亲和-超滤载体对His标记重组AxCeSD吸附特性的研究

亲和-超滤载体对His标记重组AxCeSD吸附特性

的研究

刘光毅，刘光，陈萍，李琳，胡松青

（华南理工大学轻工与食品学院，华南理工大学淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心，广东省天然产物绿

色加工与产品安全重点实验室，广东广州 510640）

摘要：采用金属螯合亲和层析技术纯化了N-末端组氨酸(His)标记的重组蛋白AxCeSD。以2000 ku的水溶性葡聚糖DextranT2000为基质，亚氨基二乙酸(IDA)作为螯合剂，Cu2+做亲和配基制备了能特异性吸附重组蛋白His标记的水溶性葡聚糖亲和-超滤载体，并探讨了pH、离子浓度、吸附时间以及温度等因素对水溶性葡聚糖亲和-超滤载体吸附重组蛋白AxCeSD的影响。结果表明，在一定范围内，随着pH和温度的升高亲和-超滤载体对AxCeSD吸附量增加，而随着离子浓度的增加其对AxCeSD吸附量减少；亲和-超滤载体对AxCeSD的吸附在30 min内能够达到平衡。应用Langmuir方程拟合了等温条件下亲和-超滤载体对AxCeSD的吸附曲线，得到最大理论吸附量为125.15 mg/g，解离常数为3.259×10-6 mol/L，说明亲和-超滤载体对His标记的重组AxCeSD的吸附为以螯合作用为主的特异性吸附。

关键词：亲和-超滤载体；葡聚糖；重组蛋白AxCeSD

文章篇号：1673-9078(2015)5-65-70 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.5.011 Adsorption Characteristics of Affinity-ultrafiltration Escort to His-tagged

Recombinant AxCeSD

LIU Guang-yi, LIU Guang, CHEN Ping, LI Lin, HU Song-qing

(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology; Starch And Vegetable Protein Processing Engineering Research Center of The Ministry of Education of South China University of Technology, Guangdong Key Laboratories on Green Natural Products Processing and Product Safety, Guangzhou 510640, China) Abstract: N-terminal histidine (His)6-tagged recombinant protein AxCeSD was purified by affinity chromatography. The affinity- ultrafiltration escort, Cu2+-IDA-Dextran T2000 specifically able to adsorb the His-tag of recombinant protein, was synthesized using water-soluble Dextran T2000 as the matrix (molecular weight 2000 ku), iminodiacetic acid as the chelating agent, and Cu2+ as the affinity ligand. The effects of pH, ionic strength, adsorption time, and reaction temperature on the adsorption characteristics of the escort with N-terminal His-tagged recombinant AxCeSD were investigated. The results showed that the adsorption capacity of the affinity-ultrafiltration escort for AxCeSD increased with the increases in pH and temperature within a certain range, but decreased as the ionic strength increased. Moreover, the adsorption equilibrium could be achieved within 30 min. The isotherm adsorption curve was fitted to the Langmuir model. The maximum adsorption yield was 125.15 mg/g and the dissociation constant was 3.259×10-6mol/L, indicating that the specific adsorption of the affinity-ultrafiltration escort to recombinant AxCeSD was mainly from chelation.

Key words: affinity-ultrafiltration escort; dextran; recombinant protein AxCeSD

亲和-膜过滤技术是亲和载体与目标蛋白的特异收稿日期：2014-07-24

基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（博导类）（20130172110018）

作者简介：刘光毅（1989-），男，硕士，研究方向为蛋白质的原核表达、分离纯化与结构研究

通讯作者：胡松青（1972-），男，教授，博导，研究方向为蛋白质的分离纯化、结构功能与应用性可逆结合形成复合物，然后通过膜过滤使目标蛋白质与其他杂质分离的方法，它是亲和分离和膜分离技术相互结合的新型分离技术，具有如纯化倍数高、分离特异性高、处理量大、易于放大等优点[1~2]。目前，固定金属离子亲和层析技术作为亲和分离的一种方式已经成功地用于小型分离纯化实验[3~4]，然而亲和层析具有一些不足的地方，如处理量小、柱压大等，因此限制了它的的扩大化和工业化，不能满足实践生产的

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需要。将过渡金属离子亲和配基引入水溶性亲和载体，开发出可以实现对一类蛋白质进行亲和分离的亲和-膜分离载体对重组蛋白质的分离领域和生物医药工程下游技术的发展具有重要的意义。本实验中以2000 ku 的水溶性葡聚糖DextranT2000为基质，亚氨基二乙酸(IDA)作为螯合剂，Cu2+做亲和配基制备了水溶性葡聚糖亲和-超滤载体[5]。该载体中的Cu2+可以与组氨酸(His)标记的重组蛋白中的His标签以配位键可逆结合（螯合作用），为特异性分离该类带His标记的重组蛋白提供了强有力的作用力。此外，蛋白质之间静电作用和疏水作用也是不容忽视的，但这种作用远不如配位作用那么牢固，其受溶液环境影响较大，也是影响分离纯化率不可忽视的重要因素[6]。

在醋酸杆菌Acetobacterxylinum中，由4个不同亚基组装而成的跨膜末端蛋白聚集体具有合成、组装和排出纤维素的功能，AxCeSD是其中一个亚基，在醋酸杆菌中承担纤维素葡聚糖链的排出和结晶[7]。AxCeSD由156个氨基酸残基组成，分子量为17.3 ku。本文应用水溶性葡聚糖亲和-超滤载体分离含有N-末端His-标记的重组AxCeSD，并研究不同条件下亲和-超滤载体对重组蛋白AxCeSD吸附量的变化，了解不同实验因素对亲和-超滤载体吸附His-标记蛋白分离特性的影响，为实现亲和-超滤载体分离基因重组蛋白提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

重组AxCeSD的大肠杆菌E.coli B384，即自行构建的重组AxCeSD（带有N-末端His标记）质粒在宿主细菌E.coli B384中表达，AxCeSD的表达基因片段来源于木醋杆菌Acetobacterxylinum；葡聚糖，Dextran T2000，相对分子量200 ku，美国Sigma公司，分析纯；亚氨基二乙酸(IDA)，上海楷洋生物技术有限公司，分析纯；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

TF2A5L型全自动发酵罐，韩国Biotron公司；VCX 500型超声破碎仪，美国Sonics公司；AKTA Purifier型蛋白质快速层析分离系统，美国GE公司；超速冷冻离心机，美国Sigma；Waters2695型凝胶色谱仪，美国Waters公司；Zeta weight Nano ZS 型Zeta 电位分析仪，英国Malven公司；30 ku超滤离心膜，美国millipore。1.3 试验方法

1.3.1 水溶性葡聚糖亲和-超滤载体的制备

以分子量200 ku的水溶性葡聚糖DextranT2000为基质，亚氨基二乙酸(IDA)作为螯合剂，Cu2+做亲和配基制备出大分子水溶性葡聚糖亲和-超滤载体，具体制备方法参见文献[5]。

1.3.2 水溶性葡聚糖亲和-超滤载体分子量分布的测定

大分子亲和-膜过滤载体分离蛋白质是基于将分子量相对较大的亲和-膜过滤载体与目标蛋白质分子依靠特异性吸附形成分子量远大于其它杂质分子的结合体，再应用超滤膜的筛分作用将结合体与其它杂质分子分离。因此，亲和-膜过滤载体的分子量分布是表征其性能的指标之一。利用凝胶渗透色谱(GPC)分析水溶性葡聚糖亲和-超滤载体分子量分布，所用色谱柱为TSK-GELPWxl 3000和PWxl 5000，流动相为0.02 mol/L KH2PO4，流速为0.6 mL/min，采用Waters2714示差检测器，柱温及检测温度均为35 ℃，首先取已知不同分子量的葡聚糖标准品绘制标准曲线，然后取适量制备好的水溶性葡聚糖亲和-超滤载体，将其稀释为4 mg/mL用于GPC测定。

1.3.3 重组蛋白表达和纯化

采用LB液态培养基培养重组AxCeSD的大肠杆菌E.coli B384，在菌液的OD600值达到0.6~0.8时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达18 h[8]。高速离心后获得的菌体经超声破碎后，离心取上清液进行固定化金属亲和层析(IMAC)。将分离纯化得到的纯AxCeSD溶液采用20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，0.2 M NaCl缓冲液在4℃下透析48 h，透析袋的截留分子量为5000 Da。透析完成后，将蛋白质溶液置于-80℃冰箱中冷冻，再经真空冷冻干燥制成粉末备用。

1.3.4 重组蛋白AxCeSD的浓度测定

采用280 nm紫外吸收法测定重组蛋白AxCeSD 的浓度[9]。

1.3.5 重组蛋白的等电点测定

本文采用Zeta电位仪测定等电点，其原理是根据激光多普勒法测定体系的电泳淌度，然后将其转换为Zeta电位值，将测定的Zeta电位值对pH值自动作图，Zeta电位为零时所对应的pH值即为所测蛋白质溶液的等电点[10]。

1.3.6 不同条件对水溶性葡聚糖亲和-超滤载体吸附AxCeSD特性的影响

取5 mL浓度为4 mg/mL的水溶性葡聚糖亲和-

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超滤载体溶液和浓度为0.4858 mg/mL AxCeSD 溶液5 mL ，在水浴中恒温至25 ℃后混合，加入1.5 mol/L NaCl 溶液使反应体系的离子浓度为0.9 mol/L ，用0.1 mol/L NaOH 调节反应液pH 至8.0，在25 ℃搅拌反应1 h 。在进行pH 、离子强度和吸附反应时间等操作条件对重组AxCeSD 吸附量的影响实验时，保持其它条件不变。反应完成后，用截留分子量为100 ku 的超滤膜，以4 ℃、2739×g 离心力的条件离心超滤3次，

以

图1 水溶性亲和-超滤载体的GPC 图谱

Fig.1 GPC spectrum of water-soluble affinity-ultrafiltration escort

利用GPC 测得载体分子量分布见图1。从图中可以看出，水溶性葡聚糖亲和-超滤载体呈现出分子量较大的1号峰和分子量较小的2号峰，由GPC 软件处理分别得到1号峰和2号峰所的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、峰位分子量(Mp)及分子量的分布宽度(Mw/Mn)(见表1)。由表1中的数据可以看出所制备的亲和-膜过滤载体的分子量分布范围为236.47~2380.53 ku ，能够满足以截留分子量为100 ku 的超滤膜分离蛋

的金属螯合层析图谱；(b) AxCeSD 蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.2 (a) Metal chelating chromatography of AxCeSD and (b) SDS-PAGE of proteins collected during affinity purification of

AxCeSD

注：1：标准分子量蛋白；2：咪唑洗脱收集蛋白。

图2a 是以洗脱缓冲液体积为横坐标、280 nm 处吸光度为纵坐标的亲和层析分离图谱。前后出现的两个峰分别为穿透峰和洗脱峰，在含咪唑浓度为0.1 mol/L~0.25 mol/L 的洗脱缓冲液中获得了与Ni 2+离子

特异性结合的带His标记的AxCeSD目的蛋白，SDS-PAGE的结果如图2b所示，目的蛋白与其它杂蛋白得到很好的分离，在分子量为16 kD~25 kD的蛋白条带之间得到了一个单一条带，这与AxCeSD的分子量为17.3 kD基本相符。

2.3 重组蛋白AxCeSD的等电点测定

图3 重组AxCeSD的Zeta电位曲线

Fig.3 Zeta potential curves of recombinant AxCeSD

重组AxCeSD的Zeta电位随溶液pH变化的曲线如图3所示，发现在pH为4.53时重组AxCeSD的Zeta 电位为0，因此，重组AxCesD的等电点为4.53，即重组AxCeSD为酸性蛋白。当环境pH小于4.53时,重组AxCeSD呈现出阳离子性质，而当环境pH大于4.53时，重组AxCesD呈现出阴离子性质。

2.4 pH对水溶性葡聚糖亲和-超滤载体吸附AxCeSD的影响

图4 pH对载体吸附重组AxCeSD的影响

Fig.4 Effect of pH on the adsorption characteristics of the escort

with AxCeSD

图4探讨了pH在4~9范围内，亲和-超滤载体对AxCeSD吸附量的影响。从图4可以得出随着pH的上升，载体对AxCeSD吸附量在不断增加，究其原因是当pH大于其等电点4.53后，重组蛋白AxCeSD自身所带的正电荷减少，负电荷增加，与载体中带正电荷金属配基的静电排斥作用减弱，促进了吸附的进行。此外，重组蛋白AxCeSD上一些基团（如组氨酸上的咪唑基，pKa为5.71）在pH的变化中逐渐带负电荷，增强了与载体之间的静电引力，导致重组蛋白AxCeSD的吸附量上升。

2.5 离子浓度对水溶性葡聚糖亲和-超滤载体吸附AxCeSD的影响

图5 离子强度对载体吸附AxCeSD的影响

Fig.5 Effect of ionic strength on the adsorption characteristics of

the escort with AxCeSD

研究了吸附反应体系中的NaCl浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mol/L时，水溶性葡聚糖亲和-超滤载体吸附重组AxCeSD的变化趋势。结果如图5所示，水溶性葡聚糖亲和-超滤载体对重组AxCeSD的吸附量随着离子强度的增加持续减少。因此，反应体系中的离子强度是影响水溶性葡聚糖亲和-超滤载体对重组AxCeSD吸附的重要因素之一。由于重组AxCeSD 表面存在有水化层，随着离子强度的上升，离子对极性水分子的吸附，导致水化层减薄，表面疏水性“补丁”外露，蛋白质疏水性增强，与亲水性的水溶性葡聚糖亲和-超滤载体载相互作用减弱；此外，离子强度的增加，减少了水溶性葡聚糖亲和-超滤载体与蛋白质之间的离子键作用，因此水溶性葡聚糖亲和-超滤载体对重组AxCeSD的吸附量随着离子强度的增加而减少。

2.6 吸附时间对水溶性葡聚糖亲和-超滤载体吸附AxCeSD的影响

载体与AxCeSD的吸附是个动态过程，吸附的同时也会发生解吸附，当吸附速度大于解吸附速度时，随着时间的增长，吸附量会不断增加。而当两者速度相等时，吸附量不再增加，此时有最大吸附量，具体影响见图6。从图中可以得出10 min后，亲和超滤载

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体对AxCeSD 的吸附量接近最大吸附量的90%，说明载体与AxCeSD 的吸附速度远远大于解吸附速度。当时间从10 min 到30 min 时，载体对AxCeSD 吸附量缓慢增加，30 min 时有最大吸附量，此时吸附与解吸附动态平衡。当时间延长到60 min ，吸附量基本不变略微有下降的趋势，这可能是因为随着时间的延长，物理作用导致亲和载体与AxCeSD 结合键的力度减弱，使得重组蛋白被解吸出来。

量的变化规律，结果见图7。从图中可以看出，随着温度的升高，水溶性葡聚糖亲和-超滤载体对AxCeSD 的吸附量不断增大。实验结果表明，水溶性葡聚糖亲和-超滤载体与重组AxCeSD 的吸附反应应该是一个吸热过程，温度的升高对水溶性葡聚糖亲和-超滤载体与重组AxCeSD 形成结合体有利。而且，根据化学动力学，温度的升高往往有利于提高反应速率。但是，

对于蛋白质，温度的增加会降低蛋白质的稳定性，使其空间结构发生改变。考虑到30 ℃左右一般不会引起多数蛋白质变性，因此，在实际操作中可在不影响AxCeSD 结构和性质下尽可能选择较高的吸附温度，如30 ℃。

2.8 水溶性葡聚糖亲和-超滤载体对AxCeSD 关系数的平方R 2=0.9502，说明Langmuir 等温吸附方程能较好地拟合，亲和-超滤载体对AxCeSD 的吸附同样符合单分子层吸附。从等温吸附方程式可以得出，水溶性葡聚糖亲和-超滤载体对AxCeSD 的最大理论吸附量为125.15 mg/g ，解离常数为0.4563 mg/mL 。该载体吸附溶菌酶的最大理论吸附量为1

3.65 mg/g ，解离常数为 3.019 mg/mL [11]。由此可见，其对重组

AxCeSD的最大理论吸附量是对溶菌酶的最大理论吸附量的10倍左右。而且，重组AxCeSD在溶液中往往以八聚体（约140 ku）的形式存在，其解离常数约合3.259×10-6 mol/L。特异性吸附的解离常数一般在10-6~10-8 mol/L之间，水溶性葡聚糖亲和-超滤载体对AxCeSD的解离常数的数量级为10-6，表明特异性的螯合作用在水溶性葡聚糖亲和-超滤载体对重组AxCeSD的吸附中起主要作用。

3 结论

亲和-超滤载体的分子量分布在17.538~232.49 ku，可选择截留分子量为100 ku的超滤膜进行亲和-超滤分离操作；重组蛋白AxCeSD的等电点为4.53；一定范围内pH或温度的增加有利于亲和-超滤载体对AxCeSD的吸附；离子浓度的增加则不利于亲和-超滤载体与AxCeSD的吸附，具有较大的抑制作用；亲和-超滤载体对AxCeSD的吸附在短时间内能够达到平衡，应用Langmuir方程拟合了等温条件下亲和-超滤载体对AxCeSD的吸附曲线，得到最大理论吸附量为125.15 mg/g，解离常数为3.259×10-6 mol/L，说明特异性的螯合作用在亲和-超滤载体吸附重组AxCeSD过程发挥主要作用。

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吸附等温线地测定方法

吸附动力学和热力学的大致了解只是动力学是做时间变化曲线，热力学是温度变化曲线。 查文献的时候没有具体步骤，只是有图（好像纵坐标用Qmg/g表示）。 吸附等温线是研究固体表面状态和孔结构不可缺少的工具，因此必须充分重视吸附等温线 的测定方法及其测定条件。 .1 试样预处理 固体表面的性质与试样的预处理条件紧密相关，必须仔细研究并控制预处理条件，防止在 预处理过程中改变固体的表面性质和内部结构。因此，要求预先详细了解试样的性质。如 对于微孔物质，由于微孔内吸附势非常大，连氦气也能被吸附。比表面积测定中使用的氮 气能很强地吸附在沸石等复杂氧化物和氢氧化物的酸性位置。氧化铝的相变化很复杂。对 具有孔结构的物质，预处理温度过低，不能充分除去吸附水和孔内的其他吸附分子；温度 过高，容易发生羟基间的缩聚脱水，或发生烧结引起孔和表面的变化。因此，需要选择合 适的温度进行预处理。最好是利用第6章介绍的热分析等方法预先掌握吸附质的脱附温度、试样的结构变化温度、相转移温度、分解温度，确定最佳预处理条件。 除了质量管理等特殊情况外，测定气相吸附量和液相吸附量时都必须确定预处理条件，使 试样上原来吸附的分子完全脱除，或者预先吸附一定量的某种吸附质。预处理条件因试样 而异，下面介绍预处理时的一般注意点。 .1.1 预处理的保护气氛 对容易发生氧化还原等表面反应的试样以及要求严格脱除原来吸附分子的试样（如金属粉 末和活性炭），预处理时需要采用高真空或高纯氮、高纯氦等惰性气体。粉末试样在抽真 空太快时，由于粉末内部包含的气体突出，容易发生粉末飞散。这不仅减少了试样质量， 而且细粉末还会进入到压力计等真空测量系统内，降低体系的真空度，且很难清除干净。 为了防止发生这种情况，可以预先干燥试样，控制除气和升温速度不要太快，还可在试样 上方装过滤样，控制除气和升温速度不要太快，还可在试样上方装过滤器以防万一。 .1.2 抽真空 除气时间要足够长。对于沸石、活性炭和硅胶等多孔体，微孔内的吸附物质完全扩散到孔 外需要很长的时间，必须保证充足的除气时间。试样附近的真空度一般低于真空泵的真空度，当压力计安放在真空泵附近时，更要注意这种差别。因此，要求排气管短，内径大， 充分除气，切实保证真空度。油旋转泵要使用抗污油，并定期更换抗污油。真空泵与试样 之间要设置液氮浴，使油蒸气不扩散到试样中，防止污染试样；从试样过来的气体不进入 到油中，防止这些气体降低油的蒸气压。液氮浴使用前要清洗干净，如条件允许，预处理 和吸附测定最好分别使用不同的真空管线。高真空时最好使用不需要油的分子涡轮泵。此外，由于吸附水的脱附可能在孔内引发表面水热反应，因此要控制真空除气速度，保持加 热温度和除气速度的平衡，最好采用计算机程序控制除气和气温的速度，防止发生水热反应。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与

植物表达载体转化农杆菌操作步骤

植物表达载体转化农杆菌操作步骤 来源：郭庆水的日志 植物表达载体转化农杆菌操作步骤 第一部分：农杆菌介导转化水稻 1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101 2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。 3、农杆菌感受态细胞的制备： 1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。 2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min； 3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min； 5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化； 制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。 4、DNA直接转化农杆菌： 1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min； 2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min； 3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr； 4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。 （pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 5、重组农杆菌鉴定： 1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。 3）质粒酶切或PCR鉴定。 6、三亲交配法： 参考一： 1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养； 3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养； 4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养； 5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜； 6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 （4） P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。

吸附脱附曲线分析

吸附等温线- 概述 吸附等温曲线是指在一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。在一定温度下,分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附方程式来表示〔1〕。作为吸附现象方面的特性有吸附量、吸附强度、吸附状态等,而宏观地总括这些特性的是吸附等温线〔2〕。吸附等温曲线用途广泛,在许多行业都有应用。在地质科学方面,可以用于基于吸附等温线的表面分形研究及其地球科学应用〔3〕;在煤炭方面,煤对混合气体中CH4和CO2的吸附呈现出不同的吸附特点;煤对CO2优先吸附,并且随着压力的升高,煤对CO2选择性吸附… 吸附等温线- 吸附等温线平衡 在恒定温度下，对应一定的吸附质压力，固体表面上只能存在一定量的气体吸附。通过测定一系列相对压力下相应的吸附量，可得到吸附等温线。吸附等温线是对吸附现象以及固体的表面与孔进行研究的基本数据，可从中研究表面与孔的性质，计算出比表面积与孔径分布。 吸附等温线有以下六种（图 1）。前五种已有指定的类型编号，而第六种是近年补充的。吸附等温线的形状直接与孔的大小、多少有关。 Ⅰ型等温线：Langmuir 等温线 相应于朗格缪单层可逆吸附过程，是窄孔进行吸附，而对于微孔来说，可以说是体积充填的结果。样品的外表面积比孔内表面积小很多，吸附容量受孔体积控制。平台转折点对应吸附剂的小孔完全被凝聚液充满。微孔硅胶、沸石、炭分子筛等，出现这类等温线。

这类等温线在接近饱和蒸气压时，由于微粒之间存在缝隙，会发生类似于大孔的吸附，等温线会迅速上升。 Ⅱ型等温线：S 型等温线 相应于发生在非多孔性固体表面或大孔固体上自由的单一多层可逆吸附过程。在低 P/P0处有拐点B，是等温线的第一个陡峭部,它指示单分子层的饱和吸附量，相当于单分子层吸附的完成。随着相对压力的增加，开始形成第二层，在饱和蒸气压时，吸附层数无限大。 这种类型的等温线，在吸附剂孔径大于 20nm时常遇到。它的固体孔径尺寸无上限。在低P/P0区，曲线凸向上或凸向下，反映了吸附质与吸附剂相互作用的强或弱。 Ⅲ型等温线：在整个压力范围内凸向下，曲线没有拐点 B 在憎液性表面发生多分子层，或固体和吸附质的吸附相互作用小于吸附质之间的相互作用时，呈现这种类型。例如水蒸气在石墨表面上吸附或在进行过憎水处理的非多孔性金属氧化物上的吸附。在低压区的吸附量少，且不出现 B 点，表明吸附剂和吸附质之间的作用力相当弱。相对压力越高，吸附量越多，表现出有孔充填。有一些物系（例如氮在各种聚合物上的吸附）出现逐渐弯曲的等温线，没有可识别的 B点．在这种情况下吸附剂和吸附质的相互作用是比较弱的。 Ⅳ型等温线： 低P/P0区曲线凸向上，与Ⅱ型等温线类似。在较高P/P0区，吸附质发生毛细管凝聚，等温线迅速上升。当所有孔均发生凝聚后，吸附只在远小于内表面积的外表面上发生，曲线平坦。在相对压力 1 接近时，在大孔上吸附，曲线上升。 由于发生毛细管凝聚，在这个区内可观察到滞后现象，即在脱附时得到的等温线与吸附时得到的等温线不重合，脱附等温线在吸附等温线的上方，产生吸附滞后(adsorption hysteresis)，呈现滞后环。这种吸附滞后现象与孔的形状及其大小有关，因此通过分析吸脱附等温线能知道孔的大小及其分布。 V型等温线的特征是向相对压力轴凸起。与III型等温线不同，在更高相对压力下存在一个拐点。V型等温线来源于微孔和介孔固体上的弱气－固相互作用，微孔材料的水蒸汽吸附常见此类线型。 VI型等温线以其吸附过程的台阶状特性而著称。这些台阶来源于均匀非孔表面的依次多层吸附。液氮温度下的氮气吸附不能获得这种等温线的完整形式，而液氩下的氩吸附则可以实现。

(完整版)BET吸附-脱附曲线分析及含义

气体吸附等温线通常分为六种，其中五种（I-V）是由国际理论与应用化学会（IUPAC）所定义的。I型等温线表示在低的相对压力（平衡蒸汽压与饱和蒸汽压的比值）时，材料具有很强的吸附能力进而达到平衡。I型等温线通常被认为是在微孔或者单层吸附的标志，由于强的吸附作用。（这可能也有化学吸附的作用，涉及到在吸附质与吸附剂表面的化学键作用，这里我们不讨论化学吸附）值得注意的是，孔的大小是根据他们的直径（或宽度）来进行分类的：微孔（小于2nm），中孔（2-50nm），大孔（大于50nm）。鉴于大多数多孔固体是使用非极性气体（N2 Ar）进行吸附研究的，所以不太可能出现化学吸附作用。因此，对于I型等温线的经典解释是材料具有微孔。然而，I型等温线也有可能是具有孔径尺寸非常接近微孔的介孔材料。尤其是N2在77K或者Ar在77K和87K圆柱孔情况下，I型等温线将在较低的相对压力（大约0.1作用）下达到平衡对于材料是微孔，从最近的一些报道结果得出的。因此，当I型等温线没有在相对压力0.1处达到平衡，该材料有可能存在大量的中孔或者就是单独的中孔。然而，这种I型分布有可能在某种程度上介孔孔径分布范围变宽。这是因为分布高度均匀圆柱孔的材料可能展示出在相对压力低于0.1或者更小时，可以在吸附等温线被识别（因此，这些等温线可以被分类成IV型等温线，下面我们会讨论）。 尽管，接近饱和蒸汽压的多层可能会十分不连续，但大孔材料大多是通过随着相对压力增加时，吸附量逐渐地增加的方式进行多层吸附。这种不受限制的多层形成过产生了II型和III型等温线。在这种情况下，吸附-脱附曲线重合；也就是说，没有发生滞后现象。这主要取决于所测试的材料的性质，II型等温线是单层形成的明显特征，否则是在整个压力范围内都是凸起的III型等温线。后者的行为可以观察到在吸附分子与吸附剂表面和被吸附物作比

气固吸附等温线的分类

气固吸附等温线的分类 陈思 化学与化工学院 14级化学基地班 201417110005 摘要：论述了从早期的BDDT 的5种类型吸附等温线，到 IUPAC 的6种类型吸附等温线，再到基于 Ono-kondo 晶格模型的 Gibbs 吸附分类的5种类型吸附等温线，并讨论了与各种类型吸附等温线类型相对应的吸附过程和机理。 关键词：气固吸附；等温线；分类；机理 1.引言 温度一定时，反映吸附质平衡分压p与吸附量a之间关系的曲线称为吸附等温线【1】。吸附等温线是有关吸附剂孔结构、吸附热以及其它物理化学特征的信息源。在恒定的温度和宽范围的相对压力条件下可得到被吸附物的吸附等温线。正确判断吸附等温线类型，对于吸附剂孔结构等参数的计算是非常重要的。 IUPAC（International Union of Pure and Applied Chemistry，国际纯理论与应用化学协会）手册上就有说明：对于吸附过程的研究，第一步就是“确定吸附等温线的类型，然后再确定吸附过程的本质”【2】。 吸附等温线是吸附相平衡的具体描述，是吸附分离装置设计所必需的参数。对于气固吸附相平衡的研究，人们通常都是从对所研究的吸附等温线的归类开始入手的。通过对一系列吸附等温线的分类，人们可以更好地理解各种吸附机理并建立相应的理论模型。 目前，相关文献报导的众多吸附等温线包括了种类繁多的吸附剂和吸附质，然而这些吸附等温线还是呈现出一定的规律性，根据吸附线形状或吸附发生的压力及温度不同有以下几种分类方法。 2.BDDT 的 5 种类型吸附等温线 1940 年，在前人大量的研究和报道以及从实验测得的很多吸附体系的吸附等温线基础上，Brunauer S.，Deming L. S.，Deming W. E.和Teller E.等人对各种吸附等温线进行分类，将吸附等温线分为5类（如图 1 所示），称为 BDDT 分类【3】，也常被简称为 Brunauer 吸附等温线分类。 图1 BDDT 吸附等温线的5种类型【4】 类型Ⅰ是Langmuir 型曲线，表示吸附剂毛细孔的孔径比吸附质分子尺寸略大时的单层分子吸附或在微孔吸附剂中的多层吸附或毛细凝聚。该类吸附等温线，在吸附质平衡分压较小时，吸附量随气体分压的增大而增大，近乎成直线关系；在气体平衡分压很大时，吸附量

吸附等温线

吸附等温线 包伟 吸附相平衡是吸附分离科学技术的重要基础之一，是表述吸附剂对吸附质分子的最大吸附容量以及吸附选择性。吸附等温线是吸附相平衡的具体描述，是吸附分离装置设计所必需的参数。通过对一系列吸附等温线的分类，人们可以更好地理解各种吸附机理并建立相应的理论模型。同时这一系列吸附等温线的分类还有利于将理论模型更好地应用到实际中去，例如用BET 或Langmuir 的方法测量出样品的比表面积。IUPAC [International Union of Pure and Applied Chemistry，国际理论与应用化学协会]手册上就有说明：对于吸附过程的研究，第一步就是“确定吸附等温线的类型，然后再确定吸附过程的本质[1,2]”。对于吸附等温线的分类，主要有以下3种分类方法： 1.早期的BDDT 的5 类吸附等温线 1940年，在前人大量的研究和报道以及从实验测得的很多吸附体系的吸附等温线基础上，Brunauer S.，Deming L. S.，Deming W. E.和Teller E.等人对各种吸附等温线进行分类，将吸附等温线分为5类(如图1所示)，称为BDDT分类，也常被简称为Brunauer吸附等温线分类。（如上图所示） 类型I 是向上凸的Langmuir 型曲线，表示吸附剂毛细孔的孔径比吸附质分子尺寸略大时的单层分子吸附或在微孔吸附剂中的多层吸附或毛细凝聚。该类吸附等温线，沿吸附量坐标方向，向上凸的吸附等温线被称为优惠的吸附等温线。在气相中吸附质浓度很低的情况下，仍有相当高的平衡吸附量，具有这种类型等温线的吸附剂能够将气相中的吸附质脱除至痕量的浓度，如氧在-183℃下吸附于炭黑上和氮在-195℃下吸附于活性炭上，以及78K时N2在活性炭上的吸附及水和苯蒸汽在分子筛上的吸附。 类型II 为形状呈反S 型的吸附等温线，在吸附的前半段发生了类型I 吸附，而在吸附的后半段出现了多分子层吸附或毛细凝聚，例如在20℃下，炭黑吸附水蒸气和-195℃下硅胶吸附氮气。 类型III 是反Langmuir 型曲线。该类等温线沿吸附量坐标方向向下凹，被称为非优惠的吸附等温线[4]，表示吸附气体量不断随组分分压的增加直至相对饱和值趋于 1 为止，曲线下凹是由于吸附质与吸附剂分子间的相互作用比较弱，较低的吸附质浓度下，只有极少量的吸附平衡量，同时又因单分子层内吸附质分子的互相作用，使第一层的吸附热比诸冷凝热小，只有在较高的吸附质浓度下出现冷凝而使吸附量大增所引起的，如在20℃下，溴吸附于硅胶。 类型IV 是类型II 的变型，能形成有限的多层吸附，如水蒸气在30℃下吸附于活性炭，在吸附剂的表面和比吸附质分子直径大得多的毛细孔壁上形成两种表面分子层。 类型V 偶然见于分子互相吸引效应是很大的情况，如磷蒸汽吸附于NaX 分子筛。 BDDT吸附等温线分类在国际学术界曾被广泛接受，并用于在吸附相平衡研究中解

亲和素和生物素的ELISA试剂盒的应用

亲和素和生物素的ELISA试剂盒的应用 亲和素-生物素系统在ELISA试剂盒中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA试剂盒中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。 应用亲和素和生物素的ELISA试剂盒,亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素。生物素又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯(BNHS)可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素医学教育网整理化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA试剂盒偶联起来，就可大大提高ELISA试剂盒的敏感度。 Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM 抗体ELISA检测。【试剂盒规格】：48T/96T 【试剂盒方法】：酶联免疫法/酶免法(ELISA) 【性状】：液态 【试剂盒种属】马铃薯、鹿、羊、鸡、鸭、鱼、人、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、裸鼠、兔子、猪、犬、猴、马、牛等动植物。 【试剂盒标本】血清、血浆、细胞上清液、尿液、体液、灌洗液、脑脊髓、心房水、胸房水、组织等 【用途】：科研实验 【贮存】：贮存于2℃-8℃. ELISA试剂盒操作注意事项 1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。 本公司长期供应进口ELISA试剂盒，种属齐全,有专门检测人、小鼠、大鼠、豚鼠、猪、狗、猴、羊、牛、鸡、兔等各种样本科研试剂盒。试剂盒提供免费代测、技术指导、全方位售后服务，欢迎来电咨询。

氮气吸附脱附曲线

1. I 类吸附等温线都有哪些特点？哪种多孔材料表现为I 类吸附等温线？ I型等温线弯向P/P0轴，其后的曲线呈水平或近水平状，吸附量接近一个极限值，是典型的Langmuir等温线。吸附量趋于饱和是由于受到吸附气体能进入的微孔体积的制约，而不是由于内部表面积。在P/P0非常低时吸附量急剧上升，这是因为在狭窄的微孔（分子尺寸的微孔）中，吸附剂-吸附物质的相互作用增强，从而导致在极低相对压力下的微孔填充。但当达到饱和压力时（P/P0>0.99），可能会出现吸附质凝聚，导致曲线上扬。?微孔材料表现为I类吸附等温线。对于在77K的氮气和87?K的氩气吸附而言，I(a):? 是只具有狭窄微孔材料的吸附等温线，一般孔宽小于1?nm。?I(b):? 微孔的孔径分布范围比较宽，可能还具有较窄介孔。这类材料的一般孔宽小于2.5?nm。?具有相对较小外表面的微孔固体（例如，某些活性炭，沸石分子筛和某些多孔氧化物）具有可逆的I型等温线。其特点是吸附很快达到饱和。? 2. II 类吸附等温线都有哪些特点？哪种多孔材料表现为II 类吸附等温线？ 无孔或大孔材料产生的气体吸附等温线呈现可逆的II 类等温线。其线形反映了不受限制的单层-多层吸附。如果膝形部分的曲线是尖锐的，应该能看到拐点B，它是中间几乎线性部分的起点——该点通常对应于单层吸附完成并结束；如果这部分曲线是更渐进的弯曲（即缺少鲜明的拐点B），表明单分子层的覆盖量和多层吸附的起始量叠加。当P/P0?=1 时，还没有形成平台，吸附还没有达到饱和，多层吸附的厚度似乎可以无限制地增加。? 3. III 类吸附等温线都有哪些特点？哪种多孔材料表现为III 类吸附等温线？ III型等温线也属于无孔或大孔固体材料。它不存在B点，因此没有可识别的单分子层形成；吸附材料-吸附气体之间的相互作用相对薄弱，吸附分子在表面上在最有引力的部位周边聚集。对比II型等温线，在饱和压力点（即，在P/P0=1处）的吸附量有限。? 4. IV 类吸附等温线都有哪些特点？哪种多孔材料表现为IV 类吸附等温线？ IV型等温线是来自介孔类吸附剂材料（例如，许多氧化物胶体，工业吸附剂和介孔分子筛）。介孔的吸附特性是由吸附剂-吸附物质的相互作用，以及在凝聚状态下分子之间的相

表达载体转化的方法

目前外源基因导入叶绿体基因组的方法主要有基因枪转化法、PEG介导转化法、显微注射及激光注射法、转运肤介导的叶绿体间接转化法、电击法等。 (1)基因枪转化法 基因枪法是20世纪80年代后期发明的，它是将外源DNA(通常是带有目 的基因的质粒载体)如附在金属颗粒(如钨、金等)表面，然后通过高压动力装 置将金属颗粒轰击到受体细胞中的特定部位。基因枪法是目前己被验证的叶绿体基因组转化转化效率最高、采用最多的方法。大多数己经成功的叶绿体基 因组转化都是用这种方法实现的。它可以通过人为控制，将外源DNA导入到 细胞核及细胞器(如叶绿体体、线粒体等部位)中。基因枪法不受物种和基因型 的限制，转化后的组织可以迅速再生成植株，并且这一方法适合于不同种类的植物，其缺点是成本较高，操作复杂，不易普及到所有实验室。 (2)PEG介导转化法 PEG介导转化法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原生质体暴露 在纯化过的外源DNA中，由于PEG的存在，原生质体会先缩水，然后细胞膜结构会发生重构，在细胞膜结构到达不可逆破坏之前除去PEG，细胞膜结构又会回复到原先的自然稳定状态。在此过程中，外源DNA有机会进入胞内及质 体内，从而实现外源基因的转化。Golds等用PEG介导转化法成功地实现了烟草的原生质体转化，为质体转化提供了一条新的途径。该方法虽然成本较低，但原生质体的制备和再生比较困难，使得转化植株的再生频率较低，从而限制了这一方法的普遍应用。到目前为止，只有PEG法在烟草质体转化中获得成功的报道。 (3)显微注射及激光注射法 显微注射及激光注射法就是利用能量很高、直径很小的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔，从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。早在1987年，webe等就利用微束激光照射油菜细胞，将用荧光素标记的外源DNA 导入叶绿体，观察到荧光显示，并且发现这一处理对叶绿体的光合能力和细胞的分裂能力影响较小。由于激光微束穿刺技术操作简便，转化频率高，从而引起了许多科学家的重视，由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展。此后，Kllobfauch等研究开发出了一种称为“毫微注射技术”(几mtojeetionteehnique)的叶绿体基因组转化方法。该方法是用一种亚显微直径为

2020年表达载体的构建方法及步骤

作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表

达载体。 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否

亲和素与生物素系统的基本原理

亲和素与生物素系统的基本原理 1979年，Guesdon及其同事首先将生物素—亲和素应用于免疫组化技术中，并成功地建立了标记亲和素—生物素技术(LAB)和桥亲和素—生物素技术(BAB)。1981年，Hsu在LAB法和BAB法的基础上，先后建立了生物素—亲和素间接法及ABC法。近年来，由于双重免疫组化标记技术的发展，除ABC-HRP试剂外，还制成了ABC-AKP和ABC-GOD试剂，进而发展了ABC-AKP等技术。同时人们又对ABC法进行改进，相继出现了快速ABC法、二步ABC法、PAP和ABC连用等技术。随着链霉亲和素(streptavidin)的应用又出现了LSAB、S-P、SABC等方法。 1．标记亲和素—生物素法(1abeledavidinbiotin，LAB) 将亲和素与标记酶(HRP)结合，一个亲和素可结合多个HRP；将生物素与抗体(一抗或二抗)结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原(或通过一抗)先与生物素化的抗体结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。 2．桥接亲和素—生物素法(bridgedavidinbiotin，BAB) 先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素为“桥”物素连接，也可达到多层放大效果。将生物素化抗体与酶标记生 3．亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC) 此方法为前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶标生物素(或称生物素化酶)结合，形成亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(ABC复合物)。抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物(此ABC复合物不能饱和，即亲和素上的4个结合位点最多允许3个位点与生物素化酶结合，留1～2个位点与生物素化二抗结合)结合，最终形成巨大复合体。因该复合体网络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。

如何对表达载体进行选择及读谱方法

如何对表达载体进行选择及读谱方法 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+,Kan+ （3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段 （4）P/E启动子/增强子 （5）Terms终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的4点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 （1）启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。（2）增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。

初级检验技师临床免疫学和免疫检验(2017年讲义)第十一章生物素-亲和素放大技术

第十一章生物素-亲和素放大技术 生物素、亲和素是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。 第一节生物素的理化性质与标记 生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。 一、活化生物素 利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。 （一）标记蛋白质氨基的活化生物素 （二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。 （三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。 （四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。 1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。 2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。用缺口移位法掺入到双链DNA中。 3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。 二、生物素标记蛋白质 （一）生物素化蛋白质衍生物的特性 生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。 （二）标记方法 1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。 2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。 （三）标记注意事项 1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。 2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。 3.为减少生物素标记蛋白质后，大分子物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。 4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。 第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记 亲和素和链霉亲和素是大分子蛋白，几乎可以和任何用于标记的物质结合。 一、亲和素及其活性

等温吸附曲线解释

Langmuir 吸附等温线物理意义: VL:煤岩的最大吸附能力(这时P →∞),简称兰氏体积. PL:吸附量V 达到VL/2时所对应的压力值,简称兰氏压力.影响吸附等温线的形态参数,反映煤层气解吸的难易,值越低,脱附越容易,开发越有利. ? V1:当前地层压力下的煤岩理论含气量. P1:储层压力,即当前煤储层压力. ? V2:当前地层压力下的实际含气量. P2:临界解吸压力,甲烷开始解吸的压力点. ? Vi:排采过程中含气量. Pi:排采过程中的储层压力. ? Vn:煤层残留含气量. Pn:煤层气井的枯竭压力. Langmuir 吸附等温线生产中的意义: ? V2/V1—含气饱和度. ? (V2-Vn)/V2—理论最大采收率. ? (V2-Vi)/V2—生产过程中动态采收率. ? 根据临界解吸压力和储层压力可以了解煤层气的早期排采动态. ? 若煤层欠饱和(V2

生物素-亲合素系统

生物素-亲合素系统 生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。 生物素亲合素系统 1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法（LAB／BA）与桥联亲合素—生物素技术（BRAB）。1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）。近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、S PA等。生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。 BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分 子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。特别是其中的BA法和ABC法用得较多。至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据B AS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。 BAELISA原理 BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kD a，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。 链霉亲和素及其活性 链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。 1 t. \3 I* d, V4 B5 F: s 链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L ／mol。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的