GAD67-GFP基因敲入小鼠谷氨酸能、5-HT能及SP能终末与三叉神经中脑核神经元联系的形态学研究
类号分
级密
国际进类号十分（UDC ）
第四军医大学
学位论文
GAD67-GFP 基因敲入小鼠谷氨酸能、5-HT 能和SP 能 终末与三叉神经中脑核神经元联系的形态学研究
（题名和副题名）
郭 威
（作者姓名） 指导教师姓名徐礼鲜 教授（主任医师）
指导教师单位第四军医大学口腔医院麻醉科
申请学位级别硕士
专业名称麻醉学 论文提交日期2008.04 答辩日期2008.05 论文起止时间2007年 1月至2008年 3月
学位授予单位第四军医大学
独创性声明
秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。
申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。
论文作者签名： 日期：
保护知识产权声明
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论文作者签名： 导师签名： 日期：
GAD67-GFP基因敲入小鼠谷氨酸能、5-HT能和SP能终末与三叉神经中脑核神经元联系的形态学研究
研究生：郭 威
学科专业：麻醉学
所在单位：第四军医大学口腔医院麻醉科
第四军医大学人体解剖学教研室 导师：徐礼鲜 教授
李金莲 教授
资助基金项目：国家自然科学基金（Nos.30470907，30570980）
国家教育部创新团队计划（IRT0560）资助项目
关键词：囊泡膜谷氨酸转运体；5-羟色胺；P物质；三叉神经中脑核；
γ-氨基丁酸；GAD67-GFP基因敲入小鼠
中国人民解放军第四军医大学
2008年 05 月
目录
缩略语表 (1)
中文摘要 (3)
英文摘要 (6)
文献回顾 (10)
正文 (24)
第一部分：GAD67-GFP基因敲入小鼠囊泡膜谷氨酸转运体样阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系
1．前言................................................................................错误！未定义书签。2．材料和方法. (25)
3．结果 (27)
4．讨论 (29)
第二部分：GAD67-GFP基因敲入小鼠5-羟色胺样和P物质样阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系
1．前言 (31)
2．材料和方法 (32)
3．结果 (34)
4．讨论 (38)
小结 (41)
参考文献 (43)
个人简历和研究成果 (53)
致谢 (54)
缩略语表
缩略词英文全称中文全称
5-HT serotonin5-羟色胺
CNS central nervous system 中枢神经系统DA dopamine 多巴胺
DAB 3,3’-diaminobenzidine 二氨基联苯胺
ganglion 背根神经节
root
DRG dorsal
isothiocyanate 异硫氰酸荧光素FITC fluorescein
GABA γ-amino butyric acid γ-氨基丁酸GAD glutamate acid decarboxylase 谷氨酸脱羧酶GFP green fluorescent protein 绿色荧光蛋白Glu glutamate 谷氨酸
HRP horsersdish peroxidase 辣根过氧化物酶IgG immunoglobulin G 免疫球蛋白
NC neurocalcin 神经钙蛋白NGF nerve growth factor 神经生长因子NO nitrogen monoxidum 一氧化氮
NOS nitric oxide synthase 一氧化氮合酶
NPY neuropeptide Y 神经肽Y
NT-3 neurotrophin-3 神经营养物质-3 OPN osteopontin 骨桥蛋白
PAG phosphate activated glutaminase 磷酸激活的谷氨酰胺酶PB phosphate buffer 磷酸缓冲液
PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液
PEP19 peptide19 肽19
PV parvalbumin 小白蛋白
SP substance
P P物质
TG trigeminal ganglion 三叉神经节
TTX tetrodotoxin 河豚毒素
nucleus 三叉神经中脑核
trigeminal
Vme mesencephalic
Vmo motor trigeminal nucleus 三叉神经运动核
GAD67-GFP基因敲入小鼠谷氨酸能、5-HT能和SP能终末与三叉神经中脑核
神经元联系的形态学研究
硕士研究生：郭威
导师：徐礼鲜教授
李金莲教授
第四军医大学口腔医学院麻醉科，
第四军医大学人体解剖学教研室，西安 710032
中文摘要
临床上常出现的颞下颌关节紊乱、讷吃和吞咽困难等三叉神经领域的一些功能障碍性疾病都与三叉神经本体感觉信息的传递和调控密切相关。三叉神经中脑核（mesencephalic trigeminal nucleus，Vme）是传递口面部本体感觉信息的初级神经元所在地，同时也是对该信息进行调控的重要部位。三叉神经中脑核（Vme）是一个较特殊的神经核团，其神经元排列极不集中，呈“散兵线”式排列于上丘至蓝斑与臂旁核之间。Vme由大的假单极细胞和小的多极细胞组成，一般认为前者含有兴奋性神经递质，如谷氨酸（glutamate,Glu），后者则为含有抑制性神经递质，γ-氨基丁酸（GABA）的中间神经元。目前一般认为，Glu能的Vme神经元发挥传递口面部本体感觉信息的作用，而GABA能的Vme神经元则通过局部环路对本体觉信息的传递起抑制性的调控作用。GABA是中枢神经系统内的一种重要的抑制性神经
递质，它可与相应的GABA受体结合从而发挥抑制性调控作用。本课题组以往研究结果表明5-HT样、囊泡膜谷氨酸转运体（VGluTs）样和P物质（substance P，SP）样阳性终末与Glu能的Vme神经元胞体之间有密切接触。但这些研究由于无法有效地标记出Vme中GABA能的中间神经元，故有关5-HT样、VGluT1/VGluT2样和SP样阳性终末与Vme内的GABA能中间神经元胞体之间的关系如何，目前尚未见报道。
GAD67-GFP基因敲入小鼠是第四军医大学解剖教研室与日本京都大学医学部高级脑形态学研究室合作培育出的一种近年来被广泛用于实验的转基因动物，该小鼠可将脑内表达绿色荧光蛋白（GFP）的GABA能神经元准确地标记出来。GFP在内源性谷氨酸脱羧酶67（GAD67）基因启动子的控制下特异性的表达在GABA能神经元内，已有研究表明GFP阳性神经元几乎全为GABA能神经元，同时该小鼠Vme内的GABA能中间神经元都能得到较好的标记。
基于此，本研究利用该GAD67-GFP基因敲入小鼠，综合运用免疫荧光组织化学三重标记技术和免疫电镜双重标记技术，分别在激光共聚焦显微镜和电子显微镜下观察Vme内5-HT样、VGluT1/VGluT2样和SP样阳性终末分别与大的假单极神经元（Glu能）和小的多级神经元（GABA能）胞体之间的联系。
主要结果如下：
（1）Vme内有较多的PV样阳性神经元，这些神经元绝大多数为大、中型的假单极神经元，直径约为18～40 μm；也可观察到少量的GFP阳性神经元，多为小的多极神经元，直径约为8～15 μm。
（2）大量的VGluT1样和VGluT2样阳性终末广泛分布于Vme内，其中有部分终末分别聚集在PV样或GFP阳性的Vme神经元的胞体或树突周围。统计结果表明：在与Vme神经元相接触的VGluT1样阳性终末中，有71.8％的阳性终末与PV样阳性胞体相接触，28.2％的终末与GFP阳性胞体或树突
相接触；在与Vme神经元相接触的VGluT2样阳性终末中，与PV样阳性胞体相接触的阳性终末占74.5％，与GFP阳性胞体或树突相接触的阳性终末占25.5％。
（3）5-HT样和SP样阳性终末也分别与PV样和GFP阳性神经元的胞体形成密切接触，其中，分别有77.7％和78.2％的5-HT样和SP样阳性终末与大的PV样阳性胞体相接触，22.3％和21.8％的5-HT样和SP样阳性终末分别与小的GFP阳性胞体或树突相接触。
（4）在电镜下进一步观察到，5-HT样阳性终末与GFP阳性神经元的胞体或树突主要形成非对称性的轴-体或轴-树突触联系。
以上结果提示，在口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中，5-HT能、Glu能和SP能神经终末不仅对初级传入发挥直接的调控作用，还可能通过影响Vme内的小的GABA能神经元的活动，从而间接对该信息的传递发挥调控作用。
关键词：囊泡膜谷氨酸转运体；5-羟色胺；P物质；三叉神经中脑核；
γ-氨基丁酸；GAD67-GFP基因敲入小鼠
Morphological study of connections between glutamatergic, serotoninergic or substance Pergic axon terminals and cell bodies of the mesencephalic trigeminal nucleus neurons in
the GAD67-GFP knock-in mouse
Candidate for master: Guo Wei
Supervisor: Prof. Xu Lixian1
Prof. Li Jinlian2
1Department of Anesthesiology, Stomatological College;
2Department of Anatomy, Fourth Military Medical University,
Xi’an 710032
Abstract
Some clinical diseases which are functional disturbance in trigeminal nerve field such as disturbances syndrome of temporomandibular joint, anarthria literalis and acataposis have close relationship with the transmission and regulation of the trigeminal proprioceptive sensory signals. The mesencephalic trigeminal nucleus(Vme) are the collection of transferring the orofacial proprioceptive sensory signals, meanwhile the important place of regulating these signals. Vme is a special nuclei of neurons, the nervous cells spreading nonconcentrately from the superior colliculus to between locus ceruleus and the parabrachial nucleus. Vme composes of the large pseudounipolar neurons and the small multipolar neurons. It is now generally contained that the former have excitatory neurotransmitter like glutamate, the latter are the interneurons containing inhibitory neurotransmitter like GABA. As we know, glutamatergic
转基因小鼠的制备
转基因小鼠的制备 【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。 【实验原理】 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。 【实验步骤】 一、显微注射法 1.受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入 用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备 将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植 将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。 二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入
甘油法制作谷氨酸棒杆菌感受态
1，培养基 LBG培养基（g/l）：酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10，ph7.0，用于培养谷氨酸棒状 杆菌制备感受态的种子液。 EPO培养基（g/l）：酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10，甘氨酸30，Tween80 1。用 于谷氨酸棒状杆菌感受态的制备。 LBHIS培养基（g/l）：酵母膏2.5，蛋白胨5，氯化钠5，脑心浸液18.5，山梨醇91，用于谷氨酸棒状杆菌转化子的培养。 谷氨酸棒杆菌的培养条件：30℃，200rpm，需要卡那霉素时，加入的终浓度为 30ug/ml，相应的固体培养基中加入2%的琼脂粉。 2 ，谷氨酸棒状杆菌感受态的制备： （1）将一环谷氨酸棒状杆菌的种子接种于种子培养基中，200rpm，30℃过夜培养。 （2）以10%的比例转接于100ml培养基中，使初始细胞OD达到0.3，200rpm 30℃培养3-5h至OD达到0.6-0.9。 （3）将所有菌液放入50ml离心管中冰浴15min，4000rpm，4℃离心10min。（4）取预冷的10%甘油约30ml，充分悬浮菌体，4000rpm，4℃离心10min。（5）再次取预冷的10%甘油重复洗涤两次。 （6）用400ul预冷的10%甘油重悬细胞，1.5ml离心管分装，每管80ul，-70℃保存或者点击转化。 3 谷氨酸棒状杆菌的电转化法： （1）将新鲜制备(或者冰箱取出)感受态细胞和连接产物置于冰上，轻弹管壁使其混匀。 （2）吸取5ul冰上预冷的质粒加入感受态细胞中，轻弹管壁使其混匀，然后冰浴5-10min。 （3）加入预冷的0.1cm电击杯中，1.8kv，5ms电击。加入恢复用培养基LBHISml，混匀46℃水浴6min。 （4）30℃，100rpm培养1h。 （5）涂布含有抗生素的平板，30℃过夜培养观察。
谷氨酸棒杆菌发酵工艺控制
种子培养基：每升含葡萄糖60g，KH2PO4 2.5g , MgSO4.7H2O 0.5g (NH4)2SO4 5g ,玉米浆30g ,pH 7.2 115℃ 20min 发酵培养基：每升含葡萄糖70g，KH2PO4 2.5g, K2HPO4 2.5g, MgSO4.7H2O 0.5g, (NH4)2SO4 25g ,玉米浆45g ,pH7.0 （四）罐上的工艺控制 1）预热：打开夹套蒸汽进汽阀，微开排污阀，将罐温加热至100℃2）灭菌：关闭夹套蒸汽进汽阀，开启蒸汽进罐阀，使罐温升至121℃；打开空气管路蒸汽阀门对空气过滤器进行灭菌；调整蒸汽进罐阀、排气阀的开度使罐压保持在0.12MPa左右（如此时温度与121℃相差较大，则可用121℃重新标定罐内温度）；保持30min；关闭所有蒸汽阀门，让罐压下降至0.01MPa，打开空气进气阀，引无菌空气保压（0.03~0.05MPa），确保罐压小于过滤器空气压。 3）发酵准备阶段：开启冷却模式，开启进水阀，快速降温至28℃；退出冷却模式，开启发酵模式，保温运作；开启搅拌器（100rpm），如果排气阀没有过度的逃液，则可加大搅拌速率，或加大空气进气量。4）发酵：采用火焰法接种，调节排气阀、进气阀开度，还有搅拌器速率，在不过分逃液的前提下，保持较高的DO值；发酵过程中微开取样管路（蒸汽进罐阀紧闭）保持较小的蒸汽排出（时刻保持取样管路无菌）。 5）取样：关闭蒸汽排出阀，关闭蒸汽进汽阀，开启蒸汽排出阀，开启蒸汽进罐阀，并调节该两阀门的开度使发酵液以适宜的流量流出，用三角瓶接约20mL；关闭蒸汽进罐阀门，开启蒸汽进汽阀。
6）放罐：关闭空气进气管路，开启夹套加热管路，关闭冷凝水管路，关闭蒸汽排出阀，引蒸汽进罐，待罐温升至100℃后，计时3min；关闭蒸汽进罐阀，关闭蒸汽进汽阀；开启空气进气管路，开启蒸汽进罐阀，利用压强将液体放出；放完后，关闭空气进气管路；通自来水按以上步骤洗罐3次；通入自来水，待下次发酵开始。
基因敲除小鼠的制作方法
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
最新基因操作原理
基因操作原理
《基因操作原理》课程教学大纲 课程编码：13019课程名称：基因操作原理 课程英文名 称： Princeples of Gene Manipulation 先修课程：生物化学、遗传 学、分子生物学 等 适用专业：生物技术生物科学 总学时：56 讲课学时 56 实验学时 0 实习学时 0 总学分：3.5 一、课程性质、地位和任务 “基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、λ噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术； PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术； DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。”分子克隆技术”是与本课程配套的实验课程。 二、课程基本要求 能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线，要求学生随着科学研究和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。 本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。如果能做到理论与实验并至，将能巩固所学知识。重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。 三、教学内容及安排 绪论：基因操作的理论基础（2学时） 本章重点与难点: 掌握与基因操作有关的基本概念 0.1基因的概念 0.1.1 什么是基因 0.1.2基因与其产物的共线性及非共线性 0.1.3 基因的重叠与可变性
谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的调节控制
谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的调节控制 1 菌种的选育 目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，以提高细胞膜对谷氨酸的通透性，如生物素缺陷型菌种的选育。 发酵中原料要消耗在如下三个方面:第一、供菌体增殖，生成足够量的菌体，使其干重占到发酵液的1.0%1.5%，这是产酸前提与基础。第二、生成谷氨酸。第三、由于菌体代谢多支路及发酵条件控制不当而产生的一些其他副产物如乳酸、酮酸、其他氨基酸等等及一些原料被分解而随空气逸出。【1】 2 糖液质量是发酵的基础 糖液质量是发酵成功的基础" 这是氨基酸发酵业界同仁的共识。氨基酸发酵所需的糖液不同 于麦芽糖、结晶糖。有它自身特点，其糖液DX、DE、透光率高而且经糖谱分析，糖（及以上的)值要低，防止发生复合反应。为达到上述要求，作出符合发酵所需要的优质糖液，可按以下条件实施生产调控： 2.1一次喷射双酶法% 2.2选用高效优质酶和喷射器-水热器); 2.3 液化:调浆ph5.8～6.0 液化维持温度100～95％;液化维持时间100～120min 2.4糖化:ph4.1～4.3 糖化温度60% 糖化时间32～36h 2.5过滤:高液位压差法 3 接种量和种子培养扩大级数 为提高发酵罐中菌的增殖速度，菌体数尽快达到高峰，使产物的合成时间提前，力争采用较大种量。
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与
转基因小鼠的方法概述
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与谷氨酸合成
21卷2期2005年3月 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal o f Biotechnology V ol.21 N o.2 March 2005 Received :August 11,2004;Accepted :October 27,2004. 3C orresponding author.T el :86251025874341;E 2mail :jianzhuge @https://www.wendangku.net/doc/c311780237.html, 谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与谷氨酸合成 G lyoxylate Cycle is R equired for the Overproduction of G lutamate but is not Essential for Corynebacterium glutamicum G row th on G lucose 余秉琦,沈 微,王正祥,诸葛健 3 Y U Bing 2Qi ,SHE N Wei ,W ANG Zheng 2X iang and ZH UGE Jian 3 江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214036 K ey Laboratory o f Industrial Biotechnology o f Ministry o f Education ,Southern Yangtze Univer sity ,Wuxi 214036,China 摘 要 为阐明谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与菌体的生长以及谷氨酸合成之间的关系,以谷氨酸棒杆菌基因组测序用典型菌株Corynebacterium glutamicum AT CC 13032为出发菌株,构建了乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株Corynebacterium glutamicum WT ΔA 。该菌株没有异柠檬酸裂解酶活性,不能在以乙酸盐为唯一碳源的基本培养基上生长。与出发菌株AT CC 13032相比,WT ΔA 在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长时不受影响,说明谷氨酸棒杆菌并不需要乙醛酸循环途径提供菌体生长所需的能量和生物合成反应所需的中间产物。但是,与出发菌株AT CC 13032相比,WT ΔA 的谷氨酸合成能力大幅下降。关键词 谷氨酸棒杆菌,乙醛酸循环,异柠檬酸裂解酶,谷氨酸 中图分类号 Q591 文献标识码 A 文章编号100023061(2005)022******* Abstract The gly oxylate cycle was hypothesed to be indispensable for glutamate overproduction in coryneform bacteria ,for it was thought to fulfill anaplerotic functions and to supply energy during the growth phase.During glutamate overproduction phase ,however ,it has been noted that the high level of the cycle is detrimental to the glutamate production.In order to clarify the rela 2tionship between the glutamate production and the gly oxylate cycle ,a chrom osomal aceA 2disrupted mutant of wild 2type C .glu 2 tamicum ATCC 13032was constructed.The isocitrate lyase (IC L )activity of the parental strain was 01011u Πmg of protein and reached 11980u Πmg of protein after acetate induction ;the mutant strain WT ΔA ,however ,had no detectable IC L activity and was no longer able to grow on m inimal medium with acetate as the sole carbon source.C om pared with the wild 2type C .glutamicum WT ,the mutant strain WT ΔA ,exhibited the same growth rate with glucose as the sole carbon source ,indicating gly oxylate cycle is not required for its growth on glucose.On the contrary ,the glutamate production in WT ΔA was severely im paired and m ore re 2 sidual glucose was found in the fermentation broth at the end of fermentation with the mutant strain than with the wild 2type strain.Further investigations into the relationship between the glutamate production and the gly oxylate cycle are under the way ,which may help to elucidate the mechanism of glutamate overproduction. K ey w ords Corynebacterium glutamicum ,gly oxylate cycle ,isocitrate lyase ,glutamate 谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum 是40多年来世界氨基酸生产的主要菌株。最近Coryne 2 bacterium glutamicum ATCC 13032的基因组测序工作 已经完成 [1] 。该项工作的完成促进和方便了国内外
第一章 基因操作原理的理论基础.
第一节基因操作原理 基因操作（Gene Manipulation）的核心部分为分子克隆（molecular cloning）。由于政府对基因操作有一定的法律约束，大多数国家对此都有一个精确的法律定义。比如在英国将基因操作定义为将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒、质粒或其它载体系统中，再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。（引自Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW. OLD & SB Primrose , 1985）。强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的重要特征。另一个特征是繁殖。 这里所说的基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达、调控、检测和改造等与基因研究相关的内容。 本课程就是为了讲述在核酸水平上对基因进行研究所涉及的方法、技术和策略的原理，主要是基本的、通用的原理，对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内。 基因操作原理在生物学科发展中具有重要地位。这门课以前叫“分子克隆Ⅰ”，“分子克隆Ⅱ”为实验课。但无论叫什么，本门课程到底要讲些什么，它的地位如何？ 20 世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953年由于认识了DNA 的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学研究的热潮。在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平，同时由于遗传学的兴起与发展，DNA 作为生命遗传信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学的诞生。 分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行研究的生物学，研究生物的生物学现象和本质，如DNA的结构、复制、表达、调控、遗传、变异等。由于分子生物学的进一步发展，生物学的各个分枝学科都延伸到了分子水平，在这种情况下，传统分子生物学就是一个包罗万象的学科，大的可以说动、植、微生物的分子生物学，小的可以说某些物种的分子生物学，如水稻的分子生物学、链霉菌的分子生物学、芽胞杆菌的分子生物学。 在这种情况下，传统的分子生物学就好象是高级生物化学，阐述基因或者说 DNA（核酸）的静态和动态化学本质。目前的分子生物学，朝着发育、结构和遗传生物学的方向发展。如果说传统的分子生物学是静态分子生物学的话，那么这些学科可以说是动态分子生物学，即在分子水平（核酸）上，研究生物的生长、分化、死亡以及遗传和变异的内在规律。 在以上这些研究中，均涉及在DNA 水平的操作，本门课程就是要讲述这相关的原理，为分子生物学的研究服务。通过分子生物学内在的原理，如 DNA 结构、复制、转录、表达、调控等，讲述研究方法和技术的设计原理。
基因敲除小鼠技术共9页word资料
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建
基因操作原理
（这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考） 第一章 编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。Include: 1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame) 2.保证转录所必须的调控序列(S-D) 3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer) 4.内含子(intron) Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。 两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。 Development of gene engineering： 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程 第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程 第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程 第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程 第二章 目的基因的获得（DNA的准备） 1.从基因组直接获得 2.RT-PCR 方法获得 3.人工合成法 DNA抽提的基本原理 ?1 获得细胞，裂解细胞 三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。 2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离） 3 纯化（去除RNA） ?RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。 3 纯化（去除蛋白） ?常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。 PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制 PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右
转基因小鼠的方法概述
转基因小鼠的应用及其制 备方法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。
转基因小鼠的应用及其制备方法 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications ofTransgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@https://www.wendangku.net/doc/c311780237.html,；Tel： *通讯作者：E-mail： 兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医
1, 5-戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建
1, 5-戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建 材化081 燕飞龙 081097 摘要1, 5-戊二胺是一种重要的化工原料, 发酵法生产1, 5-戊二胺是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。以蜂房哈夫尼菌AS1. 1009基因组为模板, 通过PCR 扩增, 得到大小约为22 kb的赖氨酸脱羧酶基因ldc。以大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXM Jl9为载体, 将扩增得到的目的基因片段克隆至谷氨酸棒杆菌C. glu tam icum TK260512, 获得重组菌株C. glutam icum TK260512 /pXMJl9-ldc. 在摇瓶发酵水平上, 通过IPTG 诱导ldc基因的表达, 并采用反相高效液相色谱方法测定了发酵液中1, 5-戊二胺的含量, 结果显示, 经36h发酵, 工程菌C. g lu tam icum TK260512 /pXMJ19-ldc的1, 5-戊二胺产量为0.96 g/L。 关键词赖氨酸脱羧酶谷氨酸棒杆菌1, 5-戊二胺 正文1, 5-戊二胺, 即尸胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱, 为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成。在农业上, 产物1, 5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育, 改善植物果实发育, 提高果实产量[ 1, 2] ; 在医学上, 它也可作为一种有效治疗痢疾的药物[3]; 在工业上, 将1, 5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料——新型尼龙[4]。此外, 1, 5-戊二胺是微生物细胞内调节铁离子浓度的“铁亲和系统”的主要组成成分[5]; 1, 5-戊二胺在关闭孔蛋白通道方面也起着重要的作用[6]; 而且它还是反刍兽新月单胞菌(Selenom onasrum inantium )、嗜碱性韦荣球菌( Veillonella alcalescens),小韦荣球菌( V. parvula), 和解脂厌氧弧菌(A naerov ibriolipolytica)等一些严格厌氧的格兰氏阴性菌的肽聚糖的组成成分[ 7-9]。 自20世纪30年代, 杜邦公司发明出尼龙以来, 尼龙就以其优异的力学性能, 良好的耐磨性和自润滑性,较好的耐腐蚀性等优点被广泛应用于航空航天, 汽车部件、机械零部件、电子电器、包装材料、胶粘剂及化妆品等领域。每年全世界大约生产1 200000吨尼龙, 其中尼龙-6和尼龙-66约占90%。尼龙66是由己二胺和己二酸1：1聚合生成。1, 5-戊二胺是赖氨酸脱羧的产物, 与己二胺互为同系物, 在结构上与己二胺非常相似, 可以替代由石油制备的己二胺, 已有技术可以将尸胺精炼后和己二酸共聚合成具有实用性的尼龙-56, 尼龙-56是一种耐高温的新型塑料[4]。 1, 5-戊二胺化学合成法采用以不可再生的战略石油作为原料, 环境污染严重, 无法实现可持续发展。利用生物法转化可再生资源来生产1, 5-戊二胺, 具有污染小, 环境友好, 可持续发展等优点, 如果我们能成功开发出利用微生物转化可再生资源来生产1, 5-戊二胺的方法, 这无疑会在缓解能源危机和遏制全球气候变暖等方面做出重要贡献。生物法制备1, 5-戊二胺在国外也正处于起步阶段[10-11]。国内只有蒋丽丽等[ 12]利用固定化能产赖氨酸脱羧酶的蜂房哈夫尼菌细胞来制备1, 5-戊二胺的报道。然而蜂房哈夫尼菌不能积累赖氨酸, 需要外加赖氨酸作为酶的反应底物, 故仍无法解决原料成本过高的问题。因此构建以廉价的葡萄糖为底物直接生产1, 5-戊二胺的基因工程菌成为研究的热点。本课题将克隆得到的蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶基因连入表达载体pXM J19得到重组质粒pXM J19-ldc。用电转化方法将重组质粒pXM J19-ldc 转入一能产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌体内, 使赖氨酸直接在体内脱羧生成1, 5-戊二胺。此课题在实验室水平上初步探讨了用转基因工程菌生产1, 5-戊二胺的方法, 为今后我国拥有自主
基因操作原理名词解释
第一章 1. Gene manipulation 基因操作。将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。 2. Interrupted genes 间断基因。序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。 3 .Promotor 启动子。DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。4. Subcloning 亚克隆。当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。 第二章 1.Restriction and modification 限制和修饰。宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。 2. Matched ends 匹配末端。识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。 3. Blunt ends 平末端。在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。 4. Isoschizomer ：同裂酶。识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。 5. Isocaudiners ：同尾酶。来源不同、识别序列不同，?但产生相同粘性末端的酶。 6.Site preferences ：位点偏爱。某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。 7.Star activity 星星活性。在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 8. Nicking enzyme 切口酶。有些限制酶只切割双链DNA 中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。 9. Klenow fragment Klenow 片段。Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。 10 .Sequenase 测序酶。是改造的T7 噬菌体DNA 聚合酶，切除了99% 以上的3'--5' 外切活性。Sequenase Version2 切除了所有的3'--5' 外切活性，用于双脱氧链终止法对长片段进行测序。 11.Reverse transcriptase 反转录酶。即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。它来自AMV （禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV （Moloney 鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。 12. Terminal transferase 末端转移酶。来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA 聚合酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP 加于DNA 分子的3' 羟基端。若dNTP 为T 或C ，此二价阳离子首选钴离子；若dNTP 为A 或G，此二价阳离子首选镁离子。 13. Ligase 连接酶。催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。 14. T4 polynucleotide kinase T4 多核苷酸激酶。催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。 15. Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶。主要来源于牛小肠（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称CIP 或CIAP，也有来自细菌（BAP）。催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸。 16. S1 nuclease Sl 核酸酶。来源于米曲霉（Aspergillus oryzae），可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。