解物这样的产品，有的公司命名为“血清替代物”。从产品形式来看，一般装量为20ml，可以添加到500ml的基础培养基中（比如DMEM/F12，a-MEM）或添加到1000ml的减血清培养基中。这种产品，在市场上为数不少，比较有迷惑性。确实没有加血清，但是加了血小板。

CHO 细胞无血清培养基技术手册2009

CHO细胞无血清培养基技术手册2009 北京清大天一生物技术有限公司 BEIJING TSINGHUA SKYWING BIO TECH Co.,LTD. 2009年9月

1 CHO细胞 CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC 保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。 ATCC提供的CHO-K1细胞照片 CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO细胞。 二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用

7 间充质干细胞无血清培养基

质干细胞基础培养基（BM0001）、AdvCell?干细胞培养添加剂 A（SCM0001A）以及AdvCell?干细胞培养添加物 B（SCM0001B）于37℃解冻并迅速混合。 2.完全培养基的存储：配制好的完全培养基放在4℃冰箱避光保存，并尽量在一个月内使用完。 3.根据需要，培养过程中可添加一定剂量青霉素∕链霉素(P∕S)。 4.为达到最佳培养效果，所有细胞培养皿或培养瓶在接种细胞前用细胞垫材料（Cellpad）（BCP0001）包 被过夜或室温包被2小时，包被后用吸管取走多余的 AdvCell? 细胞垫材料（BCP0001），再接种胞。5.如客户用自己配制的冻存液冻存的细胞是用作临床治疗，应避免用甘油作为保护剂。 ★培养条件 37℃，5%CO2 ，无菌恒温培养箱培养。 ★细胞培养 【复苏】 1.将配置好的完全培养基放入37℃水浴中预热5-15 min； 2.从液氮中取出干细胞迅速放入37℃水浴快速解冻（解冻后不要继续孵育细胞）； 3.在超净台中加入5 ml的完全培养基重悬细胞，1000 rpm离心5 min； 4.弃上清，加入 5 ml的完全培养基重悬细胞，转移到T-25培养瓶中（带滤芯）； 5.将培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养； 6.第二天用新鲜的完全培养基给细胞换液。 【培养】 1.在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80%时，即可传代； 2.37℃水浴预热完全培养基； 3.在超净台中，弃掉T-25细胞培养瓶中的培养基，加入2 ml PBS清洗，再加入1 ml 0.25%胰酶-EDTA 消化细胞；

4.在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5 ml 完全培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞转移到15 ml离心管中，1000 rpm离心5 min； 7.弃上清,加入15-20 ml的完全培养基重悬细胞后转入T-75细胞培养瓶中或按适当比例传到T-25细胞培养瓶中。确保后融合度在25-50%之间，细胞密度在1×104cells/cm2（2.5×105 cells/T-25瓶），混合细胞悬液，确保细胞均匀分布； 8.将细胞培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养； 9.每两天用新鲜、预热的完全培养基进行换液。 【冻存】 1.细胞消化和计数，用胰酶对待冻存的细胞进行消化，并对细胞进行计数。 2.1000 rpm离心5 min，去掉上清。 3.根据细胞计数的情况，加入适量的冻存液，使细胞密度在1×106/ml左右（或根据自己希望达到的细胞 密度）。 4.轻轻地重悬细胞（务必重悬均匀），将重悬的细胞按等份加入到灭菌的冻存管（需提前做好标记或者贴 上标签）中，旋紧冻存管盖。 5.将冻存管放入程序降温冻存盒中，然后将冻存盒直接放入-80℃。 6.第二天将细胞从-80℃转移到液氮中。

无血清培养基试验总结

用无血清培养基制备V ero细胞 狂犬病疫苗的实验研究 1材料 细胞株： V ero 细胞（中国典型培养物保藏中心CCTCC） 病毒株： CTN-1V株（中国药品生物制品标准化研究中心） 培养基及添加物： Medium 199（Gibco公司） 无血清培养基（Gibco公司、Hyclone公司） 新生牛血清（兰州民海生物有限公司） 细胞培养容器： T75培养瓶，2L转瓶，10L瓶 仪器设备： 细胞培养恒温室，XDS倒置显微镜，转瓶机，7.5L生物反应器 2方法 2.1 2L转瓶试验方法 2.1.1具体步骤 用T75细胞瓶培养复苏的V ero细胞，按照常规方法传代扩增至一定数量的2L转瓶中，待细胞长至均匀单层后接种病毒，换为不同浓度（分别为100%、50%、25%）的两个厂家的无血清培养基作为维持

液，同时以传统培养基（M199+0.2%人血白蛋白）作为对照组，根据病变情况收获病毒液并超滤层析。 2.1.2结果及讨论 2.1.2.1细胞状态比较 均匀的单层细胞接种病毒后,在尚未出现病变时，SFM试验组的细胞，体积略大于人白对照组的细胞，细胞轮廓清晰、饱满，病变的出现亦稍晚于对照组；约3-4天时均有病变产生：细胞面呈网状，有脱落、游离细胞。至5-6天收毒时，SFM试验组的细胞维持较好，未脱落细胞多于对照组，细胞维持时间较对照组长。 人白对照组细胞： Hyclone SFM 试验组细胞：Gibco SFM 试验组细胞：

2.1.2.2滴度比较 2.1.2.2.1 100%SFM(Gibco)作为维持液与2‰人白M199作为维持液所收获的病毒液相比，滴度结果基本一致；但100%SFM(Hyclone)作为维持液的病毒液滴度稍高于人白对照组。（见表一） 表一 2.1.2.2.2在以不同浓度SFM作为维持液的试验中，两者之间差别不明显。（见表二） 表二

无血清培养基介绍

无血清培养基 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-17 12:29 文章来源：丁香园 分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养培养基点击次数：1026 无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。 无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分 1.促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 2.促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 3.酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。 4.结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 5.微量元素：硒是最常见的。 使用方法 目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。 为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：

细胞血清培养基和无血清培养基的配制以及区别

细胞血清培养基和无血清培养基的配制以及区别 细胞培养基是如何配制的？培养细胞的完全培养基由基础培养基和添加剂(如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子)组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是迈健基础培养基和迈健培养基营养添加物的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而迈健培养基也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂(例如核苷酸)。现应用于快速生长的细胞，同培养基含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培养基中这两种物质缺乏时)。但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清用于神经元培养，也有人用马血清来培养胶质细胞。用大鼠进行神经元培养的某些研究者喜欢使用同型血清;人类的胎盘血清，亦曾用于神经组织的器官类型的培养，也用在一些特殊培养种类中。 血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞输入人体，所以可能存在人体异源体排斥和冲突，有一定风险，现如今该研究领域为了规避这样的风险，研究发明了迈健细胞无血清培养基，取代血清培养基的不利因素。 无血清培养基 1979年神经细胞培养出现了一个重要进展，用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中添加血清。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质的

无血清培养基应用

无血清培养基应用 细胞培养就是从机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。体外细胞培养最常见的是合成培养基如DMEM,F12,MEM等混合一定比例的牛血清进行培养;但是大量使用牛血清制品有许多缺陷，如，动物源成分，无法用于临床研究;成分复杂，批间差大，质量不稳定，重复性差，影响实验和生产，而且极易引起交叉污染，所以无血清培养正在替代有血清培养。 无血清培养基成分 无血清培养基成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分 1.促贴壁物质 许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 2.促生长因子及激素 针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 3.酶抑制剂 培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶;抑制剂。 4.结合蛋白和转运蛋白 常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。

间充质干细胞无血清培养基

间充质干细胞无血清培养基 MSC NutriStem? XF Medium 一、目的：利用间充质干细胞无血清培养基培养分离之脐带间充质干细胞 二、材料：新生儿脐带 三、主要仪器：医用手术器械，生物安全柜，CO 2 培养箱，6孔培养板(CORNING), T25培养瓶(CORNING) 四、主要试剂： 表 1 实验中用到的主要试剂

五、实验前准备： 5.1 完全即用型培养基的准备 1) 冻存的NutriStem? MSC XF Supplement 间充质干细胞无血清添加物需要在室温 或2-8℃解冻，避免反复冻融及照光。 2) 完全培养基配制：NutriStem? MSC XF Basal Medium (培养基)：NutriStem? MSC XF Supplement (添加物)：青链双抗 = 500 ml : 3 ml : 5 ml ，4℃保存，2周内使用。(注：双抗非必须) 5.2 MSC 贴壁试剂包被培养皿 1) 使用无菌的DPBS 溶液 (货号: 02-023-1，不含Ca 2+ and Mg 2+)，将MSC 贴壁试剂稀 释100倍 (1:100)，用移液管轻轻搅拌混合。 2) 用稀释过的MSC 贴壁试剂涂层培养皿。 3) 使用合适的量以涂层培养孔或板，使用量参照表2。 4) 轻轻摇动培养皿，用封口膜包裹涂层的培养皿，然后在2-8℃孵育过夜；或者在 CO 2 培养箱 (37℃,至少孵育30分钟)。 5) 接种前，用DPBS 轻轻冲洗培养皿。 表2 涂层过程中贴壁试剂建议使用量 厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用)

六、试验方法： 6.1 MSC 原代培养 1) 无菌条件下取新鲜脐带，用DPBS 漂洗净血迹 (如怀疑污染，可先在75%医用酒精中浸泡 2min)。 2) 置10 cm 培养皿中，剪成1~2 cm 脐段，剔除血管，用DPBS 洗净血迹，再剪成1mm 3 组织块。(图 1) 3) 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。 4) 37℃, 5% CO 2培养箱孵育 30min 以使组织块黏贴在培养皿壁上。 5) 向每孔滴加0.8ml 完全培养基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块)。 6) 37℃, 5% CO 2 培养箱孵育过夜，次日 (d1) 每孔再补加1ml 完全培养基。 7) 37℃, 5% CO 2 继续培养，5天 (d6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞，但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出)。 8) 再过5天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出，但最晚可到14天会出现细胞从组织 边沿爬出) (图2、图3)。 9) 此后，每2天换一次培养液，继续培养2~4天，待细胞达到约60~70%后传代培养 (图4)。 注意：组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。 6.2 MSC 传代培养 1) 待细胞饱和度达到约60~70%后进行传代(细胞不能太密集，否则容易分化)，吸弃需传代板孔中的培养基，每孔加适量DPBS 轻轻冲洗1次。 2) 根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA (货号：03-079-1)，37℃, 5% CO 23) 根据重组胰酶-EDTA 使用量加入10倍的 培养箱作 用 2~3 min ，用吸管吹打培养皿底部，镜下观察细胞完全脱落后。 大豆胰酶抑制剂 (货号：03-048-1，用DPBS 稀释50倍)，1200×rpm 离心3~5min 。

无血清细胞培养

无血清细胞培养 摘要：本文综述了动物和昆虫细胞培养对细胞培养基的要求，并且在总结细胞培养基化学成分的基础上归纳了细胞无血清培养的条件和目前的研究现状。 关键词：细胞培养无血清 细胞培养是从生物体内取出细胞, 模拟其体内的生理环境, 在无菌、适温和丰富的营养条件下, 使细胞生存、生长并维持结构和功能的技术。 细胞培养基成分要求 在动物和昆虫细胞培养中，培养基是细胞培养的关键, 培养基是细胞赖以生长、增值、分化的重要因素。不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求, 至少有14种必需的氨基酸是细胞本身不能合成而必须由培养基提供的。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质, 维生素对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有作用, 泛酸、异已酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的,胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖, 无机盐在培养基中维持昆虫细胞生长的渗透压。水解乳蛋白和酵母提取物是昆虫细胞培养基中最常用的添加物。缺少谷氨酰胺会影响到细胞的生长速度，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。因此，昆虫细胞自身合成谷氨酰胺不如直接在培养基中摄取有效，所以各类培养基中都含有较高浓度的谷氨酰胺。有机酸，单独测试时只有苹果酸有生长促进作用。联合使用时，则对细胞生长有显著的促进作用。一般认为，泛酸、异己酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的，而胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖。在昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，这是因为昆虫细胞要在高于哺乳动物细胞生长的渗透压中生长，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na+／K+比例在某些细胞系中有严格的要求。某些微量元素如Fe2+、Mn2+、Cn2+、Zn2+、A13+等能促进细胞贴附和增加产量，其中A13+和Zn2+还可以促进病毒的感染和复制。在昆虫细胞悬浮培养中还需添加一些多聚物如甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮和聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物等，以保护细胞免受机械剪切力的损伤和降低细胞聚集程度。大部分鳞翅目昆虫细胞在25～30℃之间生长最佳。培养基pH保持在6.2左右。多数昆虫细胞倍增时间为16-24 h。 血清的作用及其缺点 动物血清对细胞生长和促进细胞分裂有非常重要的作用。血清能够提供促进细胞生长、

无血清培养

无血清培养 无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。 无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分 1. 促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 2. 促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 3. 酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。 4. 结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 5. 微量元素：硒是最常见的。 使用方法 目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。 为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞： 1. 处于对数生长中期