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Pyrosequencing检测CYP2C9_3基因多态性方法的建立及其可靠性研

◇临床药理学◇

中国临床药理学与治疗学

中国药理学会主办

C N 3421206ΠR ,ISS N 100922501

E 2mail :ccpt96@https://www.wendangku.net/doc/cb12143835.html, 2009Jul ;14(7):799-803

2009203223收稿　2009207226修回

赵钢涛,女,硕士,主管药师,主要从事药物基因组学相关研究。

T el :010*********　E 2mail :xiaotiaohan @https://www.wendangku.net/doc/cb12143835.html,

Pyrosequencing 检测CYP2C93

基因多态性方法的建立及其可靠性研究

赵钢涛1,丁媛媛1,杨凡1,刘惠军2,姜楠1,许景峰

北京军区总医院药理科,北京100700;

黑龙江佳木斯市中心医院,佳木斯154002,黑龙江

摘要　目的:建立基于焦磷酸测序技术(Pyrose 2

quencing )的高通量的CY P2C93

3突变检测方法。方法:应用带有生物素标记的扩增引物,经PCR 扩增及Beads 分离,制备该突变位点焦磷酸测序单链模板,并在PyroMark I D 焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序,以经典ABI 测序法测序结果作为标准对照,观察批量分析的可靠性并批量检测220例人DNA 标本。结果:建立了基于焦磷酸测序技

术的CY P2C93

3突变位点检测平台,实现了DNA 标本的高通量检测。能一次获得96份DNA 的CY P2C93

3突变位点检测结果。经重复性检测和

标准的ABI 测序可靠性检测,CY P2C93

3突变位

点的突变检出率及重复率均达100%。结论:本

方法可准确、高通量、快速检测CY P2C93

3突变,特别适宜该S NP 位点批量检测需要。

关键词　焦磷酸测序;多态性;序列分析;CY P2C9中图分类号:R969文献标识码:A

文章编号:100922501(2009)0720799205

主要由CY P2C9代谢的药物很多,主要有:甲

苯磺丁脲、苯妥英、华法林、氟西汀、洛沙坦等[1]

。其中很多药物(特别是苯妥英、S 2华法令和甲苯磺丁脲)具有很窄的治疗指数,所以酶活性成为了确

定上述药物个体化差异的重要决定因素

[2]

。而中

国人CY P2C9的主要突变形式为CY P2C93

3,突变率为3%左右。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing )是一种短片段DNA 的序列分析技术,基于该技术的分析系统结合相应软件和试剂可以应用于S NP 基因分型。只需采用PCR 的方法扩增出包含有S NP 的DNA 片段,通过Pyrosequencing 的系统平台

制备单链的DNA 模板,然后由系统自动完成对S NP 基因型的分析。该方法不仅自动化程度高,

而且速度快、通量高。更为重要的是它可以直接读出S NP 的序列信息

[3-4]

。虽然DNA 的分析方

法有很多,如定量PCR 、核酸杂交等,但是只有DNA 序列测定和分析才是黄金标准。因此,通过Pyrosequencing 进行S NP 的基因型分析准确性极

高,几近100%。本研究以检测CY P2C93

3突变为目的,建立基于焦磷酸测序技术进行CY P2C93

3突变的高通量检测方法并验证其可行性和准确性。

1　资料与方法

1.1　标本来源　220例标本血样均来自于本院

高血压门诊及住院患者。血样采集后在4℃冰箱保存,在2h 内完成DNA 样本的提取。

1.2　仪器设备　聚合酶链式反应(PCR )仪(T per 2s onal 248,美国Biometra 公司);高速离心机(Mikro 120,德国Hettich 公司);水平电泳仪(DYY 26C ,北

京六一实验仪器厂);凝胶成像仪(GE NOSE NS 1500,上海C LI NX 公司);焦磷酸测序仪(Pyrose 2quencingT M PyroMark I D 系统,瑞典Biotage 公司);

997?

实验过程中用到的耗材均经高压湿热灭菌处理。

1.3　试剂　DNA标本提取采用全血基因组DNA 提取试剂盒(美国Promega公司);焦磷酸测序采用S NP通用试剂盒(瑞典Biotage公司);PCR反应体系试剂,包括PCR Bu ffer、MgCl

2、dNTP、T aq DNA P olymerase(购自上海生工生物工程技术服务有限公司,产自加拿大Bio Basic公司);琼脂糖(MD Bio Inc.);Streptavidin Sepharose beads抗生物素蛋白链菌素葡聚糖珠(瑞典GE healthcare Bio2Science AB 公司)。

1.4　人血标本DNA提取　E DT A22Na抗凝管采血,吸取全血300μL,置于1.5m L EP管中,采用美国Promega公司生产的全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA,提取结束后加入TE液50μL溶解DNA,放置过夜,待用。

1.5　引物设计和合成　用Assay Design S oftware: Version1.0.6软件设计用于CY P2C933焦磷酸测序的引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。具体引物如下:扩增上游引物:5’2 CCTG C ATG C AAG AC AGG A23’,下游引物:5’2 G AATTTGGGG ACTT CG AAAA23’,测序引物:PSeq: 5’2TGGGG AG AAGG T C AA23’,并按如下条件进行PCR扩增:反应体系50μL,包括10хPCR Bu ffer 5μL、25mm olΠL MgCl23μL、10mm olΠL dNTP 0.5μL、5UΠμL T aq DNA P olymerase0.2μL,加超纯水39.3μL至50μL体系。PCR扩增条件如下: 95℃变性3min,然后45个循环(95℃30s, 57℃30s,72℃15s),再经72℃延伸3min,最后在4℃保存。

1.6　PCR产物检查　2%琼脂糖制胶,将扩增产物3μL和上样缓冲液1μL混匀,加样,水平电泳槽电泳。具体条件为:电压80V,40min。电泳结束后,将胶片浸于E B溶液中15min,取出后在凝胶成像仪上观察电泳结果。

1.7　PCR产物的焦磷酸测序

1.7.1　测序引物退火缓冲液(SP B)的配制　将100μm olΠL测序引物母液3μL加入997μL An2 nealing Buffer(AB)中,得到0.3μm olΠL SP B。板上每个孔中加入SP B45μL。

1.7.2　配置单链DNA分离液　3μL Beads+ 42μL Binding Bu ffer配置成45μL单链DNA分离液。1.7.3　PCR产物固定　每个PCR样本加45μL 单链DNA分离液,在常温下混合震荡5min,使得Beads与生物素充分结合。

1.7.4　单链DNA模板的制备　在Vacuum Prep W orkstation中,四个样品板依次加入180m L高纯水(1)、70%乙醇(2)、Denaturation Buffer(3)和120m L Washing Bu ffer(4)。打开真空泵,将Vacu2 um Prep tool在高纯水(1)中清洗30s,然后移到PCR板中,抓取Beads,依次在2、3、4中清洗5s、5s、5～10s。

1.7.5　引物杂交　将Vacuum Prep tool放入含有测序引物的板中,摇动,释放Beads,在80℃杂交2min,然后冷却至室温。

1.7.6　测序　利用瑞典Biotage公司生产的Pyro2 Mark I D测序仪和S NP通用试剂盒,按仪器和试剂盒说明书进行PCR产物S NP的焦磷酸测序[5]。1.7.7　突变类型分析　根据检测序列的碱基序列判断突变类型:野生型(CY P2C931Π31)1075位点为AΠA;突变杂合子(CY P2C931Π33)1075位点为AΠC;突变纯合子(CY P2C933Π33)1075位点为CΠC。

1.8　重复性实验　取96例DNA样本,在1周时间内,重复3次实验。观察CY P2C933突变检出率和重复性。

2　结果

2.1　焦磷酸测序片段的扩增　取扩增产物和上样缓冲液混合液4μL,在2%琼脂糖电泳,可获得清晰的扩增产物,大小为193bp(图1)

。

图1　扩增片段电泳图

2.2　CYP2C933突变位点的检测　分离纯化后的单链扩增产物,经过PyroMark I D系统测序,所得焦磷酸测序结果信噪比极高,能清晰显示出所

?Chin J Clin Pharmacol Ther2009Jul;14(7)

检测片段的DNA 序列,按照基因片段的序列,可以迅速识别突变类型。与经ABI 标准测序的结果

作比较,结果完全一致(图2)

。

图2　野生型、突变杂合子、突变纯合子图例

2.3　批量CYP2C93

3突变检测的可靠性分析　

为了验正本试验方法的可靠性,我们选用了96例DNA 标本,进行批量化检测时的重复性实验,以

观察批量检测CY P2C93

3的可靠性。结果显示:

在288次的重复实验中,突变检出率和重复性均为100%(288Π288)。另外将220例DNA 样本扩增

108?中国临床药理学与治疗学2009Jul ;14(7)

产物进行经典ABI测序,结果显示:与Pyrose2 quencing测序结果完全一致(表1)。

表1　焦磷酸测序与ABI测序结果比较(n=220)测序方法野生型突变杂合子突变纯合子

焦磷酸测序196231

ABI测序196231

3　讨论

CY P450酶是主要的药物代谢酶,其中CY P2C9在人肝脏微粒体中含量丰富,约占总CY P 蛋白量的20%。CY P2C933(1075A>C,I359L)是中国人的主要突变形式,导致酶活性下降,研究其个体差异有利于临床个体化用药的开展[6-7]。Pyrosequencing工作原理是基于酶的级联反应,通过光信号的有无判断碱基是否掺入,根据光信号的强弱判断碱基掺入的数量[8-10]。主要用于S NP 分型、微生物鉴定分型、耐药性分析、甲基化分析、插入Π缺失,点突变等各种突变形式的检测。与常见的Sanger法测序不同,该方法不需要跑平板胶或毛细管电泳,不需要任何DNA片段的荧光标记及荧光激发和检测装置。更具有常规化学测序所不具备的内设标准控制,检测信号的信噪比高,因此,具有更高的准确性[11-12]。同时具有快速、简便、高通量和自动化操作等特点,其中,Pyrose2 quencing测序法96个样本DNA单链模板的制备只需15min,而经典的ABI测序法,96个样本的制备需要至少3h。Pyrosequencing测序法每次能够检测96个样本,ABI测序法只能检测14个样本。而且Pyrosequencing测序法96个样本基因型的判读只需10min,ABI测序法大约需要24h。另外Pyrosequencing测序法检测成本较低,更易于科研和临床推广。将Pyrosequencing测序法用于已知基因片段各种基因改变的临床批量检测,有利于快速准确地为患者提供个体化用药的指导方案。然而,由于该技术发明较晚,故急需建立基于焦磷酸测序技术平台的基因检测方法。

本研究建立了CY P2C933突变位点的Pyrose2 quencing检测方法,能够快速准确地检测患者的基因突变情况,为提供合理化的个体用药方案奠定基础。其对220例临床高血压患者的CY P2C93 3突变位点进行检测,准确率100%。具有可靠性高、重复性好的特点。是一种高可靠性,可重复性好,自动化程度高的检测方法。

参考文献

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?Chin J Clin Pharmacol Ther2009Jul;14(7)

Development of pyrosequencing method for the simultaneous and rapid

detection of CYP 2C 93

3gene polymorphism and its reliability study

ZHAO G ang 2tao 1,DI NG Y uan 2yuan 1,Y ANG Fan 1,LI U Hui 2jun 2,J I ANG Nan 1,X U Jing 2feng

Dept.o f Pharmacology ,G eneral Hospital o f Beijing Military Command ,Beijing 100700,China ;2

The Central

Hospital o f Jiamusi ,Jiamusi 154002,Heilongjiang ,China

ABSTRACT AIM :T o establish a pyrosequencing 2based method for simultaneous and rapid detection of

CY P2C93

3gene polym orphism.METH ODS :With the results of standard ABI sequencing as a standard control ,we observed and analyzed the reliability of the pyrosequencing method which inv olves the establish 2ment of biotin 2labeled primers ,am plification of PCR ,separation of Beads ,preparation of pyrosequencing sin 2gle 2stranded tem plate of mutational sites and sequenc 2ing of PyroMark I D in pyrosequencing apparatus by de 2tected 220cases of human DNA sam ples.RESU LTS :We achieved the simultaneous and rapid detection plat 2

form of CY P2C93

3mutation of DNA sam ples based on Pyrosequencing technology ,which can detect DNA

sam ples with high 2flux manner.The test results of the

CY P2C93

3mutation of 96DNA sam ples can be ob 2tained each time with this detection platform.C om 2pared with the standard ABI sequencing ,the mutation

detection rate and the repetition rate of CY P2C93

3mutation are 100%in this method.CONC L USION :Pyrosequencing method is a accurate ,high 2throughput ,

rapid method for the CY P2C93

3mutation detection ,especially suitable for the bulk detection of this muta 2tion.

KE Y WOR DS pyrosequencing ;polym orphism ;se 2quence analysis ;CY P2C9

本文编辑:余文涛　陈艾东

《中华全科医学》杂志2010年征稿征订启事

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