hTERT基因电转染人_T细胞建立可诱导的永生化细胞系_庞永胜

２０１２年９月内蒙古大学学报（自然科学版）Ｓｅｐｔ．２０１２

第４３卷第５期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．４３Ｎｏ．５

文章编号：１０００－１６３８（２０１２）０５－０５０２－０７

ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立

可诱导的永生化细胞系＊

庞永胜１，２，何　维１，２，王　浩１，２，崔莲仙１，２

（１．中国医学科学院基础医学研究所，北京１００００５；２．北京协和医学院基础学院免疫学系，北京１００００５）摘要：利用电击将外源基因ｈＴＥＲＴ与ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒共转染人"#Ｔ细胞，建立可诱导的永

生化人"#Ｔ细胞系．分离人ＰＢＭＣ，体外刺激增殖后经磁珠分选纯化，然后对其进行外源

ｈＴＥＲＴ基因和ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒的共同电转染，并加入强力霉素诱导目的基因表达．电转染

程序Ｔ－２３和Ｔ－２０的效率分别为３７．５％±０．９８６０％和３０．５％±０．５５９０％．经鉴定，外源

ｈＴＥＲＴ基因能够整合人"#Ｔ细胞基因组中并在诱导后表达．程序Ｔ－２３的转染效率更高，强力

霉素的有效诱导浓度是６００ｎｇ／ｍＬ，志愿者本人的血清更利于电转后细胞的存活．

关键词：ｈＴＥＲＴ基因；人"#Ｔ细胞；永生化；电转染

中图分类号：Ｒ３９２－３３ 文献标志码：Ａ

正常细胞的增殖能力是有限的，经过一定时间的增殖后，最终进入一种生长抑制状态〔１〕．已经有实验证明通过转染人端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ｈＴＥＲＴ）基因进入某些细胞系可以使这些细胞系生命周期延长或者永生化〔２－４〕，并且已经证实这些永生化细胞的核型并没有发生变化〔２〕．甚至使用ｈＴＥＲＴ永生化的细胞进行临床治疗已经证明可行〔５〕．对悬浮细胞使用病毒感染等永生化方法较难成功，而电转染方法虽然存在着电击后细胞死亡较多等缺点，但是其适用范围广，转染效率高的优点使之可以应用于难转染的悬浮细胞〔６－７〕．"#Ｔ细胞作为重要的淋巴细胞，目前仍没有永生化的细胞系，实验中使用的"#Ｔ细胞均由健康志愿者或者活体动物获得，这不仅消耗了较大的人力和物力，而且由于不同个体的"#Ｔ细胞存在个体间差异，往往导致使用不同个体的"#Ｔ细胞所得到的实验结果差异很大．为了更好地研究和应用"#Ｔ细胞，制备永生化的"#Ｔ细胞就显得很有必要．但是考虑到电转染进去的基因很可能会改变"#Ｔ细胞原本的生物学性状，如果能够在需要的时候阻止该基因的表达则可以使之恢复其原本的生物学性状．本研究以人"#Ｔ细胞作为研究对象，试图通过电转染外源性ｈＴＥＲＴ基因和ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒进入人外周血"#Ｔ细胞，进而通过强力霉素的加入与否来控制ｈＴＥＲＴ基因表达来获得可调控的永生化人"#Ｔ细胞系．

１　实验

１．１　质粒、菌株与细胞

质粒ｐＬＰＣ－ｈＴＥＲＴ、ｐＲｅｖＴＲＥ载体和ｐＲｅｖＴｅｔ－Ｏｎ载体均购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５$细胞由本实验室保存；人外周静脉血细胞从健康志愿者获得．

＊收稿日期：２０１１－１２－０８；修回日期：２０１２－０３－２６

基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０４００３９１）

作者简介：庞永胜（１９８２－），男，河南省漯河市人，２００８级硕士研究生．Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｒａ．ｒａｎｇｅ＠１６３．ｃｏｍ．

通信作者：何　维（１９５５－），男，黑龙江人，教授，博士，博士生导师．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｗｅｉ＠ｍｏｈ．ｇｏｖ．ｃｎ．

１．２　电转染相关设备及试剂

德国Ｌｏｎｚａ公司的Ａｍａｘａ　ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒⅠ电转染仪器属于中国医学科学院基础医学研究所医学

分子生物学国家重点实验室．电转染试剂盒Ａｍａｘａ?Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　

Ｋｉｔ购自Ｌｏｎｚａ公司．

１．３　酶、

其他试剂与材料ＨｉｎｄⅢ、ＣｌａⅠ等限制性内切酶购自ＮＥＢ公司；Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ基因组提取试剂盒和ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００、ＤＬ１００００及ＤＬ１５０００均购自ＴａＫａ－

Ｒａ公司；ｐ

ａｎ－ａｎｔｉ"#ＴＣＲ抗体以及ＰＥ标记的"#ＴＣＲ抗体均购自ＢＤ公司；注射用重组人白介素２购自北京瑞得合通药业有限公司；"#Ｔ细胞分选试剂盒购自Ｍｉｌｔｅｎｙ公司；

ＲＰＭＩ－１６４０培养基是Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；新生胎牛血清是Ｈｙ

ｃｌｏｎｅ公司产品；枸橼酸钠（ＡＣＤ）抗凝血液保存液购自北京红十字血液中心；人淋巴细胞分离液是中国医学科学院生物工程医学研究所产品；强力霉素（Ｄｏｘｙｃｙ

ｃ－ｌｉｎｅ）购自罗氏公司；ｍＲＮＡ提取试剂盒购自Ｑｉａｇ

ｅｎ公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均购自威格拉斯生物公司；其他试剂均为国产分析纯．实验中所用引物如表１所示．

表１　ＰＣＲ所用引物

Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　

ＰＣＲ引物名称引物序列引物长度ｈＴＥＲＴ－Ｆ－１　５’－ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴ－３

’２２ｂｐｈＴＥＲＴ－Ｒ－１　５’－ＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＴＡ－３

’３０ｂｐｈＴＥＲＴ－Ｆ－２　５’－ＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡ－３’２３ｂｐ

ｈＴＥＲＴ－Ｒ－２　５

’－ＴＣＣＧＧＣＧＴＣＧＧＴＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴ－３’３７ｂｐ１．４　方法

１．４．１　构建载体ｐＲｅｖＴＲＥ－

ｈＴＥＲＴ首先对载体ｐＬＰＣ－ｈＴＥＲＴ利用ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切后胶回收ｈＴＥＲＴ基因，

同时对空载体ｐＲｅｖＴＲＥ进行ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切，经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接并转化到Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α感受态

细胞，挑选阳性克隆进行双酶切鉴定并测序．

１．４．２　Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞ＰＢＭＣ

从健康志愿者抽取新鲜外周静脉血６０ｍＬ，利用枸橼酸钠（ＡＣＤ）血液保存液抗凝后用６０ｍＬ

ＨＡＮＫｓ缓冲液１∶１稀释；

先将１５ｍＬ淋巴细胞分离液加到５０ｍＬ离心管中，随后用滴管贴壁缓慢将稀释血液按照稀释血液：淋巴细胞分离液＝２∶１的比例加入３０ｍＬ稀释血液，

勿打乱液层界面；１９５０ｒ／ｍｉｎ室温离心１５ｍｉｎ；离心后用吸管小心吸取白膜层到新的离心管；加入３０ｍＬ灭菌ＰＢＳ，

混匀后进行细胞计数，然后１６００ｒ／ｍｉｎ室温离心１０ｍｉｎ；弃上清，再加入１５ｍＬ　

ＰＢＳ，混匀后１３５０ｒ／ｍｉｎ室温离心１０ｍｉｎ；小心完全吸弃上清，留下的ＰＢＭＣ用于接下来磁珠分选"#Ｔ细胞．

１．４．３　人"#Ｔ细胞的扩增

用无血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基将上一步的人ＰＢＭＣ细胞重悬后移入到已包被ｐａｎ－

ａｎｔｉ"#ＴＣＲ抗体的２４孔板中，然后加入等量含２０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基和重组人白介素－２，

在３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内培养１周后用于分选及电转染．

１．４．４　磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞

按照Ｍｉｌｔｅｎｙ公司的人"#Ｔ细胞磁珠分选操作步骤获得人"#Ｔ细胞，

细胞经ＰＥ标记的"#ＴＣＲ抗体染色后进行流式分析．将分选后的人"#Ｔ细胞在３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内培养２

４ｈ．１．４．５　电转染人"#Ｔ细胞及电转染条件的优化

１．４．５．１　电转染人"#Ｔ细胞

根据Ｌｏｎｚａ公司的Ａｍａｘａ?Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　

Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ?Ｋｉｔ的操作说明进行电转染：将电转染溶液和补充溶液按４．５∶１的比例混合，４℃存放，

作为电转染混合溶液，每个反应用该混合液３０５第５期庞永胜等　ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系

１００μＬ．在１２孔板中加入含有１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基２ｍＬ／孔，放入３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内预温至少３０ｍｉｎ．取４×１０６个"#Ｔ细胞用于１个电转染反应；将２．５μｇ去内毒素高浓度（＞１μｇ／μＬ）的质粒ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ和２．５μｇ调控载体ｐＲｅｖＴｅｔ－Ｏｎ分别加到预冷的１００μＬ电转染混合溶液中，同时设立阳性对照组ｐｍａｘＧＦＰ质粒和阴性对照组ｐＲｅｖＴＲＥ载体；具体分组见表２．

表２　电转染实验分组

Ｔａｂｌｅ　２　Ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ

程序阳性对照阴性对照实验组１、２和３

Ｔ２３ｐｍａｘＧＦＰ　ｐＲｅｖＴＲＥ　ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ＋ｐＲｅｖＴｅｔ－ｏｎ

Ｔ２０ｐｍａｘＧＦＰ　ｐＲｅｖＴＲＥ　ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ＋ｐＲｅｖＴｅｔ－ｏｎ

在１５ｍｉｎ内将上述电转染样品分别使用电转染程序Ｔ－２３和Ｔ－２０（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ?ⅠＤｅｖｉｃｅ）进行电转染，电转染后迅速缓慢加入５００μＬ于３７℃孵箱内预热的ＲＰＭＩ－１６４０培养基，小心将电转杯内的细胞轻柔地转移到含有１．５ｍＬ预热ＲＰＭＩ－１６４０培养基的１２孔板中（总体积为２ｍＬ）并且避免反复吹打细胞．然后将１２孔板置于３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内孵育．培养４．５ｈ时在荧光显微镜下观察阳性对照组ＧＦＰ表达情况并用流式细胞仪检测电转染效率；培养２４ｈ后加入强力霉素（Ｄｏｘｙｃｙｃ－ｌｉｎｅ）来诱导ｈＴＥＲＴ基因表达；继续培养４８ｈ后进行鉴定．

１．４．５．２　电转染条件的优化选择

使用流式细胞仪检测ＧＦＰ的表达情况，来比较Ｔ－２３和Ｔ－２０这两种不同电转染程序的转染效率；在电击后对细胞进行培养时，比较分别使用１０％ＦＢＳ与１０％志愿者本人血清所带来的不同培养效果．

１．４．６　强力霉素诱导ｈＴＥＲＴ表达及诱导条件的优化

１．４．６．１　提取人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ鉴定ｈＴＥＲＴ基因

按照ＴａＫａＲａ公司的细胞基因组ＤＮＡ快速提取试剂盒的步骤提取经强力霉素诱导２４ｈ的人"#Ｔ细胞的基因组ＤＮＡ，利用引物ｈＴＥＲＴ－Ｆ－１和ｈＴＥＲＴ－Ｒ－１（表１）进行ＰＣＲ，来鉴定ｈＴＥＲＴ基因是否整合到基因组ＤＮＡ中．

１．４．６．２　提取人"#Ｔ细胞ｍＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ鉴定

ｈＴＥＲＴ基因的表达

按照Ｑｉａｇｅｎ公司的ＲＮｅａｓｙ?Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ的ＲＮｅａｓｙ?

Ｍｉｎｉ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｆｏｕｒｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１０）中的操

作步骤提取经强力霉素诱导２４ｈ的人"#Ｔ细胞的ＲＮＡ；经

ＲＴ－ＰＣＲ证实ｈＴＥＲＴ基因表达．ＰＣＲ所用引物为

ｈＴＥＲＴ－Ｆ－２和ｈＴＥＲＴ－Ｒ－２（表１）．另外使用一对引

物的原因在于：ｈＴＥＲＴ基因ＧＣ含量高，基因片段长，又

要进行较为复杂的操作，所以针对该基因的３’端设计了这

样一对引物．

１．４．６．３　强力霉素诱导表达浓度的优化

在电转染２４ｈ后，分别加入以下不同浓度的强力霉素：０，１００ｎｇ／ｍＬ，２００ｎｇ／ｍＬ，４００ｎｇ／ｍＬ，６００ｎｇ／ｍＬ，８００ｎｇ／ｍＬ，１０００ｎｇ／ｍＬ，继续培养４８ｈ后进行鉴定，根据鉴定结果来判断诱导人"#Ｔ细胞表达ｈＴＥＲＴ的最适合强力霉素浓度，从而优化诱导表达条件．

Ｍ：ＤＬ１００００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；

１，２和３：ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ重组质粒经ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切鉴定

图１　ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ重组质粒的鉴定Ｆｉｇ．１　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴｖｅｃｔｏｒ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ

４

０

５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年

２　结果与讨论

２．１　重组质粒ｐＲｅｖＴＲＥ－

ｈＴＥＲＴ的鉴定双酶切结果表明（图１），目的基因ｈＴＥＲＴ已克隆至ｐＲｅｖＴＲＥ载体中，

基因插入方向正确，测序结果亦证实目的基因序列３３９９ｂｐ，

大小准确无误．２．２　流式细胞术分析磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞的效果

经过７天的刺激扩增，人"#Ｔ细胞的比例提高到５２．３％；

经过磁珠阳性分选纯化获得了纯度为８５％的人"#Ｔ细胞（图２）．

Ａ：分选前人"#Ｔ细胞所占比例；Ｂ：

分选后人"#Ｔ细胞所占比例图２　流式技术分析磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞

Ｆｉｇ．２　Ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｓｏｒｔｅｄ　ｂｙ　

ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ２．３　利用荧光显微镜和流式细胞仪分析人"#Ｔ细胞的电转染效率

电转染的人"#Ｔ细胞使用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０培养基在３７℃，５％ＣＯ２孵箱内培养４

．５ｈ后，在荧光显微镜下观察阳性对照组ＧＦＰ的表达情况（图３）

．

Ａ．ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｉｍａｇｅ；Ｂ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｉｍａｇ

ｅ图３　电转染后培养４．５ｈ时人"#Ｔ细胞阳性对照组中ＧＦＰ的表达情况

Ｆｉｇ．３　ＧＦＰ　ｅｘｐ

ｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　４．５ｈａｆｔｅｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ培养４．５ｈ后收取人"#Ｔ细胞，用ＰＥ标记的抗"#ＴＣＲ抗体进行流式染色，

用流式细胞仪定量分析两种电转染程序的转染效率（图４）．

２．４　电转染人"#Ｔ细胞程序的优化

统计学分析结果表明，在其他电转染条件相同的情况下，人"#Ｔ细胞使用电转染程序Ｔ－

２３时的电转染效率为３７．５％±０．９８６０％，使用电转染程序Ｔ－

２０时的电转染效率为３０．５％±０．５５９０％，两种电转染程序的转染效率存在统计学显著性差异．

２．５　电转染后对人"#Ｔ细胞中ｈＴＥＲＴ基因及其表达情况进行鉴定

在人"#Ｔ细胞电转染ｈＴＥＲＴ基因４８ｈ后，也即经强力霉素诱导表２４ｈ后，

分别提取基因组５０５第５期庞永胜等　ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系

ＤＮＡ进行ＰＣＲ和提取ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ．

如图５所示，经琼脂糖凝胶电泳发现条带分子量大小与预期相同．该鉴定结果表明，在电转染并诱导后的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ和ＲＮＡ中能够检测到ｈＴＥＲＴ基因及其转录产物的存在．

１．ＰＥ－ａｎｔｉ－"#ＴＣＲ抗体；２．程序Ｔ－２３的ＧＦＰ表达水平；３．程序Ｔ－

２０的ＧＦＰ表达水平图４　流式细胞仪定量分析两种电转染程序的转染效率

Ｆｉｇ．４　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｆｆｉｃｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｂｙ　

ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．

鉴定人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ中ｈＴＥＲＴ基因．Ｍ１：ＤＬ１００００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１，２：经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ；３：未经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ；４：ｐ

ＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ作为ＰＣＲ阳性对照．Ｂ．鉴定人"#Ｔ细胞ＲＮＡ中ｈＴＥＲＴ基因转录产物．Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１：

未经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞ＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ；２：ｐ

ＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ作为ＰＣＲ阳性对照；３－９：经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞ｍＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ．

图５　鉴定人"#Ｔ细胞中ｈＴＥＲＴ基因及其表达产物

Ｆｉｇ．５　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈＴＥＲＴａｎｄ　ｉｔｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ

ｔ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ２．６　讨论

原代细胞难以长期培养一直都是原代细胞研究的一个瓶颈．长期以来，研究者一直试图对原代细胞进行永生化．目前对原代细胞进行永生化的方法主要有：１．

肿瘤标本直接培养建系法．采用原代肿瘤细胞体外培养建立永生化的细胞系；２．生物学方法．如通过病毒感染使原代正常细胞永生化．Ｂ淋巴细胞通过被ＥＢＶ病毒感染就可以实现永生化；３．

物理学方法．将外源永生化相关基因直接导入原代正常细胞使之永生．电转染即是一种通过电击造成细胞膜形成空隙而使外源基因进入细胞的方法．因为该方法有着转染效率高、适用范围广的特点，所以本实验小组对于转染难度较大的人"#Ｔ细胞采用电转染方法使之永生化．

本研究使用目前文献报道较多的ＬＯＮＺＡ公司的电转染仪器进行电转染，

将可以抑制端粒缩短的人端粒酶逆转录酶亚单位基因ｈＴＥＲＴ和Ｔｅｔ－

ｏｎ诱导表达系统共同导入人"#Ｔ细胞，经强力霉素６０５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年

诱导后，ｈＴＥＲＴ基因能够表达．本实验目前只在ＤＮＡ和ＲＮＡ两个水平上进行了初步鉴定，并且对电转染后细胞的生长状态只作了初步观察，正常未经转染的人"#Ｔ细胞，经ｐａｎ－

ａｎｔｉ"#ＴＣＲ的抗体体外刺激后，能够在体外连续培养至２８天，

以后便迅速凋亡，无细胞克隆团存在．在本实验中，经电转染的人"#Ｔ细胞在体外可以连续培养至第５６天，

并且在大量凋亡细胞附近有明显的细胞克隆团存在，说明这些细胞的生长状态可能发生了一定的变化．本实验对蛋白水平转录产物的鉴定还未完成，对转染后细胞的核型及生长曲线等生理指标尚未进行鉴定，并且在去除强力霉素的诱导后该基因是否停止表达还有待进一步鉴定．

通过使用文献报道的两个不同的电转染程序、设置不同的强力霉素诱导浓度、选择电转染后细胞

培养所用血清类型及浓度大小，

本实验小组认为对人"#Ｔ细胞进行电转染的优化条件是：优先使用Ｔ－２３电转染程序，利用浓度为６００ｎｇ

／ｍＬ的强力霉素诱导表达和使用１０％的志愿者本人的血清进行培养．在电转染刚刚结束时使用志愿者本人的血清来培养细胞，更利于经受电击创伤的细胞存活下

来，细胞的死亡率更低，生长状态更好．这与文献中报道的相似〔８〕．

本研究中使用的Ｔｅｔ－

ｏｎ诱导表达系统为以后人"#Ｔ细胞的临床应用打下了基础；此外，本研究为原代淋巴细胞的电转染研究提供了一定借鉴．

３　结论

用电转染方法可以将外源ｈＴＥＲＴ基因转染入人"#Ｔ细胞，电转染程序Ｔ－２３比Ｔ－

２０的转染效率更高；经鉴定，转入的基因能够整合到人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ中，并且在６００ｎｇ

／ｍＬ强力霉素的诱导下可以有效表达．在培养电转染后的人"#Ｔ细胞时，使用１０％志愿者本人的血清比使用１０％胎牛血清更有利于电击后细胞的存活．本实验为以后使用电转染方法建立人"#Ｔ细胞永生化细胞系奠定了基础．

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１１５．（责任编委　李光鹏）

７０５第５期庞永胜等　ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ　Ｈｕｍａｎ"#Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　

ｗｉｔｈｈＴＥＲＴＧｅｎｅｓ　ｂｙ　

ＥｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＰＡＮＧ　Ｙｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ

，ＨＥ　Ｗｅｉ，ＷＡＮＧ　Ｈａｏ，ＣＵＩ　Ｌｉａｎ－ｘｉａｎ（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　

ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００００５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　

Ｉｍ　ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１

００００５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ　ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｐ

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Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ． Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｈＴＥＲＴｇｅｎｅ；ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌ；ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ；ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ８０５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

基因工程和细胞工程

第一讲基因工程和细胞工程 1．(2014·广东卷，25)(双选)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是( ) A．过程①需使用逆转录酶 B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因 C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备 D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞 解析：过程①是以mRNA为模板合成DNA的过程，即逆转录过程，需要逆转录酶的催化，A正确；过程②表示利用PCR扩增目的基因，在PCR过程中，不需要解旋酶，是通过控制温度来达到解旋的目的，B错误；利用氯化钙处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。C错误；检测目的基因是否成功导入受体细胞的染色体DNA中，可以采用DNA分子杂交技术，D正确。 答案：AD 2．(2014·浙江卷，3)下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型 B．某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞 C．由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆 D．未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状 解析：连续细胞系的细胞其核型已发生改变；一个祖细胞培养形成的细胞群才为一个克隆；未经克隆化培养的细胞系细胞可能是不同细胞分裂形成的，其性状可能不同。 答案：B

3．(2014·重庆卷，4)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( ) A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与 B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 解析：构建载体需要限制酶和DNA连接酶，A错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到④的染色体上，B错误；染色体上含有目的基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，C错误；植株表现出抗虫性状，说明含有目的基因，属于基因重组，为可遗传变异，D正确。 答案：D 4．(2014·江苏卷，23改编)下列关于基因工程技术的叙述，正确的是( ) A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列 B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因 D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达 解析：限制性核酸内切酶大多是特异性识别6个核苷酸序列，但也有识别序列由4、5或8个核苷酸组成的，A错误；PCR中耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用，B 项错误；载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，不是抗生素合成基因，C错误；目的基因导入了受体细胞不一定就都能正常表达，D正确。 答案：D 5．(2014·广东卷，29)铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一，应用组

高考生物大二轮复习 专题突破练18 基因工程和细胞工程(含解析)

专题突破练18 基因工程和细胞工程 1.胰岛素是人体内唯一一种能降低血糖的激素,对于糖尿病的治疗具有重要的意义,胰岛素基因在人体细胞内经转录、翻译形成的胰岛素原需要经过内质网、高尔基体的加工才能形成胰岛素。如图是运用基因工程技术制备胰岛素的部分流程图,据图回答下列有关问题。 (1)①过程表示从(填“胰岛A细胞”“胰岛B细胞”或“胰岛A细胞和胰岛B细胞”)中获取胰岛素基因相应mRNA,原因 是。 (2)②过程需要的酶是,得到的胰岛素基因可以通过 (填技术的中文名称)进行扩增,该技术除可以将目的基因大量扩增外,还可以用于从DNA分子上获取目的基因,至少需要循环次,才能得到目的基因。 (3)③过程需要用到的酶是,A除含有胰岛素基因外,还应 有,以便进行目的基因的鉴定与选择。 (4)④过程需用处理大肠杆菌,使其成为,以便从周围环境中吸收DNA分子。为了检测胰岛素基因是否在受体大肠杆菌中成功表达,可采用 技术。 (5)通过图示过程得到的是(填“胰岛素”或“胰岛素原”),原因 是 。 2.研究人员将乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)基因转入番茄幼叶细胞中,获得能产生乙肝疫苗的番茄植株。回答下列问题。 (1)利用PCR技术扩增HBsAg基因时,目的基因DNA受热变性后的单链与引物互补序列结合,在 酶的作用下进行延伸。设计的引物含有ClaⅠ酶切位点和SacⅠ酶切位点,用作载体的DNA分子(填“含有”或“不含有”)ClaⅠ酶切位点和SacⅠ酶切位点,理由 是。

(2)将HBsAg基因导入番茄幼叶细胞最常用的方法是,该方法可以使目的基因插入到细胞中的DNA上。 (3)可利用植物组织培养技术获得转基因番茄植株,该技术利用的原理 是。 (4)通过电镜对番茄果实提取物进行观察,发现了HBsAg颗粒,说明目的基因导入受体细胞 后。用获得的转基因番茄果实饲喂小鼠,如果在小鼠血清中检测到,说明转基因植物疫苗可口服。3.利用雄性不育系生产杂种一代较为经济、有效,该方法在水稻、玉米、油菜等作物中应用广泛。芥菜是我国著名的蔬菜之一,育种工作者运用基因工程将烟草TA29花药绒毡层特异启动子驱动下的核糖核酸酶Barnase基因导入芥菜细胞中,获得彻底败育的雄性不育植株。请回答下列问题。(1)基因工程中获取Barnase基因的方法有、利用PCR技术扩增和人工合成。利用PCR扩增目的基因时,一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、 和三步。 (2)将获取的Barnase基因转入芥菜细胞的常用方法为,Barnase基因需插入到Ti质粒的上,该重组质粒还必须含有,用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。 (3)检测Barnase基因在转基因芥菜植株中是否转录出mRNA的方法 是,请简要写出该方法的实验思 路: 。 4.转基因抗虫棉的培育过程如图所示。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因(阴影表示)与质粒上有 PstⅠ、SmaⅠ、Eco RⅠ、ApaⅠ等限制酶的切割位点(箭头所示),质粒上还有唯一标记基因——抗卡那霉素基因(阴影表示)。有人通过实验,获得的农杆菌细胞有的未被转化,有的被转化。被转化的农杆菌细胞有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的农杆菌。请据此回答下列问题。 (1)构建含抗虫基因的重组质粒A时,应选用的限制酶是,对进行切割。

细胞转染经验

转染注意因素 有血清时的转染 血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液：在DNA-阳离子脂质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。但在复合物形成后，在加入细胞中前可以加入血清。阳离子脂质体和DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用 OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。 培养基中的抗生素 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。 细胞维护和培养的演变 可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。不要使细胞保持融合超过24小时。 大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率（图13）。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系的细胞系现在有售。 细胞铺板密度 用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2×106-4×106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺板密度最高的，CAT活性也最高（图14）。得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE试剂的量也相应增加了。这些结果说明，对于转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而异。

基因工程和细胞工程

基因工程和细胞工程 一、单选题 1．如图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步骤需要用到的工具是 A. DNA连接酶和解旋酶 B. DNA聚合酶和限制酶 C. 限制酶和DNA连接酶 D. DNA聚合酶和RNA聚合酶 【答案】C 【解析】图示表示基因表达载体的构建过程，该过程首先需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒，其次还需要用DNA连接酶将目的基因和质粒连接形成重组质粒，故选C。 2．下面关于植物细胞工程的叙述,正确的是（） A．叶肉细胞已经高度分化,无法表现出全能性 B．叶肉细胞经再分化过程可形成愈伤组织 C．融合植物叶肉细胞时,应先去掉细胞膜 D．叶肉细胞离体培养时,可以表现出全能性 【答案】D 【解析】 试题分析：叶肉细胞已经高度分化，但在体外培养的条件下也能表现出全能性，A错误；叶肉细胞经脱分化过程可形成愈伤组织，B错误；融合植物叶肉细胞时，应先去掉细胞壁，C错误；叶肉细胞离体培养时，可以表现出全能性，形成完整植株，D正确 考点：本题考查植物组织培养的相关知识，要求考生识记植物组织培养的原理、过程、条件等基础知识，掌握植物细胞具有全能性的原因，能结合所学的知识准确判断各选项。 3．如图为白菜一甘蓝杂种植株的培育过程。下列说法正确的是（） A．图示白菜一甘蓝植株不能结籽 B．愈伤组织的代谢类型是自养需氧型 C．上述过程中包含着有丝分裂、细胞分化和减数分裂

D．白菜一甘蓝杂种植株具有的性状是基因选择性表达的结果 【答案】D 【解析】白菜和甘蓝都是二倍体，它们的体细胞杂交后培育的“白菜-甘蓝”杂种植株中2个染色体组来自白菜，2个染色体组来自甘蓝，因为“白菜-甘蓝”属于异源四倍体，是可育的，能产籽，故A错误；愈伤组织是一种高度液泡化的呈无定型状态的薄壁细胞，不能进行光合作用产生有机物，因此愈伤组织的代谢类型是异养需氧型，故B错误；上述过程包括去壁、原生质体融合、植物组织培养等过程，其结果是形成“白菜-甘蓝”幼苗，并未发育到性成熟个体，因此整个过程中有有丝分裂和细胞分化，没有减数分裂过程，故C错误；任何性状都是基因选择性表达的结果，故D正确． 【考点定位】植物体细胞杂交的应用 【名师点睛】据图分析，植物细胞壁的成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法．物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成“白菜一甘蓝”幼苗． 4．下列有关细胞工程的叙述中正确的一项是（） A．克隆不是无性繁殖 B．用体细胞克隆动物是通过核移植实现的 C．灭活病毒通过溶解磷脂双分子层诱导动物细胞融合 D．动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基成分一样 【答案】B 【解析】 试题分析：克隆属于无性繁殖，故A错误。用体细胞克隆动物必须通过核移植才能实现，故B正确。灭活病毒诱导动物细胞融合不是溶解磷脂双分子层而是通过改变膜脂分子排列实现的，故C错误。动物细胞培养液通常需要加入血清，植物组织培养通常需要加入植物激素，故D错误。 考点：本题考查细胞工程相关知识，意在考察考生对知识点的识记理解掌握程度。5．以下哪种物质不可以用于植物细胞的诱导融合剂（） A．PEG B．灭活的病毒 C．离心 D．振动电激 【答案】B 【解析】 试题分析：灭活的病毒是动物细胞工程的诱导剂，不能用于植物细胞工程，故选B。 考点：本题考查植物细胞工程等相关知识，意在考察考生对知识点的识记理解掌握程度。6．下列有关植物细胞工程的叙述，正确的是（） A．在植物组织培养过程中，细胞的遗传物质一般都发生改变 B．植物细胞只要在离体状态下即可表现出全能性 C．植物组织培养过程中始终要保持适宜的光照 D．植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl 的培养基培养筛选而获得 【答案】D 【解析】 试题分析：在植物组织培养过程中，细胞的遗传物质一般不发生改变，A错误；植物细胞的全能性指离体的组织器官的经过培养，发育成完整个体的潜能，B错误；植物组织培养过程中开始是要避光，C错误；植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl 的培养基培养筛选而获得，D正确；答案是D。 考点：本题考查植物细胞工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。 7．植物组织培养的过程可以归纳为：①? ?再分化③→④；对此叙述有错误的 ?→ ?→ ?脱分化②? 是( ) A．②→③的再分化过程中，培养基中需要添加细胞分裂素与生长素

2018年高考生物二轮复习专题突破训练15基因工程与细胞工程有答案

专题突破练15 基因工程与细胞工程 1.(2017东北三省三校一联,38)马铃薯是重要的经济作物,人类在(马铃薯的)基因育种方面取得丰硕成果。 (1)马铃薯是双子叶植物,常用法将目的基因导入马铃薯体细胞中。构建好的基因表达载体包括目的基因、、、、复制原点五部分。 (2)马铃薯得病会导致产量下降。基因工程中常用的抗病基因为(写一种即可)。 (3)科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯,主要从两个方面进行设计: ①修饰除草剂作用的靶蛋白,使其对除草剂,或使靶蛋白过量表达,植物吸收除草剂后仍能正常代谢。 ②引入酶或酶系统,在除草剂发生作用前。 (4)将目的基因导入受体细胞后,还需对转基因植物进行。 答案 (1)土壤农杆菌转化启动子终止子标记基因(2)病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因、几丁质酶基因和抗毒素合成基因(3)①不敏感②被分解(4)目的基因的检测与鉴定 解析 (1)将目的基因导入植物细胞的常用方法是土壤农杆菌转化法。构建好的基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等。(2)基因工程中常用的抗病基因有病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因、几丁质酶基因和抗毒素合成基因(写一种即可)。(3)①为了避免马铃薯对除草剂敏感,可以修饰除草剂作用的靶蛋白;或者增加马铃薯中靶蛋白的表达量,这样植物吸收除草剂后仍能正常代谢。②还可以通过基因工程引入能够快速分解除草剂的酶或酶系统,从而将除草剂在发生作用前分解。(4)将目的基因导入受体细胞后,需检测目的基因是否导入受体细胞。即使目的基因导入了受体细胞,也不一定能够表达,故一定要在受体生物中检测出目的基因的产物——相关蛋白质,即要进行目的基因的鉴定。 2.(2017湖北武汉一模,38)基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。“基因敲除细胞”的构建过程如下: 第一步,从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞(ES),在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”; 第二步,构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因(同源臂),在同源臂上接入neo R(新霉素抵抗基因)等。由于同源臂与靶基因的DNA正好配对,所以能像“准星”一样,将表达载体准确地带到靶基因的位置; 第三步,将表达载体导入胚胎干细胞,并与其内靶基因同源重组,完成胚胎干细胞的基因改造; 第四步,基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选。基本原理如图所示。 请根据上述资料,回答下列问题。 (1)实施基因工程的核心步骤是,基因表达载体中的是位于基因首端的有特殊结构的DNA片段;在构建的过程中所需要的工具酶是。 (2)如果要获得一只含目的基因的小鼠,则选择的受体细胞通常是,原因是。 (3)上述资料中neo R基因的作用最可能是。为了鉴定目的基因是否成功表达,

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

基因工程和细胞工程测试题(附答案,可用于考试)

5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 （时间：90分钟分数：100分） 一．选择题（本大题包括25题，每题2分，共50分。每题只有一个选项符合题意。） 1．以下说法正确的是（） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B．质粒是基因工程中惟一的运载体 C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不．相符的是（） A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B．植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C．植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3．有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4．能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是（） A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养人的B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6．PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7．以下对DNA的描述，错误的是（） A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（） A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9．细胞工程的发展所依赖的理论基础是（） A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10．下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是：（） A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11．在以下4种细胞工程技术中，培育出的新个体中，体内遗传物质均来自一个亲本的是（） A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12．动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是（） A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13．下列哪一项属于克隆（） A．将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B．将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C．将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞

细胞转染的详细过程

细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

基因工程和细胞工程

专题八现代生物科技专题 第一讲基因工程和细胞工程 1.(2012·浙江卷，1)用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是() A．都需要用CO2培养箱 B．都需要用液体培养基 C．都要在无菌条件下进行 D．都可体现细胞的全能性 2．下列关于运用植物组织培养技术产生新个体的叙述，错误的是() A．属于无性生殖 B．主要理论依据是植物细胞具有全能性 C．培养过程中由于人工培养基含大量营养，不需光照就能发育成完整植株 D．人工培养基中含植物生长发育所需的全部营养物质，包括矿质元素、糖、维生素等3．(2012·安徽卷，4)2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是() A．追踪目的基因在细胞内的复制过程 B．追踪目的基因插入到染色体上的位置 C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构 4．限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶Bam HⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和BglⅡ的识别序列和切割位点： 切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是() A．Bam HⅠ和EcoRⅠ B．Bam HⅠ和HindⅢ C．Bam HⅠ和BglⅡ D．EcoRⅠ和HindⅢ 5．对于不同的生物，将重组基因导入受体细胞的方法有差异，下列方法不合适的是 () A．以质粒为运载体，利用大肠杆菌生产人的胰岛素时，可用氯化钙处理大肠杆菌B．以噬菌体为运载体，利用大肠杆菌生产人的凝血因子时，可使其直接侵染大肠杆菌C．以质粒为运载体，利用转基因羊生产人的乳铁蛋白时，可用显微注射技术将重组基因导入受精卵

2019高考生物大二轮复习专题十六基因工程和细胞工程练案

专题十六基因工程和细胞工程 ．(·深圳调研)叶绿体转基因技术是将外源基因整合到叶绿体基因组中，该技术能有效改良 植物的品质。请回答：转基因技术的核心步骤是 基因表达载体的构建 () 限制酶和连接 ，完成该步骤所需要的酶有 酶 。 将植物体细胞处理得到原生质体，再通过 () 农杆菌转化法 基因枪 或 法，将目的基因导入原生 植物组织培养 质体，使原生质体再生出细胞壁之后，通过 技术培养可得到相应的转基因幼苗。()来自原核生物中有重要价值的外源基因，无需改造和修饰就可在叶绿体中高效表达，就此 分析，原因是 叶绿体与原核生物结构类似 由 ( 于叶绿体大多数基因的结构、转录与翻译系统均与原 ) 核生物类似 。()对大多数高等植物而言，与传统的细胞核转基因相比，叶绿体转基因更稳定，其遗传方式 “ 或 不遵循 ” “ 不遵循 答 ”) 遵循 ( 卵细胞 ”) 传给后代，从 分离定律，不会随 或 “ 花粉 花粉 (“ ” (“ 母本 而保持了 父本 ” ”) 的遗传特性。 母本 “ 或 [解析] ()基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，所需要的酶有限制酶和连接酶；() 植物细胞导入受体细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。原生质体再生细胞壁之后，通过植物组织培养获取幼苗；()叶绿体与原核生物结构类似。()分离定律适用于有性生殖 过程中细胞核遗传，故叶绿体转基因不遵循分离定律，为母系遗传。．(·天津市和平区生物一模)已知某传染性疾病的病原体为病毒，该病毒表面的蛋白为主要 抗原。疫苗的生产和抗体的制备流程如图所示。请回答下列问题： ① 过程 代表的是 () ③ 逆转录 构建基因重组载体时，启动子和终止子是重新构建的，它 ，过程 聚合酶 们应该能被受体细胞的 所识别，以便于其催化转录过程。()如图为基因的结构示意图，已知Ⅱ区的碱基数是个，其中阴影区域碱基数是个，空白区域中和的总数共有个，则由该区域能指导蛋白质合成的片段转录产生的中和总数是个。() 在给小鼠皮下注射蛋白时，要重复注射几次的目的是通过二次免疫，增加小鼠体内的 浆细 胞 数目。() 在将进行扩大培养前，至少需要经过次筛选，第一次是将 杂交瘤细胞 筛选出来，第二次是 将 能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 筛选出来。() 对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的 蛋白 来制备疫苗。对该传 染病疑似患者确诊时，可以从疑似患者体内分离出病毒与已知病毒进行核酸序列比较，或用图中

高中生物专题复习：基因工程和细胞工程

基因工程和细胞工程 1．为增加油菜种子的含油量,科研人员将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连,导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。 (1)研究人员采用PCR技术获取酶D基因和转运肽基因,该技术是利用________的原理,使相应基因呈指数增加。所含三种限制酶(XbaⅠ、ClaⅠ、SacⅠ)的切点如图所示,则用________和________处理两个基因后,可得到酶D基因和转运肽基因的融合基因。 (2)将上述融合基因插入上图所示Ti质粒的________中,构建基因表达载体并导入农杆菌中。为了获得含融合基因的单菌落,应进行的操作是______________________________。 随后再利用液体培养基将该单菌落菌株振荡培养,可以得到用于转化的侵染液。 (3)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间的目的是_____________________________, 进一步筛选后获得转基因油菜细胞,提取上述转基因油菜的mRNA,在逆转录酶的作用下获得cDNA,再依据________的DNA片段设计引物进行扩增,对扩增结果进行检测,可判断融合基因是否完成________。最后采用抗原—抗体杂交法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达。 答案：(1)DNA双链复制ClaⅠDNA连接酶 (2)T-DNA将获得的农杆菌接种在含四环素的固体培养基上培养 (3)利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞融合基因转录 2．人外周血单核细胞能合成白细胞介素2(IL?2)。该蛋白可增强机体免疫功能,但在体内易被降解。研究人员将IL?2基因与人血清白蛋白(HSA)基因拼接成一个融合基因,在酵母菌中表达出具有IL?2生理功能且不易降解的IL?2?HSA融合蛋白,技术流程如图。请回答： (1)图中③过程的模板是________,表达载体1中的位点________应为限制酶BglⅡ的识别位点,才能成功构建表达载体2。 (2)表达载体2导入酵母菌后,融合基因转录出的mRNA中,与IL?2蛋白对应的碱基序列不能含有

病毒转染原理及步骤

病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

基因工程与细胞工程

基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶DNA聚合酶 不同点连接的DNA 双链单链 模板不要模板要模板 连接的对象2个DNA片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键 化学本质蛋白质 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 （2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数(2n)形式扩增 第二步：基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。

脂质体转染实验原理与操作步骤总

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：