AKTA层析系统

AKTA层析系统标准操作规程

在使用AKTA前，请先阅读本规程，并了解所需层析方法的原理。初次使用请在有经验的人指导下进行。

一.缓冲液和层析的样品的准备：

1.溶液需用去离子水、超纯水或注射用水配制，除NaOH和乙醇外，所有

用于层析的缓冲液需经0.45μm孔径的滤膜过滤，并盛装于用0.45μm孔径

滤膜过滤的水至少荡洗4次的容器中。

2.实验过程中用到的20%乙醇应用新的无水乙醇和0.45μm孔径滤膜过滤的

水配制；0.1M NaOH用0.45μm孔径滤膜过滤的水和固体NaOH配制。

3.盛装缓冲液的应使用小口有盖圆底容器，最好可灭菌，如蓝口瓶，无水

乙醇瓶。烧杯（敞口，易污染长菌）、血清瓶（多死角，易长菌）不适

合用于盛装缓冲液。

4.配制的缓冲液成分不宜浓度过高，如硫铵不得超过2M（约50%饱和硫铵）；

NaCl不得超过4M；PB不得超过500mM；以免析出固体损坏层析介质与

仪器。

5.缓冲液要多次使用，需在120℃灭菌20min，此后置于4℃保存，下回层

析时平衡至室温使用，使用前应摇晃无可见异物方可使用，否则，应重

新过滤。

6.用于层析的样品通常要用12000rpm离心10min，上清用0.22μm过滤后才

可以用于层析。经过层析后收集的样品如无沉淀可免去离心和过滤的步

骤。

7.用于离子，疏水层析的样品应经预实验不会在该层析条件下样品在低盐

和高盐条件下稳定不析出沉淀。

二.AKTA仪器的使用：

1.开关机

⑴开启电脑，检查电脑运行状态是否正常。

⑵开启AKTA总电源按钮(AKTA仪器一般分为2-3个模块，每个模块有

单独的电源开关，通常为开启状态，总电源开关一般用于开关仪器)，稍后开启AKTA控制软件UNICORN，并等待仪器自检和联机，每个模块自检成功后会发出“嘀---嘀嘀”的声音，相应在仪器上显示自检通过的字样。软件开启后会同时打开4个界面，从左到右依次是：文件管理界面、程序编辑界面，仪器控制界面，图线分析界面。与仪器连接成功后，仪器控制界面下方仪器简图线路变成绿色，仪器会从泵内走一段液体至废液。如未连接成功，操作界面会弹出提示窗口，此时请检查仪器与电脑数据线插头是否松动，而后关闭仪器和程序，重新开启，必要时可重新启动电脑。如经过以上步骤还无法连接，请联系管理员。

⑶使用完仪器应在文件管理界面关闭UNICORN程序，系统将提示是否

锁定界面，选否，待UNICORN完全退出后方可关闭仪器电源。使用完毕后需清理台面，并登记使用事项。

2．AKTA仪器的运行

⑴在打开流速之前，将AB管道插入缓冲液中，遵循A低盐，B高盐或者A高pH, B低pH的原则，若只用一种缓冲液，请将AB管道都插入缓冲液中，然后AB泵各走50%。在装上柱子之前应先用高流速将管道中替换成自己相应缓冲液。

⑵若样品量低于10mL，用上样环进样比较简便和准确。选用合适上样环，在装柱前连接上仪器，在清洗管道时调至inject一并清洗，并且装上层析柱后随柱子一起平衡。上样时，先在inject下插入注射器，调至load，打入缓冲液，改为inject，上样。

⑶在仪器控制界面可通过电脑控制流速，A/B泵流速比例，上样环状态切换，UV归零，压力上限，以及标注和定时暂停等。流速和压力控制要按照不同的介质、柱型号的使用方法严格严格执行（参数见附表）。特别需要注意的是，在使用时要设定最高压力警报，以避免操作不当造成柱子爆裂，甚至仪器损坏。AKTA使用过程中请检查各部分的运行情况，如有问题及时联系管理员。

⑷同时，在使用时，请确保位于仪器一侧的，50mL管装的20%乙醇正在循环流动（用于清洗压力泵），并且20%乙醇无浑浊或干涸现象。若发生断流或液体浑浊，请及时更换并用注射器抽取，让液体充满管道，避免对压力泵造成损害。

⑸使用NaOH以及盐浓度较高的缓冲液清洗管道或柱子时尽量减少漏液，如漏到仪器上时请及时擦拭干净，避免腐蚀AKTA。柱子使用完后要及

时拆卸，以便他人使用。注意柱子拆卸后要在相应接口连接一条管道，避免污染杂质，染菌或检测探头由于缓冲液干涸盐析造成损坏。

⑹当发现压力检测器或pH计不准时，及时通知管理员进行校正。

⑺运行结束后请及时保存实验结果，并归于各人自己目录下，便于整理

和存档。

三、层析柱和介质的使用：

1.装柱

⑴原先在溶液中的介质通常可以用水或乙醇（20%）装柱，干粉介质（如

G25）需在水中溶胀1h以上，方可装柱。CHTII需在200mM PB溶液中溶胀1h后，用200mM PB装柱。

⑵拆下柱子，清洗柱腔和管道，将位于下方的一端（较短的）接上AKTA

仪器，揭下防水膜，以5~10mL/min流速排出防水膜下的气泡，盖上防水膜，装上柱腔，继续在柱腔底部注满2cm左右的溶液，将计算好体积的介质贴壁缓慢倒入柱腔内，要防止气泡的产生。将管道从仪器上卸下，让溶液流出，介质随着沉降。当介质沉降完全后，堵上下端出口。

⑶将位于上方的一端接上仪器如⑵排去气泡后，向柱腔内缓慢注水至上

柱面，将上端插入柱腔，锁在介质面上方约1cm处。

⑷按附表中相应柱子介质的流速压介质5min，当介质面稳定后用笔在柱

外相应位置做记号。稍微松开上方，将上端压至标记处，（CHT II介质压至标记上方1mm处）旋紧。层析柱就可以使用了。

⑸分子筛类介质应倒装层析柱。

2．层析柱和介质使用注意事项

⑴TSK的高压预装柱也可以在AKTA上使用，但要注意流速和压力（详

见附表）

⑵在装柱和卸柱时要将柱头上的液体充满，再连上连接头或堵头。装柱

时要先用1/2流速倒冲柱子，赶出气泡，再连上接头，以免气泡进入介质内。

⑶实验过程中应保持柱子竖直，特别是分子筛。整个实验操作过程中都

要防止气泡进入介质内。常压层析柱使用较久后，柱压可能会上升，应适当降低流速。若层析柱在实验过程中出现泵压急剧升高，超过限度的情况，请联系管理员。

⑷在实验结束后，非高压柱应用0.1M NaOH清洗，最后保存于NaOH

或20%乙醇中；CHT II介质用0.1M NaOH清洗不宜超过2倍柱体积，最后应保存于水或20%乙醇中；高压预装柱除G3000SW外用0.1M NaOH清洗，保存于超纯水中；G3000 SW用超纯水清洗，保存于超纯水中。柱子卸下时，2端柱头都应先充满液体，再接上堵头，放4℃保存，经常使用的可放室温保存。

四. 使用后登记及台面清洁

1.将使用的各部件放置原有位置，在登记表上如实填写仪器使用状态，登

记使用日期和使用人。

2.带走自己的物品，保持桌面清洁。再次注意，仪器上如有缓冲液外漏，

请擦拭干净以免腐蚀仪器。

撰写人：魏旻希139********

附表：各层析柱与介质的参数

一、常压柱：

1.常压预装柱：

包括HiTrap Sepharose FF系列，HiTrap Sepharose HP系列，HiTrap

Sepharose XL系列，Hitrap Desalting（G25）系列，Superdex 系列：

柱子类型压力上限最大流速（运行）其它要求HiTrap XXX Sepharose FF（1mL）0.3M Pa 1mL/min

HiTrap XXX Sepharose HP（1mL）0.1M Pa 1mL/min

HiTrap XXX Sepharose XL（1mL）0.3M Pa 1mL/min

Hitrap Desalting（5mL）0.3M Pa 3mL/min

Hitrap Desalting（10mL）0.3M Pa 10mL/min

Superdex 75/200 0.6M Pa 0.75mL/min

2.常压柱子（进口）：

柱子型号压力上限最大流速（装柱）最大流速（运行）其它要求

XK 16/20 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min

XK 16/100 0.5M Pa 2.5mL/min 2mL/min 通常装分子筛介质XK 26/20 0.3M Pa 12mL/min 8mL/min

XK 26/60 0.3M Pa 25mL/min 20mL/min

XK 26/100 0.3M Pa 12mL/min 8mL/min 通常装分子筛介质有夹套的进口柱子，XK A/B表示内径为A（mm），高为B（cm）

3.常压柱子（国产）：

柱子型号压力上限最大流速（装柱）最大流速（运行）其它要求

15*20 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min

15*100 0.5M Pa 2.5mL/min 2mL/min 通常装分子筛介质25*20 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min

25*40 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min

35*40 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min

35*60 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min

国产柱子，A*B表示内径为A（mm），高为B（cm）

4.常压介质：

介质压力上限

最大流速（装

柱）最大流速

（运行）

其它要求

XXX Sepharose FF 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min 快速介质，可高流速XXX Sepharose HP 0.3M Pa 12mL/min 10mL/min 高效介质，不耐高压XXX Sepharose XL 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min 大载量介质，可高流速XXX Capto 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min 新介质，可高流速G25 0.5M Pa 25mL/min 20mL/min 干粉，需预溶胀Superdex 200 0.5M Pa 2.5mL/min 2mL/min 分子筛介质

CHTII 0.5M Pa 12mL/min 10mL/min

干粉，200mM PB 预溶胀，装柱，不耐高压，不

耐NaOH

SPA (Protein

A)-Sepharose 4B 0.5M Pa 22mL/min 20mL/min

可用乙醇清洗，不能用

NaOH清洗

CHT II为BioRed产品，SPA (Protein A)-Sepharose 4B自产，其余为GE 产品。

二．高压预装柱：

介质压力上限最大流速其它要求

（运行）

TSK-gel XX 5pw 7.5*75 0.5 kPsi /0.6M Pa 1mL/min

TSK-gel XX 5pw

0.5 kPsi /0.6M Pa 6mL/min

21.5*150

TSK-gel G5000PW XL

0.1 kPsi /0.3M Pa 0.5mL/min

7.8*300

TSK-gel G3000SW XL

0.1 kPsi /0.3M Pa 0.5mL/min 不能用于pH>7.5的缓冲液

7.8*300

TSK-gel G3000SW XL

0.6 kPsi /0.6M Pa 6mL/min 不能用于pH>7.5的缓冲液

21.5*600

TOSOH产品：A*B表示内径为A（mm），高为B（mm）

原本1kPsi=145MPa，但AKTA系统（泵和管道）不适合耐受太高压力。