各种孔板细胞接种量

各种孔板细胞接种量

总结下各种孔板细胞接种量仅供参考^6

l: B2 V6 k1 z5 q' i

细胞培养瓶（板）接种量生长面积容量细胞数（大约）0 D- U% i( q/ S

96孔板4~5×10 4 35mm培养皿1×10 6 ' n' C4 v7 z- N' n) w

48 孔板 1.3×10 5 60mm培养皿 2.6×10 6

24孔板 2.5×10 5 100mm培养皿7×10 6

12孔板5×10 5 150mm培养皿 1.8×10 7

6孔板 1.2×10 6

{" s; ?$ q8 l# |1 l

细胞瓶面积容量工作体积细胞数目6 @3 K* u- @( O0 O, n

12.5cm2 25ml 2ml 5×10 5

25cm2 50ml 5ml 1×10 68 V& E- \! {6 l' F8 }1 r* e

35cm2 75ml 10ml 2×10 6, ^. J7 _1 ^8 v1 e- k& `6 e0 ]' O8 Y

75 cm2 250ml 15ml 4×10 68 o9 _8 ×7 O2 Q% g/ A- r

150cm2 700ml 40ml 1.1×107

补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。

注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。

MDCK细胞培养技术

孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml, 12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml, 24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml, 96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml, 24孔板底面积2cm2,一般加培养液的量1ml,在接种病毒的时候一般病毒用量为添加培养液的5%-20%。在做咽拭子标本时应视标本的采集质量而定，如果标本采集质量高可以少加一些，如0.2ml-0.5ml,如果标本采集的不够好，则应相对加大标本接种量，可以加到1ml. 附件1： 三、MDCK细胞培养技术 （一）生物安全级别和生物安全规定 1. MDCK细胞培养实验室生物安全级别：正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。 2. MDCK细胞培养实验室生物安全规定：遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。 （二）MDCK细胞的传代培养步骤

1. 细胞培养所需的材料（部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择）： （1）生长成片的MDCK细胞； （2）T-75细胞培养瓶,颈口有倾角； （3）D-MEM培养液； （4）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G；10,000μg/mL硫酸链霉素)，分装后保存于-20℃； （5）HEPES缓冲液，1M母液； （6）胎牛血清； （7）EDTA-胰酶(0.05％胰酶；0.53mMEDTA·4Na)（Gibco CatNo. 25300-062），分装后保存于-20℃； （8）牛血清白蛋白组分V，7.5％溶液（GIBCO CatNo. 15260）； （9）1mL和10mL无菌移液管等； （10）70％～75％的酒精。 建议：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。 2. 培养基和试剂的准备: （1）500mL的D-MEM液中加入 a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素)； b) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)； c) 7.5％牛血清白蛋白组分V12.5mL。 d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)

细胞培养板的选择和使用

细胞培养板的选择和使用（四） 点击次数：1678 作者：clearair00 发表于：2008-07-23 10:32转载请注明来自丁香园 来源：丁香园 （一）培养板的清洗和消毒 培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。 问：只有紫外照射可以保证无菌吗?可不可以从清洗方面做点工作? 答：看你什么用途了，一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。 我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯<２０ｃｍ）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。 其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省了，留点钱还不如买点好试剂呢：） 我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯<3０ｃｍ）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过；2、到放射科照Co60，照完了尽快用。 我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板

子，也不是很贵。 我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干，用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。 永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。 紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？ 板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作台里（打开盖子）用紫外线照射半小时以上，最好一小时或两小时，盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分钟，不要时间太长，这样板子容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子！旧板子做，结果不准！ 泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸馏水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用纯的无水乙醇），用前在紫外线下照射1h。基本可保证95％以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。 1.钴60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌。 2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。 (二)方法讨论

贴壁细胞培养实验讲义

贴壁细胞培养技术课讲义 一、克隆形成及克隆形成抑制试验 克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。 常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。 平板克隆形成实验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 1.准备所需试剂及物品： ①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组） ②PBS ③0.25%胰酶 ④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司）， 100 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），（EP管分装，1ml/管x 8）使用前稀释至所需浓度。 ⑤甲醇：冰醋酸（3:1） ⑥细胞染色液（吉姆萨、甲基绿、刘氏染液选一即可） ⑦12孔板（或6孔板）⑧EP管⑨滴管、小瓶等⑩相机、反光板等 ⑧实验需用的细胞株胃腺癌细胞MGC7901 2.操作： 实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。 第一天： ?制备细胞悬液：取对数生长期胃腺癌细胞MGC7901，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，用含15%血清的RPMI-1640稀释，使细胞密度为3×102cell/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。 具体操作如下： ①胰酶消化：将培养瓶中原培养液从上面轻轻吸取弃之（可用滴管），加消化液1ml使之均匀分布作用于瓶内贴壁生长的细胞，细胞变形呈圆形颗粒附着于瓶底（镜下可见）即可弃消化液（可用滴管）（一般数十秒甚至几分钟）。

各种孔板细胞接种量

各种孔板细胞接种量 总结下各种孔板细胞接种量仅供参考^6 l: B2 V6 k1 z5 q' i 细胞培养瓶（板）接种量生长面积容量细胞数（大约）0 D- U% i( q/ S 96孔板4~5×10 4 35mm培养皿1×10 6 ' n' C4 v7 z- N' n) w 48 孔板 1.3×10 5 60mm培养皿 2.6×10 6 24孔板 2.5×10 5 100mm培养皿7×10 6 12孔板5×10 5 150mm培养皿 1.8×10 7 6孔板 1.2×10 6 {" s; ?$ q8 l# |1 l 细胞瓶面积容量工作体积细胞数目6 @3 K* u- @( O0 O, n 12.5cm2 25ml 2ml 5×10 5 25cm2 50ml 5ml 1×10 68 V& E- \! {6 l' F8 }1 r* e 35cm2 75ml 10ml 2×10 6, ^. J7 _1 ^8 v1 e- k& `6 e0 ]' O8 Y 75 cm2 250ml 15ml 4×10 68 o9 _8 ×7 O2 Q% g/ A- r 150cm2 700ml 40ml 1.1×107 补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。

注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。

板种细胞问题(不均匀)

细胞不均匀的问题 原因： 1.培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，建议多加液体 2.接种后不要摇晃，传统的思想认为摇一摇能使细胞均匀，但是事实上在摇晃的时候由于剪应力等多种因素的影响，细胞反而分布不均。 解决方案： 1)接种到培养瓶的细胞，轻轻地让细胞悬液流遍整个瓶底； 2)接种到培养皿或者培养板的细胞，用枪头对准中央加，让细胞悬液自行流遍整个孔，若有少量区域未能覆盖到细胞悬液，可用枪头轻轻牵引悬液，千万不要摇。细胞悬液铺满后，不宜立刻放入孵箱中，我一般静置>15min，这样接种的细胞很均匀。 3)培养皿划“十”字交叉轻轻混匀（力度不易太大，否则剪切力损伤细胞），重复一次。轻轻放入孵箱即可。 （1）平底和圆底（U型和V型）培养板的区别和选择： 贴壁细胞一般用平底培养板。悬浮型细胞的培养一般用V型。 U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞。V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。 （2）细胞培养常见问题与解答 问：我看到培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格，但不知道到底什么实验用哪种规格。 答：要根据你具体的实验要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，细胞爬片一般用24孔等，要具体根据你实验来定。

问：我想测吸光度用酶标仪，用多孔细胞培养板行吗？请问酶标板多孔细胞培养板有什么区别？ 答：用多孔细胞培养板测吸光度肯定可以拉，我们经常用它来做样品的蛋白定量和MTT检测。 区别：酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，但也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不能用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。 （3）细胞培养板的密闭和污染问题 问：96，24孔培养板或培养皿的盖子都很松，这样是方便了透气，但是细菌、霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢？ 答：1.盖子很松，属于半开放培养，这样的目的是透气（实际上是为了使培养皿外的co2能够与培养皿充分交换，维持培养基的pH值）。 2.凡事有利必有弊，这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发，这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的 a培养箱内空气必须清洁（定期紫外线照，酒精擦洗，尽量少开关培养箱） b培养箱内的湿度必须始终保持为100%（培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽）。就好像培养皿，也是一个盖倒扣的容器，也不会污染。主要是因为盖子“L”型边缘产生气流负压的缘故，灰尘上面才附着有微生物，而气流携带的灰尘是无法通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散，不会产生气流，所以只会透气不会透菌。 问：我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作（在超净台内），而其它孔中还有细胞要培养.我很担心这样会污染，不知道要注意什么?

96孔板的选择指南

96孔板的选择指南： 96孔聚苯乙烯微孔板 Item No. 孔型底颜色结合 力灭菌/盖子X个/包X包/箱 650101 U型底* 硬底透 明——/— 5 20 650161 U型底硬底透 明—+/— 2 50 651101 V 型底* 硬底透 明——/— 5 20 651161 V 型底硬底透 明—+/— 2 50 655101 平底* 硬底透 明——/— 5 20 655161 平底硬底透 明—+/— 2 50 655074 平底/独立柱状* 硬底白* LUMITRAC TM600高结合力+/— 5 8 655075 平底/独立柱状硬底白LUMITRAC TM200中结合力* —/— 5 8 655076 平底/独立柱状硬底黑* FLUOTRAC TM200中结合力—/— 5 8 655077 平底/独立柱状硬底黑FLUOTRAC TM600高结合力* +/— 5 8 655094 平底/独立柱状μClear?(软）*白高结合 力+/—10 4 655095 平底/独立柱状μClear?(软）白中结合 力—/—10 4 655096 平底/独立柱状μClear?(软）黑中结合 力—/—10 4 655097 平底/独立柱状μClear?(软）黑高结合 力+/—10 4 *U型底微孔底为圆形，适用于进行凝聚实验；无死角，适用于移取液体； 直径：6.94mm,孔高：10.3mm, 板高：14.2mm 总体积：323 μl ; 工作体积：40-280μl *V 型底微孔底部为V型，适用于精准取样；适用于存储微量样品。 直径：6.18mm,孔高：10.8mm, 板高：14.1mm 总体积：324 μl ; 工作体积：40-200μl *平底底部是水平的，光透底部不会发生偏折，适用于精密光学实验（底部读取信号）； 口直径：6.96mm,底直径：6.39mm;孔高：10.9mm, 板高：14.6mm 总体积：382 μl ; 工作体积：25-340μl ;底面积：32mm2. *平底/独立柱状孔与孔之间距离大些，独立分开，能最大程度地减少交叉污染； 口直径：6.96mm,底直径：6.58mm;孔高：10.9mm, 板高：14.4mm

细胞培养心得

1、寄运细胞或者接收细胞，都要做好充足的准备; 如果是让其它实验室寄运细胞，或者寄给别人细胞，细胞应该如何处理是主要考虑的问题。假设细胞在途中要经过48小时，那么可以待细胞长到50%的密度时处理细胞，即将细胞培养瓶内加满培养液，拧紧瓶盖，用封口膜封紧瓶口；然后将培养瓶放进泡沫盒，用纸或泡沫将盒内空间填满，使培养瓶不能随意移动。同时将泡沫盒钻上几个孔，使空气可以流通。 因此要确定准备好以下物品：透气的细胞培养瓶；封口膜；足量的培养液；放细胞培养瓶的泡沫盒及填充物； 除了细胞的处理，还要注意以下几点：1）提前跟快递公司人员联系，要上门取货（大多快递公司都可以，顺丰确实算是好些；近来觉得韵达速度也很快）2）时间安排（细胞处理尽量安排在下午，因为快递公司一般来说都是晚上统一发货，要是早晨处理细胞交给快递公司，细胞还没上路呢，就已经在培养箱外待了一天）； 接收细胞就容易多了，提前准备好细胞培养用耗材及培养用液就可以了，紫外灯先打开，收到细胞将培养瓶中大部分培养液吸掉，留下4-5ML培养液（针对25cm2的培养瓶）；培养一天后，观察细胞状态，确实是传代还是换液。 总而言之，运送细胞讲究两点：1离开了培养箱要防止被污染2尽量缩短细胞不在培养箱的时间，不然时间过久细胞长满脱落就没得救了。 2 要讲的是MTT试验，这个纯粹讲个人经验，因为我本身的考虑可能就是错的，所以非常欢迎提出疑问以及批评指正。 1）细胞的铺板：以96孔板为例，做细胞实验的同学看文献可能注意到，有较多的文献中提到细胞接种数量是5000个/孔；最初我也是按照这个数量来铺板的，实际上这个接种数量偏高；假设给药时间是48小时，发现空白对照孔中会有细胞无法贴壁，因为太满了，被挤出来了。如此，则会因为接种密度原因，而不能准确反映细胞的正常生长情况及给药组作用情况。即使是给药时间为24小时，仍然会出现类似情况。 因此，我后期实验中接种细胞数量为3000-4000，如果是药物作用48小时，最好是3000cells/每孔，空白对照孔细胞在加MTT前也就刚好长满，后来才发现别人也很多按照这个数量接种的，只是提醒需要注意，不要盲目的按照5000这个密度，还有的是10000，基本上不靠谱。 很明显，接种细胞数量太少也不好，太少的话SD值会很大。 还有的人根本就不计数，经验主义，一个25cm2培养瓶细胞长满铺一个板；经验当然是有用的，但在这里就明显不合理了，刚才提到MTT实验对细胞的数量要求相对较精确；另外，如果你是铺几个板，都这样做，本来每个培养瓶细胞数差异就不小，因为你传代时做不到等量，就这样直接铺到板上，不同板之间又有各组药物的对照实验，那么得出的OD值还可以比较吗？所以计数是必要的。 2）给药：对于水溶性药物就不讲了，只讲难溶于水，而且虽然溶于DMSO，但向DMSO加水后也会析出的药物；有人是这样做的，在EP管中用DMSO溶解药物作为母液，然后用细胞培养液将母液梯度稀释成各个浓度，药物有析出，成结晶了，可能都沉了，严重不均一了，这浓度就没法衡量了； 这样做的人，也想过不合理之处，但又没有查到好的办法，所以将就着做了，其实差多了，有效的药物也做成无效的了。 还有一个错误容易犯，DMSO母液用培养液稀释10倍后是不可以作用于细胞的，因为这样DMSO占的比例是10%，本身毒性就很大；我曾经单独测过DMSO对细胞的毒性，1%确实基本无影响，但5%以上则是影响特别大。现在做个假设，用DMSO稀释母液，而非

细胞培养实验室操作准则2014.10版

细胞培养实验室操作准则 任何首次准备开展细胞实验的人员必须首先认真阅读以下准则，然后在已经熟练掌握细胞培养操作技术人员的指导下开始进行细胞实验，并在以后的实验过 程中严格遵守各项准则。 一、细胞实验准备 1.进入细胞房前要换鞋，穿无菌服（干净实验工作服），戴手套，接触细胞前喷75%酒精消毒手套。 2.将所需实验用品：培养基（完全培养基、空白培养基）、胰酶（含ETTA）、枪头（1ml、200ul、10ul)、离心管，预先放置到超净工作台，打开紫外照射30min 后开始细胞实验。 3.观察细胞前，用75%酒精纱布擦拭显微镜镜头及台面，进行消毒后方可开始观察细胞。 4.观察细胞主要包括：细胞数量（汇合度）、形态、分布情况（是否均匀）、有无漂浮的死细胞和污染等，观察完及时放回培养箱。（如图，汇合度约90%，分布均匀） 5.每次开始细胞实验前，需关闭紫外照射，打开超净台风机及灯。用含75%酒精的纱布擦拭超净工作台。超净台内物品放置情况：左侧（各式枪头，及可常温放置的试剂如PBS等），右侧（5ml枪头及镊子），废弃瓶位于右上角，尽可能远离操作区域，正前方为枪和酒精灯，培养基及胰酶放置左侧便于取用。 6.超净台在使用前后，都需用含75%酒精的纱布擦拭台面至纱布上看不到明显脏物为止，每天操作后废液缸需清洗用紫外照射，此外，从外面拿进超净台的东西都要喷75%酒精消毒。 7、每周四需更换培养箱中高压过的超纯水，每周五对超净台（包括风机）、细胞培养房卫生进行打扫，每月对培养箱进行消毒清洗，确保细胞不受污染。

8、检查培养箱的CO2含量是否正常，如出现异常及时联系细胞平台相关负责人。 9、5mL枪头清洗高压的流程:(1)用洗洁精将枪头超声一遍（2）更换干净的自来水超声清洗3遍（3）用超纯水超声清洗1遍（4）将枪头捞出后再用超纯水荡洗3遍（5）放入烘干箱烘干（6）装在铁盒中，注意枪头放置顺序一致，放入高压锅，选择橡胶类（7）高压后放入烘干箱烘干后方可拿入细胞房使用 1ml、200ul、10ul装入枪盒后放入高压锅高压烘干后方可拿入细胞房使用 二、细胞传代 1.细胞传代前要观察细胞，细胞汇合度达到80%-90%时可以进行传代。图片 2.以25cm2培养瓶为例：打开培养瓶瓶盖，将盖子地面朝下放在超净台台面上，然后将培养瓶倾斜，用量程5ml的枪将旧培养基吸走，然后用量程1ml枪加1ml 空白培养基轻轻摇匀清洗，用5ml枪将清洗的培养基吸走。注：75cm2加3ml空白培养基清洗 3.加入胰酶（含EDTA）500ul；然后轻轻摇晃培养瓶，注意让所有细胞都要接触到胰酶，放入37度培养箱消化。注：75㎡大瓶加1500ul胰酶、6孔板加300ul 胰酶、12孔板加200ul胰酶 4.消化时间长短根据不同细胞有不同选择，镜下观察大部分细胞变圆，见大部分细胞脱落即可终止消化。 5.25cm2培养瓶加入2ml完全培养基终止消化。注：75cm2培养瓶加5ml完全培养基终止消化、6孔板加1.5ml完全培养基终止消化、12孔板加1ml完全培养基终止消化。 6.用5ml枪头轻轻吹打细胞后，观察底部大部分细胞已脱落，然后倾斜培养瓶，将细胞混悬液转移到15ml离心管，800r/min条件下离心3min。 7.离心时，准备新的培养瓶，标记好细胞的名称、日期、代数。 8.离心结束后，弃上清液。缓缓沿壁加入5ml新鲜的完全培养基，计数（方法参见后面）。 9.重悬细胞，用量程5ml枪，枪打到第一档，深入管底部，轻轻吸取离心管底部的整个沉淀的细胞团和培养基，然后沿管壁缓慢匀速打下，枪头随着液面的的上升而逐渐上提，这样可避免产生气泡。按此方法反复几次，待细胞混匀后，吸取细胞混悬液，加入新培养瓶，按所需比例进行传代即可。

完整word版培养瓶培养皿培养板详解及图谱

细胞培养瓶Nunc 可以完全接触到整个生长表面。符合人体工学标准。转就可以开关瓶盖,只需旋转1/3任何脚标处于向上的垂直状态则表“Y”“Y”标志可以确定瓶盖透气位置，可视性的即使示瓶盖在透气的的位置，任何脚标处于向下的垂直状态则表示瓶盖密封的，在培养瓶堆叠在培养箱中都可以轻易看见。培养瓶两旁都有标识刻度。/密封和过滤两种类型瓶盖。可以选用透气 细胞瓶面积容量工作体积细胞数目6 2ml25ml12.5cm210 5 50ml5ml25cm210 10ml 75ml35cm210 , ^. 15ml250ml75 cm210 8 o9 _8 40ml 700ml 150cm21.107 3 K* u- @( O0 O, n 补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。 培养板

l: B2 V6 k1 z5 q' i细胞培养板细胞接种量4~5×10 4 96孔板 1.孔10 548 2孔2.10 5 10 5孔1 10 6孔1. { s; ?$ q8 l# |1 l 培养皿

生长面积容量细胞数（大约）0 1×10 6 35mm培养皿 2.660mm培养皿×10 6 7×10 6 100mm培养皿 10 7 培养皿150mm ×1.8 注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。

常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量

常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量 不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。 常用的培养器皿 培养器皿底面积（cm2）加培养液量（mL）可获细胞量 96孔培养板0.320.1105 24孔培养板2 1.05×105 12孔培养板 4.5 2.0106 6孔培养板9.6 2.5 2.5×106 4孔培养板28 5.07×106 3.5cm培养皿8 3.0 2.0×106 6cm培养皿21 5.0 5.2×106 9cm培养皿4910.012.2×106 10cm培养皿5510.013.7×106 25cm塑料培养瓶25 5.05×106 75cm塑料培养瓶7515~302×107 25cm玻璃培养瓶19 4.03×106 100cm玻璃培养瓶37.510.06×106 250cm玻璃培养瓶7815.02×107 2500cm旋转培养瓶700100~250 2.5×108 注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。 各种孔板细胞接种量 细胞培养瓶（板）生长面积容量与细胞数（大约） 96孔板4~5X10 4 35mm培养皿 1X10 6 48 孔板 1.3X10 5 60mm培养皿 2.6X10 6 24孔板 2.5X10 5 100mm培养皿 7X10 6 12孔板 5X 10 5 150mm培养皿 1.8X10 7 6孔板 1.2X10 6 细胞瓶面积容量工作体积细胞数目 12.5cm2 25ml 2ml 5X10 5 25cm2 50ml 5ml 1X10 6 35cm2 75ml 10ml 2X10 6 75 cm2 250ml 15ml 4X 10 6 150cm2 700ml 40ml 1.1X107

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 【实验目的】 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养； 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 【实验原理】 A.细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 B.细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。

细胞铺板

养了两年半细胞了，也铺了两年半板子，各种板子基本都铺过，把自己铺板子的心得和大家交流一下，呵呵。 一般96孔板我每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子， 左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（我一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好）， 依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。 6孔板12孔板或24孔板，我均采用将第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推， 这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀， 注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好， 所以我放弃改用浸润孔底的方法。 我一直用这两种方法铺板子，细胞分散效果自我感觉还不错。 建议像香草同学说的那样，先用培养液铺一层淹没底面，再将吹打好的细胞悬液加入，接下来是秘籍了哦！ 加入细胞悬液后继续在孔中吹打转着圈的混匀，接着盖盖，就不要动它了，静置15分钟以后待细胞都沉降黏附在底面上后再拿出来放培养箱。 此法很有效，本人屡试不爽，今天传给你吧。 ，建议你接种细胞的时候从边缘缓慢注入，避免板子活动，十分钟后再拿出来看看，如果已经不均匀，则只能摇一摇，注意要的方向，只能朝一个方向进行，不可来回摇动，比如向左，向下运动，不可向左后再向右或向上后在向下运动。。铺板前细胞悬液一定要混合均匀，接种时要注意移液枪打入的速度 当初我做实验室也遇见过这类问题，当时我是这么解决的： 1，用培养液充分混匀消化的细胞，反复缓慢的抽吸； 2，在每次向六孔板中加细胞悬液前，先混匀两下再加； 3，向六孔板中加完细胞悬液后，把盖子盖好，向一个方向（或顺时针或逆时针）轻轻的晃一晃。 如果还是不行的话，就在2＆3 步骤之间加一步：用移液枪把不均匀的那个孔中的悬液缓慢抽吸混匀。不过这步操作一定要注意不要污染了细胞。这是我的办法，希望对你有用。

细胞实验报告

凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测 1 实验目的 1.1 通过测定凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测，研究缺糖对细胞增殖抑制作用的机制（引起细胞凋亡或坏死）。 1.2 掌握免疫组织化学法的原理。 2 实验原理 2.1 免疫细胞化学和亲和组织化学 免疫细胞化学（免疫组化）将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，从而对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。 2.2 凋亡相关基因—Bax Bax是Bcl-2家族成员。凋亡信号能激活Bax，使Bax蛋白从胞浆移位到线粒体膜上。随后其蛋白构象发生改变（寡聚化），使线粒体膜通透性增加，释放Cytc，引起细胞凋亡。 3.3Bax表达产物差异检测 本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。 3 实验材料 仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜。 材料：培养细胞。 试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB、0.3％H2O2-PBS。 4 实验步骤 培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复）—PBS洗，5min X 3次(轻轻地洗涤) —甲醇固定10min —PBS洗，5min X 3次—加入封闭液（1:10）25μl，37℃，30min —加一抗（1:300）25μl，37℃，1h —PBS洗，5min X 3次—加二抗25μl，37℃，1h —PBS洗，5min X 3次—加0.3％H2O2-PBS，37℃，30min —PBS洗，5min X 3次—SABC工作液20-30μl，37℃，1h —PBS洗，5min X 3次—DAB显色，观察结果。