氨基酸分析仪测定血清中犬尿氨酸和色氨酸的应用价值

生堡垒堕医堂塞壶垫！Ｑ生！旦筮！！鲞筮！翅ｇ！也』！生丛鲤：地些竖垫！璺：ｙ吐丝：！丛！

［９］ＹｕＹ，ＪｉＳ，ＣｈｅｎＹ，ｅＩａ１．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｓｔｒａｉｎｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇ

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１６Ｓ删Ａ

ｍｅｔｈｙｌａｓｅ—ｍｅｄｉａｔｅｄｌＩｉ小ｌｙａｍｉｋａｃｉｎ．ｒｅｓｉｓｔａｎｔｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ

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ａｎｄＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎａ／／ｉｎＫｏｒｅａ．Ｄｉｎｇｎ

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［１４］ＹｕＹｓ，ＺｈｏｕＨ，ＹａｎｇＱ，ｅｔａ１．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆ

ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｄｕｅｔｏＡｎｎＡｍｅｔｈｙｌａｓｅｉｎｉｍｉｐｅｎｅｍ．

ｒｅｓｉｓｔａｎｔＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎ／／ｉｓｏｌａｔｅｓｉｎＣｈｉＭ．ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ

Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００７，６０：４５４－４５５．

（收稿日期：２００９－０７－１２）

（本文编辑：武昱史红）

氨基酸分析仪测定血清中犬尿氨酸和色氨酸的应用价值

王永辉李培兵金宏邓柄楠李遵荣南文考

Ｔｒｐ是机体必需的氨基酸之一，Ｋｙｎ是唧最为重要的中间代谢产物之一。研究发现，Ｋｙｎ代谢异常与多种疾病，包括抑郁症、帕金森综合征等神经精神疾病、免疫失调、异常妊娠等的发生和发展密切相关¨…。血液和组织液中Ｔｒｐ和Ｋｙｎ的检测将为这些疾病诊断治疗、病情监测及发生机制研究提供有效的试验支持＂Ｊ。目前尚鲜见用氨基酸自动分析仪检测Ｋｙｎ的报道，这可能与氨基酸自动分析仪标准分析程尉４１不能将Ｋｙｎ和Ｔｒｐ分开有关。本研究通过改进日立Ｌ一８８００型氨基酸自动分析仪缓冲液洗脱程序，建立同时测定人血清中Ｋｙｎ和Ｔｒｐ的检测方法。

一、材料与方法

１．标本来源：从２００８年８月军事医学科学院附属医院体检人群中随机抽取男、女健康体检者各４６名，年龄２５—５０岁。

２．试剂与仪器：犬尿氨酸标准品（美国Ｓｉｇｎｍ公司），其余试剂均为色谱纯或优级纯，试验用水为超纯水。Ｌ－８８００型氨基酸自动分析仪，１９种氨基酸混合标准品和茚三酮（日本Ｈｉｔａｃｈｉ公司），ＡＥ２００型电子天平（瑞士Ｍｅｔｔｌｅｒ公司），５４１７Ｒ型低温高速离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司），ＷＨ－３旋涡混合器（上海沪西仪器厂）。

３．血清标本制备：抽取待检者静脉血２ＩＩｌｌ，置洁净采血管内，３０ｍｉｎ内以５００Ｘｇ离心１０ｍｉｎ，留取上层血清（若不能及时测定，需置一２０℃冰箱内保存）。

４．测定条件：Ｌ－８８００型全自动氨基酸分析仪采用标准色谱柱（规格：ＩＤ４．６ｌｌｌｌｎｘ６０ｒａｍ），日立专用离子交换树脂

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－９１５８．２０１０．０１．０１４

作者单位：０３００５０天津，军事医学科学院卫生环境医学研究所本文直接使用的缩略语：Ｔｒｐ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ），色氨酸；Ｋｙｎ（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ），犬尿氨酸；Ｃｒ（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）。肌酐；ＣＶ（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ）。变异系数２６２２型（３ｐ，ｍ磺酸型阳离子交换树脂），缓冲液洗脱程序（表１），分析时间３０ｒａｉｎ；缓冲液流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ，茚三酮流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎ；缓冲液泵压力６．９０～７．９０ｋＰａ，茚三酮泵压力ｏ．８９—１．００ｋＰａ；分析柱温度为５７℃，反应柱温度为１３４℃；氮气压力３５ｋＰａ；供试品和对照品溶液进样量均为２０斗ｌ。

表１血清标本上机分析加入不同ｐＨ值的改进后

缓冲液洗脱程序

７．０

注：柠檬酸钠缓冲液Ｂｌ一蚝的ｐＨ值分别为３．３、３．２、４．０．４．９、

５．血清标本上机前预处理（磺基水杨酸沉淀蛋白法）：取０．７５ｍｉ血清，加入０．７５ｍｌ２０％磺基水杨酸溶液，于旋涡混匀器上混匀，室温放置ｌＯ～１５ｍｉｎ，以充分沉淀血清中的蛋白质，然后以３０００Ｘｇ离心３０ｍｉｎ，上清液经０．４５岬滤膜过滤后，取２０斗ｌ上机，按表１中改进后的缓冲液洗脱程序进行分析。

６．标准曲线的绘制及检测限的确定：取１砷与Ｋｙｎ标准

万方数据

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品，用超纯水配制系列浓度的混合标准工作液（Ｋｙｎ和Ｔｒｐ

浓度为０．０１～１０００斗ｍｏＬ／Ｌ），用改进后的缓冲液洗脱程序

进行测定，每个标本进样３次，取其平均值用最：ｂ－－乘法进

行相关与回归分析。其中ｌ，为峰面积，ｘ为被分析物的进样浓度（ｐ．ｍｏｌ／Ｌ）。

７．精密度试验：分别对同一Ｋｙｎ和Ｔｒｐ标准品溶液和同一血清样品溶液日内连续测定２０次，求日内精密度；每天测定４次连续测定５ｄ，求日间精密度。

８．回收率试验：首先分别应用改进后的缓冲液洗脱程序测定血清中Ｋｙｎ和Ｔｒｐ的质量浓度，然后取线性范围内低、中、高３个浓度的标准溶液各５０斗ｌ，分别加入５０斗ｌ血清中混匀，测定加入标准后总的Ｋｙｎ、Ｔｒｐ的质量浓度，平行测定２０次，计算回收率。计算公式为：

回收率＝监碰蒜冀翳塾盟舢％

９．统计学分析：用ＳＰＳＳ１１．５软件进行统计分析。测定结果以面±ｓ表示，总体和不同性别健康成人中Ｋｙｎ与Ｔｒｐ水平比较，采用方差分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

二、结果

Ｉ．洗脱程序改进前后的色谱分离比较：１９种氨基酸标准混合工作液在用氨基酸分析仪标准缓冲液洗脱程序进行测定时，Ｋｙｎ和Ｔｒｐ的保留时间均为２４．８ｍｉｎ，二者不能有效分离（图Ｉ）。当采用改进后的缓冲液洗脱程序（表Ｉ）分析时，Ｋｙｎ和ＴＩｐ的保留时间分别为２４．８ｍｉｎ和２５．３ｍｉｎ。分离度≥１．５，Ｋｙｎ和Ｔｒｐ能有效分离，且与其他氨基酸，如苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸等１７种氨基酸也均能较好分离（图２）。而在此条件下显色剂茚三酮与ｃｒ、５一羟色胺和犬尿喹啉酸等不产生反应，说明这些内源性物质对Ｋｙｎ和Ｔｒｐ的分离检测均无干扰。

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图Ｉ标准缓冲液程序测定１９种氨基酸标准混合工作

液的色谱图

２．标准曲线和检测限：按照“标准曲线绘制及检测限确定”的方法进行试验，并做回归分析，得到Ｋｙｎ和１砷的线性范围分别为０．２４～５００ｐ．ｍｏｌ／Ｌ和０．４９—１０００ｐ．ｍｏｌ／Ｌ（Ｓ／Ｎ＝２），相关系数均为０．９９９９，最低检测限分别为０．０５ｐａｎｏｌ／Ｌ和０．１０ｐ，ｍｏｌ／Ｌ，说明该方法的线性关系良好，线性范围宽。灵敏度高。

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图２改进后的缓冲液洗脱程序测定１９种氨基酸标准混

合工作液色谱图

３．精密度试验：将质量浓度为５斗ｍｏｌ／１．的Ｋｙｎ标准品和１０ｐ．ｍｏＬ／Ｌ的Ｔｒｐ标准品分别用改进后的缓冲液洗脱程序，当天连续测定２０次，记录检出量，求得检出量的日内ＣＶ均在２．４０％以内，表明仪器的精密度良好。另取处理好的血清标本Ｉ份，每天测定４次，连续测定５ｄ，共测定２０次。记录检出量，求得Ｋｙ－和Ｔｒｐ检出量的日间ＣＶ均在２．１０％以内，表明该方法精密度良好（表２）。

４．回收率试验：经回收率试验，Ｋｙ－和唧的回收率分别在９５．８９％一１０３．２４％和９７．１５％～１０３．６２％之间；ＣＩ／分别在２．６５％和２．３５％以内。表明本方法测定血清中Ｋｙｎ和Ｔｒｐ质量浓度的准确度较高，可满足试验要求（表３）。

５．健康成人血清中Ｋｙｎ、Ｔｒｐ含量测定：从表４可见，用改进后的缓冲液洗脱程序测得健康成人总体、男性和女性血清中ＴＷ含量分别为（４７．２１－ｌ－５．３８）、（４９．１８士７．０３）、（４６．５５±６．２１）ｐ，ｍｏｌ／Ｌ，两两比较均差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。健康成人总体、男性和女性血清中Ｋｙｎ含量分另ｑ为（Ｉ．３５±０．４９）、（１．５４±０．３３）、（Ｉ．２１±０．３６）ｐ．ｍｏｌ／Ｌ，且男女之间的差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。提示男女血清Ｋｙｎ含量的差异可能与体内激素水平不同有关。

三、讨论

目前，国内外科研人员主要应用高效液相色谱法测定血中ＴＷ和Ｋｙｎ¨Ｊ，但其操作较复杂，标本需要量多，试剂消耗量大，实验室条件要求较高∞Ｊ。氨基酸自动分析仪可以克服高效液相检测中存在的以上问题，但应用氨基酸自动分析仪的标准缓冲液洗脱程序无法将Ｔｒｐ和Ｋｙｎ有效分开，本研究采用日立Ｌ－８８００型氨基酸自动分析仪，通过改进其标准缓冲液洗脱程序来对Ｋｙｎ和．Ｉｂ进行同时检测。结果表明，此方法能有效分离Ｋｙ－ｎ和Ｔｒｐ，且方法稳定，准确，灵敏，重复性好，线性范围宽，处理简单，检测时间较短，血清内源物质干扰小，完全能满足临床检测的要求。

哺乳动物体内Ｋｙｎ途径是Ｔｒｐ的主要代谢途径。吲哚胺２，３－双加氧酶是催化Ｔｒｐ沿Ｋｙｎ途径代谢的限速酶，唧在吲哚胺２，３－双加氧酶的作用下生成甲酰Ｋｙｎ，后者迅速在Ｋｙｎ甲酰胺酶的作用下生成Ｋｙｎ。正常情况下，吲哚胺２，３－

万方数据

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表２Ｋｙｎ和Ｔｒｐ的日内和日间测定的精密度分布

１３内精密度１３间精密度

标本类型检测指标份数检出量（删Ｌ，ｉ±５）ｃｙ（％）检出量（凹。ｌ／Ｌ，ｉ±ｓ）ｃ以％）

表４不同性别健康成人血清Ｋｙｎ和Ｔｒｐ含量

比较（仙ｍｏＬ／Ｌ，孟±５）

注：女性与男性相比，４Ｐ＜０．０５

双加氧酶呈低水平表达，而在炎症或感染、以及抑郁症等精神神经疾病过程中，其表达明显增加；检测血及组织液中Ｋｙｎ和Ｔｒｐ含量以及二者的比值可以反映吲哚胺２。３－双加氧酶的活性，从而成为相关复杂疾病诊断、治疗和病情监测的新的特异性手段。因此，建立正常人群血清Ｋｙｎ和Ｔｒｐ的正常值范围对疾病的诊断具有参考价值。我们运用此方法对９２名健康成人血清Ｋｙｎ和Ｔｒｐ进行了检测，血清Ｋｙｎ含量为（１．３５±０．４９）斗ｍｏｌ／Ｌ，Ｔｒｐ含量为（４７．２１±５．３８）ｐｍｏＶＬ，与国内外文献报道的正常值相符¨…，初步证明该测定方法可用于临床和科研工作快速检测血清中Ｋｙｎ和Ｔｒｐ的含量。

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（收稿１３期：２００９－０３－３０）

（本文编辑：李建陵）

万方数据

氨基酸分析仪测定血清中犬尿氨酸和色氨酸的应用价值

作者：王永辉， 李培兵， 金宏， 邓柄楠， 李遵荣， 南文考

作者单位：军事医学科学院卫生环境医学研究所,天津,030050

刊名：

中华检验医学杂志

英文刊名：CHINESE JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE

年，卷(期)：2010,33(1)

参考文献(8条)

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本文链接：https://www.wendangku.net/doc/cc11137419.html,/Periodical_zhyxjy201001014.aspx