京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征

第9期

2011年9月

高分子学报

ACTA POLYMERICA SINICA

No．9Sep．，2011

1086

*庆祝沈家骢院士80华诞专稿；2011-04-18收稿，2011-06-08修稿；国家自然科学基金（基金号50873102，50733003，21074129，50903009和A3项目20921140264）、吉林省科技发展计划（项目号20090128，20096018）和科技部国际合作项目（项目号2009AA03Z308）资助；＊＊通讯联系人，E-mail ：xschen@ciac．jl．cn ；weiyen@tsinghua．edu．cn doi ：10．3724/SP．J．1105．2011．11121

京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征

*

董璇

1，2

田华雨

1

陈杰

1

夏加亮

1，2

陈学思

1＊＊危岩

3＊＊

（1中科院长春应用化学研究所先进生态环境材料重点实验室长春

130022）

（2中国科学院研究生院

北京

100039）

（3清华大学理学院化学系

北京100084）

摘要使用京尼平与分子量为1800的超支化低聚乙烯亚胺在70%的乙醇溶液中反应，合成了具有荧光的

交联型聚合物．利用核磁、凝胶渗透色谱、粒度仪、zeta 电位仪和凝胶阻滞电泳对聚合物载体及其与DNA 复合物颗粒进行了表征．研究表明，聚合物载体与DNA 复合物颗粒粒径为120 150nm ，zeta 电位为+20 25mV ，聚合物/DNA 在质量比为0.25时能够将DNA 完全阻滞．通过MTT 细胞毒性测试和体外荧光素酶质粒转染实验得出，载体在测试范围内显示了非常低的细胞毒性，最佳转染效率明显高于PEI25k ，同时载体可用于荧光标记．关键词

京尼平，低聚乙烯亚胺，基因载体，转染，荧光

基因技术的发展使得基因缺陷导致的疾病或者癌症等的根治成为可能

［1 3］

．病毒类载体被广

泛的应用于基因治疗中，但是病毒类载体存在着很大的免疫安全隐患，极大地限制了其发展．聚阳离子载体便宜易得，

且不存在病毒类载体的安全隐患，日益成为基因载体领域的研究热点

［3］

．其

中，

聚乙烯亚胺（PEI ）由于其独特的“质子海绵效应”，能够实现载体与DNA 形成的复合物从内涵体中逃逸，引起科研学者的广泛关注

［4］

．作为金

标准的PEI25k （M n =2.5?104

Da ）虽然具有较高

的转染效率，但细胞毒性大限制了其应用［5 10］

．

通过使用各种不同的交联剂将低分子量PEI 进行选择性的交联得到的交联型PEI 不仅保持了低分子量PEI 的低毒性同时还获得了与PEI25k 相似的转染效率

［11 15］

．

京尼平（Genipin ）由于其极低的细胞毒性和基因毒性和优良的生物相容性，

是一种新型、天然的交联剂．因此，其在药物控释、骨组织修复以及组织工程支架等生物医用领域得到了广泛的应用

［16，17］

．然而，在基因传递领域，有关京尼平的应

用只有较少的报道［18］

．利用京尼平交联低聚乙烯

亚胺的合成及应用尚鲜见报道．因此，本文通过京尼平交联分子量为1800的超支化低聚乙烯亚胺，得到了一种新型具有荧光的阳离子聚合物，研究

了其作为非病毒基因载体应用的各项性能．

1

实验部分

1.1

试剂与仪器

超支化聚乙烯亚胺（PEI25k ）（Sigma ，M w =

2.5?104）；支化低聚乙烯亚胺（OEI1800）（Alfa ，M w =1800）；京尼平（Genipin ）（上海天放公司）；透析袋（MWCO 3500，上海绿鸟公司）；小牛胸腺DNA （Promega 公司）；4'，6二脒基-2-苯吲哚（DAPI ，Sigma-Aldrich ）；噻唑蓝（MTT ）（Sigma 公司）；BCA （二喹啉甲酸）法蛋白浓度检测试剂盒（Pierce 公司）；酶标仪（ELISA microplate reader ，Bio-rad 公司）；乙醇溶剂为化学纯直接使用．1.2实验过程

1.2.1

京尼平交联低聚乙烯亚胺（GP ）的合成将2.96g OEI1800（1.64mmol ）置于圆底烧瓶中，

用15mL 70%的乙醇溶解；另将0.37g （1.64mmol ）京尼平（Genipin ）溶于1.5mL 70%的乙醇中，将京尼平溶液加入到OEI1800的反应瓶中混合均匀，升温至37?搅拌反应3天．反应完毕后，在截留分子量为3500的透析袋中透析3天，用G4砂芯漏斗过滤溶液，将滤液冷冻干燥，得到蓝黑色目标产物京尼平交联低聚乙烯亚胺聚合物（GP ），收率为50%．

9期董璇等：京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征

1.2.2测试方法核磁共振氢谱（1

H-NMR ）用Bruker AV400

NMR 核磁共振仪测试，以D 2O 为溶剂．凝胶渗透色谱（GPC ）由Waters 515泵、

1根7.8?300mm 线形柱、

1个Wyatt 十八角激光光散射器和1个OPTILAB DSP 折光指数检测仪组成．流动相为0.3mol /L 醋酸钠（pH = 4.4），使用前用0.02

μm 滤膜过滤，流速为0.5mL /min

［19］

．1.2.3凝胶阻滞电泳实验

配制0.1mg /mL 的质粒DNA （pDNA ，pEGFP-N1）水溶液，加入等体积一定浓度的聚合物溶液，混合，涡旋，孵育10min 后，用1%的琼脂糖电泳分析．1.2.4

复合物的粒径与表面电位表征

配制0.05mg /mL 的小牛胸腺DNA 水溶液，复合物根据不同的阳离子聚合物/DNA 比例混合制备，

涡旋后孵育30min ，粒径大小与表面电荷采用纳米粒度电位仪（zeta plus ，Brookhaven 公司，美国）进行测定

．Scheme 1Synthesis route of genipin crosslinked PEI （GP ）copolymer

1.2.5

细胞毒性测试采用MTT 方法进行表征．

HEK293细胞按照1?104cell /孔的密度接种于96孔板中，

置于37?5%CO 2的孵箱，于含有10%新生牛血清（FBS ）、100μg /mL 链霉素和100Unit /mL 青霉素的DMEM 培养液中培养24h．然后在每孔中加入100μL 不同浓度阳离子聚合物的磷酸盐缓冲液（PBS ），继续培养24h 后，每孔加入20μL MTT （5mg /mL ）的PBS 溶液，继续培养4h ，小心弃去培养液，每孔加入200μL 二甲基亚砜（DMSO ），振荡10min ，用酶标仪测试每孔在492nm 波长下的吸收值．细胞存活率（%）=（A sample /A control ）?100%．A sample 为与聚合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，

A control 为未与聚合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复3次．1.2.6

细胞荧光素酶转染实验

转染前24h ，

HEK293细胞按照1?104cell /孔的密度接种于96孔板中，加入DMEM 培养液在37?5%CO 2的孵箱中培养24h 后使细胞汇合度达到80% 90%．转染前，更新培养液，配制不同质量比的阳离子聚合物/DNA 复合物，室温下结合30min ，加入96孔板中．继续培养48h ，小心弃去培养液，

用PBS 清洗2次，然后每孔加入100μL 细胞裂解液．使用荧光素酶分析系统（Promega 公司）测定荧光素酶活性的相对光单位（relative light unit ，RLU ）．采用BCA 法测定裂解液中的蛋白含量，转染效率采用荧光素酶活性的每毫克蛋白质的RLU 表示．1.2.7

激光共聚焦实验

HEK293细胞按照1?105cell /孔的密度接种于6孔板中的11mm 盖玻片上，在细胞汇合度达到70% 80%时进行转染，

选荧光素酶质粒DNA （pGL3plasmid ）为报告基因，阳离子载体/DNA 复合物的质量比为20?1．在转染后5h 取出培养板，用3.7%多聚甲醛固定10min ，弃去上清液，用PBS 洗3次．每孔加入1μL DAPI 溶液（1μg /mL ）标记细胞核10min ，使用激光共聚焦显微镜（Leica ，TCS SP2）观察照相．

2

结果与讨论

2.1

载体合成及表征

聚合物GP 的合成过程如示意图1所示．京

尼平和OEI1800都在70%乙醇中溶解很好，即使使用一个过大的反应浓度也不会出现一个黏稠的反应体系

［20，21］

，从而能够较精确地控制反应浓

度，使交联产物的可重复性大大增强．实验发现，通过控制乙醇的浓度可有效控制交联度，在99%乙醇中反应得到的交联聚合物在水中不溶解，而在70%乙醇中反应得到的聚合物在水中溶解性很好，可能是由于在高浓度的乙醇中反应得到交联产物中憎水性的京尼平含量增加降低了交联生成的聚阳离子在水中的溶解性．另外，得到交联聚合物GP 中含有大量的共轭结构，表现出了荧光

7

801

高分子学报2011年

性，通过激光共聚焦显微镜观察也证实了这一点．

聚合物的结构通过1

H-NMR 的方法进行了表

征．如图1所示，

OEI1800结构的特征峰在δ2.4 3.5处；而在δ4.21（a ）、7.73（b ）、5.87（c ）、5.71（d ）出现的特征峰分别归属于京尼平的亚甲基峰以及杂环上质子峰，由此证明了京尼平交联OEI1800反应的发生

．

Fig．1

1

H-NMR spectrum of GP22in D 2O

通过GPC-光散射方法测定产物绝对分子量及其分布的结果见表1．随着反应物（Genipin /OEI1800）投料摩尔比的减小，聚合物分子量变小；相对于OEI1800聚合物的分子量都显著增大，

也证实了京尼平交联OEI1800反应发生．Table 1

Preparation of GP copolymers

Sample Feed molar ratio of Genipin /OEI1800

M w PDI GP212?175700 1.13GP222?251100 1.09GP23

2：3

40200

1.18

2.2GP /DNA 复合物的粒径与表面电位载体/DNA 复合物颗粒的粒径大小及表面电

荷情况直接影响基因传递过程的稳定性以及细胞内吞效率

［20，21］

．通过图2（a ）表面电位结果并结

合图2（b ）粒径测试结果，可以得出，通过Genipin 交联OEI1800反应得到较大分子量的GP21、GP22以及GP23都能够有效的包裹保护DNA ，形成120 150nm 复合物颗粒．表面电位随着载体/DNA 质量比增加，复合物颗粒的表面电荷由负变正并逐渐增大，最终稳定在+20 25mV．PEI25k 具有很强的DNA 结合力，能够与DNA 复合并压缩形成120nm 左右的表面带正电的颗粒．虽然OEI1800分子结构与PEI25k 相同，但由于分子量偏低结合力弱，

其与DNA 复合形成较大的颗粒（280nm 左右），表面电荷很小（+14mV 左右）．这一结果也体现了交联型阳离子的结合力较单纯的交联单元（OEI1800）提高了很多

．

Fig．2

（a ）zeta potentials and （b ）particle sizes of complexes

of DNA and different carriers at various mass ratios

2.3凝胶阻滞电泳

通过凝胶阻滞电泳实验进一步考察载体材料

GP 与DNA 的结合能力．如图3所示，3种聚阳离子材料GP21、

GP22和GP23都能够非常有效地完成对质粒DNA 的电泳阻滞．PEI25k 、

GP21、GP22和GP23的临界阻滞载体/DNA 质量比分别为0.15、0.25、0.25和0.2，聚阳离子材料GP21、GP22和GP23临界阻滞载体/DNA 质量比都比PEI25k 稍高一点，可能是由于交联反应过程中伯胺参与反应，从而伯胺基团数量的减少导致电荷密度的降低，与DNA 的结合能力减弱．2.4

MTT 细胞毒性表征

图4为在不同聚合物浓度下的细胞存活率曲线．所有的GP 共聚物（GP21、

GP22和GP23）都表现出比PEI25k 更低的细胞毒性，这与报道的此类载体性质一致

［22，23］

．在浓度＜50μg /mL 时，所有

GP 共聚物都表现出较低的细胞毒性，细胞存活率

8

801

9期董璇等：

京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征

Fig．3Gel retardation assay of complexes at various mass ratios （a ）PEI25k /pDNA ，（b ）GP21/pDNA ，（c ）GP22/

pDNA ，（d ）GP23/pDNA ；mass ratio of complex /DNA ，1 8：0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4

均大于70%，与OEI1800相当．随着GP 聚合物浓度的增加，细胞毒性也随之相应增加，这是因为交联的GP 共聚物比OEI 具有更高的阳离子密度

．

Fig．4

The percentages of viable cells at various polymer

concentrations for PEI25k ，OEI1800，GP21，GP22，GP23

2.5细胞荧光素酶转染

选用pGL3plasmid 作为报告基因进行细胞转

染实验评价材料的性能．用HEK293细胞系分别对PEI25k 、

OEI1800和载体GP 进行转染性能比较．如图5所示，交联型基因载体GP 与单纯OEI1800相比，具有更高的转染效率．GP 聚合物的转染效率随着分子量的降低而升高．GP22和GP23的最佳转染效率都高于PEI25k ，其中，GP23/DNA 在其最佳转染质量比为20?1时的转染效率明显高于PEI25k /DNA 最佳转染质量比为1?1的转染效率；GP21的转染效率则略低于

PEI25k．

Fig．5Transfection efficiency of carrier /pDNA at various

mass ratios in HEK293cells

2.6

GP /DNA 复合物颗粒的细胞内吞

在前期定性以及定量实验中，

GP 材料可以有效地介导DNA 进入细胞转染，

获得了比较高的转染效率．为了进一步证实GP 共聚物介导DNA 细胞传递的能力，以GP22为代表，利用激光共聚焦显微镜对其与DNA 复合物颗粒进行了观察拍照．图6即是GP22/DNA 复合物颗粒在HEK293细胞转染5h 后分布情况结果．图6（b ）中箭头所示的白色（红色）区域为GP22自身发出的红色荧光，图6（a ）中箭头所示白色区域为DAPI 染色（蓝色）的细胞核．我们能清楚地看到明显的白色（红色）区域说明载体GP22可以发出红色荧光（图6（b ））．通过图6（c ）清楚地看到白色（红色）区域分布在细胞核（蓝色区域）的周围证实了聚阳离子载体GP 能够携带DNA 进行有效地胞内传递．通过这些照片足以说明GP 可以作为自发荧光载

9

801

高分子学报2011

年

Fig．6Cellular distribution of GP22/pGL3complexes in HEK293cells at5h post-tansfection；cells were fixed with PFA and stained with DAPI to visualize the cell nuclei

体材料有效地介导质粒DNA进入细胞内并进行

基因传递．

3结论

通过京尼平交联低聚乙烯亚胺得到了一种新

型具有红色荧光的交联型阳离子聚合物GP．通过

不同的京尼平/OEI投料比，可以获得不同分子量

的GP共聚物．所获得GP共聚物都能够有效地结

合DNA，并进行基因传递，表现出与PEI25k相当

的转染效率，却具有更低的细胞毒性．此外，其自

身的红色荧光性能，使得其在基因传递过程中，易

于进行荧光显微镜观察．因此，此类共聚物可作为

自身荧光标记载体在基因传递领域将有良好的应

用前景．

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21Christensen L V，Chang C W，Kim WJ，Kim S W．Bioconjugate Chem，2006，（17）：1233 1240

22Guo Zhaopei（郭兆培），Tian Huayu（田华雨），Xia Jialiang（夏加亮），Chen Jie（陈杰），Lin Lin（林琳），Chen Xuesi（陈学思）．Science China Chemistry（中国科学：化学），2010，53（12）：2490 2496

23Yuan Renxu（苑仁旭），Zuo Yufang（左瑜芳），Xiao Zhongpeng（肖中鹏），Huang Wenlin（黄文林），Shuai Xintao（帅心涛）．Acta 0901

1901

9期董璇等：京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征

Polymerica Sinica（高分子学报），2009，（2）：104 110

SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF GENIPIN CROSS-LINKED

OLIGOETHYLENIMINE FOR GENE DELIVERY

DONG Xuan1，2，TIAN Huayu1，CHEN Jie1，XIA Jialiang1，2，CHEN Xuesi1，WEI Yen3（1Key Laboratory of Advanced Ecomaterials，Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun130022）

（2Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing100039）（3Department of Chemistry，Tsinghua University，Beijing100084）Abstract A novel fluorescent cationic polymer，genipin cross-linked branched oligoethylenimine（1800Da，OEI1800），GP，was successfully synthesized in70%ethanol solution and evaluated as a non-viral gene carrier．The copolymers were characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy（1H-NMR）and gel permeation chromatography（GPC）．The complexes of copolymers/DNA based on GP were measured by dynamic light scattering and Zeta potential instrument．The results showed that the synthesized copolymers could efficiently condense DNA into nanosized particles（120 150nm）with positive surface charges（+20 25mV）．The DNA-binding ability of the copolymers was further examined by gel retardation assy．When the mass ratio of polymer and DNA was0.25，the plasmids were fully retarded in1%agarose gel by gel retardation electrophoresis．Moreover，the in vitro cytotoxicity and transfection efficiency of the GP copolymers were respectively tested by the MTT and luciferase assay，using OEI1800and PEI25k as the control in the HEK293 cells lines．The cell toxicity and gene transfection evaluations showed that the copolymers exhibited lower cytotoxicity and higher gene transfection efficiency than PEI25k in the HEK293cell lines．Finally，the carriers could be used as the fluorescent labeling materials．Therefore，the copolymers may have potential biomedical application as non-viral gene carriers．

Keywords Genipin，Oligoethylenimine，Transfection，Gene carrier，Fluorescence

基因表达载体构建教学设计

“基因表达载体的构建”教学设计

专题1 1.2基因工程的基本操作程序之基因表达载体的构建 一、目的基因和运载体的连接 二、利用标记基因筛选含目的基因的受体细胞 三、目的基因和启动子的相对位置关系 附件1： 附件2：

【教学反思】 基因表达载体的构建是基因工程的关键步骤，空间想象难度大，科学理论和技术实践密切联系，思维跨度也大。福州屏东中学学生程度一般，正因如此，处理不好会提高学习难度，令学生视高科技为畏途，导致教学流于形式。本节课用微课和模型成功地化解了难点。 一方面基于学生课前微课的“先学”，学生对表达载体的构建有个整体的认识，然后以此为支架在课堂上填充和拓展内容，当学生在课堂上遇到相关问题时，能尽快到达“最近发展区”，获得进一步的发展，使学生逐渐对细节有更丰富更具体的理解，这种先整体后局部的处理符合学生的认知规律。基于微课的先学后教模式实质上是利用微课为学生创设一个情境，使学生带着思考和疑惑走进课堂，节省课堂的热身时间，从而使高效率大容量的课堂教学目标得以实现。 另一方面高二学生具有抽象思维，但是仍然需要感性知识，形象知识作为支持，所以教师精心设计纸质模型，基于教材原有的学习完“DNA重组的基本工具”后的纸圈模拟活动，再设计了双酶切的活动，化微观为直观，一系列问题的发生都源自学生自己亲手构建的模型，从模型中发现问题，进而逐步由浅入深。学生像科学家一样思考问题、解决问题，获得成功的体验。由于是带着问题的探究模拟活动，使学生的课堂参与是形式之上思维的积极参与。学生获得的体验是：基因工程这么高深的原理原来我也能想得到。学生的纸质模型立体、科学、易操作，但不好展示，而教师利用不同颜色的磁贴，随着课程的逐步推进，简洁明了地逐步在黑板上呈现，让整个环节衔接自然，师生互动流畅。直观的教学手段——模型构建，减轻了学生掌握这些知识的阻力，激发了学习积极性，使学生在轻松愉快的氛围中突破了重难点，强化了学生交流合作意识。 总之，作为教师，应该想学生之所难，积极探索有效途径，一堂成功的课不是展示教师的才智、形象、语言，更要通过学生的成功来反映。

维真生物-如何阅读基因载体图谱

如何阅读基因载体图谱 基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件： （1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒； （2）介导外源基因的转移和表达； （3）对人体不致病； （4）在环境中不会引起增殖和传播。 非病毒载体一般是指质粒DNA。 2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。 3、按功能分类：克隆载体、表达载体 克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。 表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。 载体组成元件 1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 4、P/E：启动子/增强子 5、Terms：终止信号 6、加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 示例阅读载体： pENTER载体 1）human ORF + pENTER载体 2） CMV启动子，T7启动子 3） ORF的C端融合了Flag和His tag 4) 多克隆位点，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常见的)

基因的克隆、表达载体构建与功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，

移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein V ector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞

交联温度对京尼平交联胶原壳聚糖组织工程支架的影响

交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖组织工程支架的影响 来源：中国论文下载中心 [ 10-05-04 09:57:00 ] 编辑：studa20 作者：曹峥，胡蕴玉，潘纬敏，白雪东，毕龙，李丹，杨小彬，刘民 【摘要】[目的]通过研究材料的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性的变化，探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖支架的影响。[方法] 采用冷冻干燥法制备胶原/壳聚糖复合多孔支架，分别于4℃、20℃、36℃条件下，在0.5%京尼平水溶液中交联24 h。以未交联的胶原/壳聚糖复合多孔支架作为对照，评价所得支架的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性特点。[结果]随交联温度升高，支架的交联度明显增大，溶胀率和降解率逐渐减小。4℃组支架交联度47.88%±6.4%，溶胀率为721%±46%，4周后降解3.95%±6.4%;20℃组支架交联度67.69%±3.6%，溶胀率为662%±72%，4周降解 0.91%±5.9%;36℃组支架交联度70.32%±5.7%，溶胀率为635%±27%，4周降解0.66%±7.3%，三组上述观察指标均优于未交联组(P/0.01)。[结论]京尼平交联可以显著降低胶原/壳聚糖支架的降解率和溶胀率，且对支架结构和生物相容性无明显影响。交联温度增加可以提高支架的交联度和抗降解能力，较快获得具有良好生物相容性和降解率的组织工程支架。 【关键词】交联温度; 壳聚糖; 胶原; 京尼平; 组织工程 Abstract: [Objective]To investigate the changes of pore sizes,crosslinking index,swelling ration,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility of genipin crosslinked collagen/chitosan scaffolds affected by the different crosslinking temperature points.[Method]The freeze-dried collgaen/chitosan scaffolds crosslinked with 0.5% genipin within 24 h were divided into 3 groups by crosslinking temperature:4℃group,20℃group and 36℃group.The characteristics of pore sizes,crosslinking index,swelling ratio,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility were evaluated.Collagen/chitosan scaffolds without crosslinking were chosen as control group.[Result]With the increase of temperature,crosslinking index was increased,but swelling ratio and degradation rate were decreased.In 4℃group,the crosslinking index was 47.88%±6.4%,the swelling ratio was 721%±46%,and the degradation rate was decreased by 3.95%±6.4% at 4 weeks.In 20℃group,the crosslinking index was 67.69%±3.6%,the swelling ration was 662%±72%,and the degradation rate was 0.91%±5.9% in 4 weeks.In 36℃group,the crosslinking index was 70.32%±5.7%,the swelling ration was 635%±27%,and the degradation rate was 0.66%±7.3% at 4 weeks.The above indexes of the three groups were much better than those of control group(P<0.01).[Conclusion]It was indicated that the swelling ratio and degradation rate of the collagen/chitosan scaffolds are significantly decreased by genipin without any obvious change of pore sizes and toxicity.The biocompatibility and degradation rate of this tissur engineering scaffold can be well obtained with genipin by increasing crosslinking temperature within 24 h. Key words：crosslink temperature; chitosan; collagen; genipin; tissue engineering

运载体与基因表达载体的区别

运载体与基因表达载体的区别 1、不同点： ⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将目的基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。 相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目的基因这一功能，只要能运输目的基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目的基因。 ⑵“基因表达载体”，是实施了运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。 这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同。 2、联系： “基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的。 基因表达载体的构成：目的基因+ 启动子+ 终止子+ 标记基因。 3、表达载体上的启动子和终止子是本身具有还是后加上去的呢？ 这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人的观点是：这要看获取目的基因的方法，而问题的根源在于基因的结构。关于基因的结构，在新课程标准中也不再做为教学的要求了。 （人类）结构基因的基本结构：上游非编码区+ 启动子+ 编码区+ 终止子+ 下游非编码区 人类结构基因4个区域： ①前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）； ②编码区，包括外显子与内含子； ③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）； ④调控区，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼顺序（图1－１）。 ⑴启动子：启动子（promoter）能促进转录过程。也有人将启动子称为“RNA聚合酶识别位点”。 包括下列几种不同顺序： ①TATA框（TATA box）：其一致顺序为TATAATAAT。它约在基因转录起始点上游约-30-50bp 处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录。 ②CAAT框（CAAT box）：其一致顺序为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。 ③GC框（GC box）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。 此外，RNA聚合酶Ⅲ负责转录tRNA的DNA和5SrDNA，其启动子位于转录的DNA 顺序中，称为下游启动子。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体 1 启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2 增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容： 2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa 蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2 优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。 2.3对基因编码区加以改造

新型生物交联剂京尼平的性质与应用

新型生物交联剂京尼平的性质与应用 一、京尼平简介 交联剂已经被广泛地应用于细胞膜结构、蛋白质结构、蛋白质间相互作用、生物导弹、载体蛋白与半抗原的连接、蛋白质或其他分子的固相化及抗体的标记等生物领域的研究。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺–2,2′–二磺酸、1,5–二氟–2,4–二硝基苯与己二酰亚胺酸二甲酯等。但这些化学交联剂在使用中存在毒性高，污染严重等缺点。因此，寻求一种低毒性、生物可降解的交联剂来代替戊二醛已非常必要。 京尼平（Genipin）是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂。一般采用从栀子中提取京尼平苷，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得，也可以采用微生物转化法制备[1、2]。栀子属于茜草科植物，是我国盛产的一种中药材，具有利胆、保肝等功效，在我国应用于临床治疗已有1600多年历史[3]。栀子果实的化学成分很多，主要包括藏红花素类、栀子苷类和多元酚类，其中栀子苷的主要成分为京尼平苷[4]。京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，无毒、易溶于水，京尼平苷在杜仲和栀子中含量均较高，达到3%~8%左右。 Djerassi等[5]早在1960年就利用核磁共振光谱数据和化学降解实验发现了京尼平，其分子式为C11H14O5，属于环烯醚萜类物质，京尼平苷与京尼平的结构式可见图1.2。京尼平本身是无色的，但是它与氨基酸发生反应后，会产生蓝色化合物，这种蓝色化合物是可以食用的，现在已被用在食品着色剂中[6]。 二、京尼平交联机理 随着京尼平参与明胶、壳聚糖等交联反应的广泛化，其交联反应机理也先后被报道[1,7-9]。图1.3为含氨基聚合物与京尼平交联反应的示意图[9]。京尼平交联明胶、壳聚糖等含氨基基团的化合物的机理最为成熟的是pH依赖型机理[2]。在不同的pH条件下，京尼平与壳聚糖等的交联机理不同。 1.在酸性和中性条件下，壳聚糖上的氨基基团亲和攻击京尼平C-3位的烯碳原子，二氢吡喃环打开，形成杂环胺，这样可以形成由短链京尼平为交联桥的网状结构聚合物。这种通过壳聚糖的氨基集团对京尼平上的酯基进行亲核取代的反应，在酸催化的条件下才能发生。 2.在碱性条件下，水溶液中的OH–亲核攻击京尼平，京尼平开环形成一个醛基中间体，开环京尼平单分子醛醇缩合形成大分子聚合物。聚合京尼平的末端醛基可以和壳聚糖上的氨基进行Schiff碱反应，形成交联网状结构。这说明京尼平分子可以先进行聚合，以形成长链京尼平交联桥的网状结构聚合物。因此，环境的pH条件对京尼平交联明胶、壳聚糖等胶体制备中的交联反应有很大影响。交联键的性能和长度取决于交联反应的pH。在酸性条件下，通过壳聚糖产生的京

新型生物交联剂京尼平论文：新型生物交联剂京尼平的性质与应用

新型生物交联剂京尼平论文：新型生物交联剂京尼平的性质 与应用 一、京尼平简介 交联剂已经被广泛地应用于细胞膜结构、蛋白质结构、蛋白质间相互作用、生物导弹、载体蛋白与半抗原的连接、蛋白质或其他分子的固相化及抗体的标记等生物领域的研究。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺–2,2′–二磺酸、1,5–二氟–2,4–二硝基苯与己二酰亚胺酸二甲酯等。但这些化学交联剂在使用中存在毒性高，污染严重等缺点。因此，寻求一种低毒性、生物可降解的交联剂来代替戊二醛已非常必要。 京尼平（genipin）是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂。一般采用从栀子中提取京尼平苷，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得，也可以采用微生物转化法制备[1、2]。栀子属于茜草科植物，是我国盛产的一种中药材，具有利胆、保肝等功效，在我国应用于临床治疗已有1600多年历史[3]。栀子果实的化学成分很多，主要包括藏红花素类、栀子苷类和多元酚类，其中栀子苷的主要成分为京尼平苷[4]。京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，无毒、易溶于水，京尼平苷在杜仲和栀子中含量均较高，达到3%~8%左右。 djerassi等[5]早在1960年就利用核磁共振光谱数据和

化学降解实验发现了京尼平，其分子式为c11h14o5，属于环烯醚萜类物质，京尼平苷与京尼平的结构式可见图1.2。京尼平本身是无色的，但是它与氨基酸发生反应后，会产生蓝色化合物，这种蓝色化合物是可以食用的，现在已被用在食品着色剂中[6]。 二、京尼平交联机理 随着京尼平参与明胶、壳聚糖等交联反应的广泛化，其交联反应机理也先后被报道[1,7-9]。图1.3为含氨基聚合物与京尼平交联反应的示意图[9]。京尼平交联明胶、壳聚糖等含氨基基团的化合物的机理最为成熟的是ph依赖型机理[2]。在不同的ph条件下，京尼平与壳聚糖等的交联机理不同。 1.在酸性和中性条件下，壳聚糖上的氨基基团亲和攻击京尼平c-3位的烯碳原子，二氢吡喃环打开，形成杂环胺，这样可以形成由短链京尼平为交联桥的网状结构聚合物。这种通过壳聚糖的氨基集团对京尼平上的酯基进行亲核取代的反应，在酸催化的条件下才能发生。 2.在碱性条件下，水溶液中的oh–亲核攻击京尼平，京尼平开环形成一个醛基中间体，开环京尼平单分子醛醇缩合形成大分子聚合物。聚合京尼平的末端醛基可以和壳聚糖上的氨基进行schiff碱反应，形成交联网状结构。这说明京尼平分子可以先进行聚合，以形成长链京尼平交联桥的网状

不同基因表达载体的优缺点 孟凡顺

不同基因表达达载体的优缺点 理化系生物技术班孟凡顺 进入21世纪以来，基因工程的发展越来越快，也越来越完整，作为新世纪生物科学前沿，基因工程的快速发展也大大的刺激了人们对科学知识的向往，走进基因工程，我们发现在基因工程的四大步骤，目的基因的获取，基因表达载体的构建，将基因表达载体打入受体细胞以及目的基因的监测与鉴定，这其中最重要的是也是最繁琐的莫过于第二步基因表达载体的构建，而在基因表达载体的构建这一过程中，最重要的无疑就是目的基因导入受体细胞，将目的基因导入受体细胞的关键就是运载体的选择，在这里，我们要对运载体的种类进行介绍。 首先我们要知道什么东西可以作为运载体，作为运载体又有哪些特征？ 首先，作为运载体的物质它必须可以进行自我复制，这样才可以在它与外源基因融合后，独立在宿主细胞中复制繁殖，其次有至少一个在融合外源基因后仍未被破坏的遗传表型，这便于将载体导入受体细胞后的识别与筛选，通常表现在为抗性与显色表型反应等，再次，载体上至少有一个限制性核酸内切酶的单一识别位点，这样方便了外源基因的插入，最后，要有适当的拷贝数，理论上在一定范围内，拷贝数量越多，越利于载体的制备，所有的基因工程中的表达载体都必须具有以上四个条件。 在这里，我介绍三种载体。 1质粒载体 质粒载体是基因工程中最常用的载体之一，它源于细菌，是一种源于染色体外却可以自由复制的小型环状DNA，大小在1~200Kb之间，质粒通常含有一些编码对细菌有利生存的基因也含有抗生素的抗性基因，经科学家多年的努力，人们终于对一些质粒的生物学特征有了一些了解，进行了比较详尽的研究，比如F质粒那F基因或性质粒，R质粒即抗性因子和col质粒即大肠杆菌因子。 其实，一个质粒就是一个复制子，复制子往往有宿主专一性，但奇怪的是，人们也发现了可以在两种不同宿主内复制的复制子，即可构建的穿梭载体，这种新型载体的发现，大大的推进了克隆

运载体与基因表达载体的区别

运载体与基因表达载体地区别 、不同点： ⑴ “运载体”泛指基因工程操作中能将目地基因送达受体细胞地工具.如细菌质粒等. 相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目地基因这一功能，只要能运输目地基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目地基因.文档收集自网络，仅用于个人学习 ⑵“基因表达载体”，是实施了运输目地基因、并且要保证目地基因到达受体细胞后能够表达地运载体. 这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同. 、联系： “基因表达载体”是在”运载体”地基础上构建成地. 基因表达载体地构成：目地基因启动子终止子标记基因. 、表达载体上地启动子和终止子是本身具有还是后加上去地呢？ 这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人地观点是：这要看获取目地基因地方法，而问题地根源在于基因地结构.关于基因地结构，在新课程标准中也不再做为教学地要求了.文档收集自网络，仅用于个人学习 （人类）结构基因地基本结构：上游非编码区启动子编码区终止子下游非编码区 人类结构基因个区域： ①前导区，位于编码区上游，相当于’末端非编码区（非翻译区）； ②编码区，包括外显子与内含子； ③尾部区，位于’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）； ④调控区，包括启动子和增强子等.基因编码区地两侧也称为侧翼顺序（图－１）. ⑴启动子：启动子（）能促进转录过程.也有人将启动子称为“聚合酶识别位点”. 包括下列几种不同顺序： ① 框（）：其一致顺序为.它约在基因转录起始点上游约处，基本上由碱基对组成，是决定基因转录始地选择，为聚合酶地结合处之一，聚合酶与框牢固结合之后才能开始转录.文档收集自网络，仅用于个人学习 ② 框（）：其一致顺序为，是真核生物基因常有地调节区，位于转录起始点上游约处，可能也是聚合酶地一个结合处，控制着转录起始地频率.文档收集自网络，仅用于个人学习 ③ 框（）：有两个拷贝，位于框地两侧，由组成，是一个转录调节区，有激活转录地功能.文档收集自网络，仅用于个人学习 此外，聚合酶Ⅲ负责转录地和，其启动子位于转录地顺序中，称为下游启动子.文档收集自网络，仅用于个人学习 ⑵终止子：在一个基因地末端往往有一段特定顺序，它具有转录终止地功能，这段终止信号地顺序称为终止子（）.文档收集自网络，仅用于个人学习 终止子地共同顺序特征是在转录终止点之前有一段回文顺序，约核苷酸对.回文顺序地两个重复部分由几个不重复碱基对地不重复节段隔开，回文顺序地对称轴一般距转录终止点.文档收集自网络，仅用于个人学习

真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控

真核细胞常见表达载体 1. pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507 图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域： Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age1 3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

(完整word版)基因表达载体构建

一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。 1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点： （1）结构基因均有调控序列； （2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。 2．不同点： 原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。 真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。 3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点： （1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。 （2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。 （3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。 二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？ 1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。 2．主要环节： （1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达； （2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并

基因表达载体的构建(2)

基因工程（2）---------基因工程的原理及技术 教学要求： （A级，课标要求：1简述基因工程基本操作程序的四个步骤；2、简述目的基因的获得、运载体的构建、目的基因的导入与检测等常用的方法及其基本原理。） 教材分析与教学构想 (1)理论分析：本课时基因工程的基本操作程序是苏教版选修3第一章基因工程中第1节内容。上节课学习了基因工程的概念含义、基因工程的诞生历程、DNA重组技术的基本工具及其作用、特点等内容，本课时要在上节内容的基础上理解基因工程基本操作程序。本课主要的学习任务是：理解基因工程每一步操作的原理、方法和过程，从整体上把握基因工程的全过程，将上节课学习的零散的知识进行归纳，把已掌握的知识系统化。 （2）学情分析：学生通过上节课的学习对基因工程的概念含义、基因工程的诞生历程、DNA 重组技术的基本工具及其作用、特点等有了深入了解，学习本课内容重要的是对基因工程每一步操作的原理、方法和过程做到了理解，同时将零散的知识进行归纳从整体上把握基因工程的全过程，这对学生的思维和方法都是很好的训练。 （3）教学设计构想： 1、巧妙运用插图及多媒体技术，化“抽象”为“形象”。对于基因工程的全过程，学生接触了解的少，只运用文字来教学会感到很抽象。如在讲授如何构建基因文库时，教师会提供一幅非常形象的插图，结合图文提出相应问题，诱导学生思考，从而把学习的注意力从简单的死记硬背引导到分析、批判、创新等有利于学生终身发展的能力上来。 2、巧妙利用概念图串联知识，化“部分”为“整体”。概念不可能单独存在，每个概念都必须根据与之有关的其他概念间的关系才能确定其准确的含义。通过分步探讨，学生已经对基因工程每一步操作的原理、方法和过程做到了理解，但并未从整体上把握到基因工程的全过程，教师可以指导学生构建概念图，将零散的知识进行归纳，把已掌握的知识显性化、可视化，实现新课程有效教与学的策略。 一、自主学习 基因工程操作步骤：. （1）获取目的基因的方法有. （3）基因表达载体的构建关键步骤是，基因表达载体的组成： 。（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。动物常把细胞作为受体细胞。导入植物细胞的方法有等；农杆菌转化法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的上，导入动物细胞的方法有；如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用处理，以增大细菌的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。 （4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用方法，用方法检测目的基因是否转录，用免疫（）法检测目的基因是否表达。另外也可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因； 转基因表达成功的原因是生物。 基因工程的意义：