DL2000 DNA Marker
DL2,000 DNA Marker
使 用 说 明 书 TaKaRa Code：D501A
包 装 量：500 μl（约100次）
浓 度：约400 ng/5 μl
保存温度
4℃（长期保存请置于-20℃）。
制品说明
DL2,000 DNA Marker由DNA片段2,000 bp、1,000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp组成，共6条带。取5 μl DNA加入1 μl的6×Loading Buffer上样电泳时，750 bp的DNA片段量约为150 ng，显示亮带，其余条带的DNA量约为50 ng。 使用注意
1. 电泳时的加样孔宽度小于6 mm时，每次取
5 μl
制品电泳便可得到清晰条带。如果加样孔增宽，
须适当增加Marker制品的加样量。
2. 对DNA电泳而言，Agarose的纯度对DNA条带
的清晰度影响很大。因此，电泳时应尽量选用质
量好的Agarose，推荐使用胶浓度为1％～3%。
3. 进行Agarose电泳时，Agarose的浓度与DNA片
段的分离性能关系密切。Agarose浓度越大，对
短片段DNA分离性能越好；反之，Agarose浓度
越小，越有利于长片段DNA的分离。
V2011.01 AGAROSE ELECTROPHORESIS MAP
彩虹130广谱蛋白marker说明书
彩虹130广谱蛋白marker说明书 货号：PR1950 规格：20T(100μL)/50T(250μL)/100T(250μL×2)/500T(250μL×10) 保存：-20℃保存，有效期至少2年。 产品特点： ●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。 ●用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。 ●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。 产品简介： 本产品包含9种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为15kD-130kD，每种蛋白含量约为 0.2-0.4mg/ml。预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的9条彩色蛋白条带，其中70kD条带为红色，25kD条带为绿色，其余条带为蓝色。 使用说明： 1.本产品是即用型液体，可直接上样电泳。上样前无需加热，稀释或添加还原剂。 2.上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。 3.建议分离胶浓度为15%。 电泳示意图说明： 第1页，共2页
第2页，共2 页注意事项： 1.本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。若冰箱温度不稳，导致结冰，可 适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。 2.Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色 （25KD）及以上条带。如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。 3.转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜 成功，属于正常现象。
亚细胞定位之烟草转化方法
本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法： 一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间： 烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度： 推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
考马斯亮蓝染色套装使用说明
考马斯亮蓝染色套装使用说明 货号：P1305 保存：室温保存，至少一年有效。 规格：100ml+500ml 产品简介： 本考马斯亮蓝染色套装(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的 考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝G-250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western 转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。 产品内容： 考马斯亮蓝染色液100ml 考马斯亮蓝脱色液500ml 说明书1份 使用方法： 1、电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中(至少5倍胶体积)，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 2、将凝胶置于摇床上缓慢摇动，室温染色至少2小时，低丰度蛋白染 色需4小时以上。 3、染色结束后移除染色液，染色液通常可重复利用2-3次，但染色效
果会略有影响。 4、将凝胶浸泡于和染色液等量体积的脱色液中，摇床上脱色4-8小时，期间更换3-5次脱色液。 注意事项： 1.染色时间4小时以上效果最佳。 2.脱色可根据目的蛋白丰度和脱色效果随时终止，或延长脱色时间。 3.脱色越彻底，检测的蛋白量越低，脱色24小时一般可以检测出0.1ug蛋白量。 4.脱色后，将凝胶保存在水中，拍照或扫描保存图像。或制成干胶保存。 相关试剂： P1300-500考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液 PC0020BCA蛋白浓度测定试剂盒 PR1400低分子量蛋白MARKER PR1700预染次高分子量蛋白MARKER I1020IPTG溶液(50mg/ml) A101030%丙烯酰胺(29:1) T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
彩虹245广谱蛋白marker使用说明
彩虹245广谱蛋白marker使用说明 货号：PR1920 规格：20T(100μ1)/50T(250μ1)/100T(250μ1×2)/500T(250μ1×10) 保存：-20℃保存，有效期至少2年。 产品特点： ●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。 ●稳定性能突出，经检测4℃放置两年无明显降解。 ●用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。 ●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。 产品简介： 彩虹245广谱蛋白marker包含12种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为 11kD-245kD，每种蛋白含量约为0.2-0.4mg/ml。预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的12条彩色蛋白条带，其中25kD为绿色条带，75kD为红色条带，其余10条是蓝色条带。 使用说明： 1.彩虹245广谱蛋白marker是即用型液体，可直接上样电泳。上样前无需加热，稀释或添加还原剂。 2.上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。 3.建议分离胶浓度为15%。 电泳示意图说明：
彩虹245广谱蛋白marker经15%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上。 注意事项： 1，本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。若冰箱温度不稳，导致结冰，可适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。 2，Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色（25KD）及以上条带。如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。3，转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜成功，属于正常现象。 相关试剂： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 D106010×电泳转移缓冲液 PR1910彩虹180广谱蛋白marker
4×蛋白上样缓冲液(含DTT)使用说明
4×蛋白上样缓冲液（含DTT）使用说明 货号：P1015 规格：10ml 保存：-20℃保存，建议分装冻存，避免反复冻融，自发货之日起至少12个月有效。 产品简介： 4×蛋白上样缓冲液（含DTT）适用于SDS-PAGE(SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)时作蛋白质上样用。其主要成份为SDS，DTT，溴酚蓝，缓冲盐溶液等。SDS可与蛋白质结合使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，这时蛋白质本身的电荷完全被SDS掩盖，消除了各种蛋白质本身电荷的差异；SDS还可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。DTT可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质结构，消除了蛋白结构之间的差异。最终无电荷及结构上差异的蛋白（亚单位），电泳速度只是与其分子量大小有关。溴酚蓝用作电泳时的指示剂，可大概指示电泳结束的时间。 使用说明： 1、请按每30微升蛋白样品加入10微升上样缓冲液的比例(4倍稀释)来使用。如果蛋白样品浓度过高，可用双蒸水稀释。 2、混匀后，100℃水浴加热5-10分钟，使蛋白变性。 3、冷却至室温后，10000-14000rpm离心2-5分钟，取上清直接上样电泳即可。 注意事项： 4、聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%时溴酚蓝指示条带的位置大概在30kd左右，胶浓度为12%时，约在20kd左右，胶浓度为15%时，大概在10kd。请根据自己目的条带来判断电泳时间。 5、本试剂因含DTT，有一定的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6、蛋白上样缓冲液含有溴酚蓝指示剂，PH值受保存温度影响，在低温冻存状态下，溶液可能会呈现深棕色，不影响产品使用。 相关试剂： P10182×蛋白上样缓冲液（含DTT） P10174×非变性蛋白上样缓冲液 P001210×丽春红染色液 P1300-500考马斯亮蓝快速染色液 P1300SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 PR1700预染次高分子量蛋白MARKER
PH0302-超低分子量蛋白Marker II (3.4-100kD)使用手册
PH0302|超低分子量蛋白Marker II(3.4-100kD) Ultra Low Molecular Weight Protein Marker 货号：PH0302规格：?10T（50ul）保存：Store@-20℃ ◆产品简介 本产品包含5种多肽和3种低分子量蛋白质组成，分子量范围为3.4kD-100kD。可以用来判断SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。 ◆使用说明 第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用；本产品为即用型，融化后既能使用，不能95℃加热处理。 一.制胶： I配制分离胶 1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（19:1）、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合。 2．加入10%APS和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。 3．在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整。4．静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。 表一（一块0.75mm mini胶用量） 分离胶浓缩胶 18％T,5%C/6.0ml5％T,3.3%C/2ml 40%PAA（19:1） 2.7ml/ 40%PAA(29:1)/0.25ml 4×凝胶缓冲液 1.5ml0.5ml 乙二醇（电泳级） 1.8ml/ ddH2O/ 1.25ml 10％APS50-65μl20μl TEMED6μl2μl 注：如非必须，不要使用1.0mm和1.5mm的凝胶，尽量使用厚度0.75mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。 II配制浓缩胶 去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去。 1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（29:1）和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合。
EMSA、CHIP.亚细胞定位
EMSA 实验材料：EMSA探针生物素标记试剂盒（20；1358）；化学发光EMSA检测试剂盒（100；1399）；正电尼龙膜（20；458）；细胞核蛋白提取试剂盒（50；462）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（200；170）；压片暗盒（1个；138）；PMSF试剂（1g;118） 实验方法： 一、探针制备： 1.准备工作： A.取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。 B.取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。如果待标记 的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA 探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA探针浓度为0.5μM。 2.DNA 探针的标记: Ultrapure water 29ul TdT Buffer (5X) 10ul 待标记探针(1μM) 5ul Biotin-11-dUTP (5μM)5ul TdT (10U/μl)1ul 总体积50ul A.参考上表设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管， 即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。 B.用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。 C.加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。 3.TdT 的去除: A.探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分 混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。 B.12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探 针。 4.探针的纯化( 选做) ： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作： A.对于100μl 标记好的探针，加入1/4体积即25μl 的5M醋酸铵，再加入2体积 即200μl 的无水乙醇，混匀。 B.-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。 C.4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。 D.4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干 燥。 E.加入50μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。 5.生物素标记探针标记效率的检测： A.取5μl Biotin-Control Oligo (0.4μM)，加入196μl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 B.取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μl TE，混匀，稀 释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探
次高分子量蛋白质 Marker (43kD-200kD)使用说明
次高分子量蛋白质Marker(43kD-200kD)使用说明 货号：PR1500 规格：10T 保存：-20℃可保存至少六个月。避免反复冻融，建议分装保存。 产品简介： 次高分子量蛋白质Marker包含5种蛋白质混合物，分子量范围为43kD-200kD，每种蛋白的含量约为20ug。经SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色后可以得到分布均匀密度相近的5条带。可以用来判断SDS-PAGE电泳后蛋白质的分子量。 本产品配有一支蛋白上样缓冲液（150ul）。 使用说明： 将两支试剂开启，取110ul蛋白上样缓冲液加入蛋白Marker干粉中，混匀，取出液体，置于 1.5ml离心管中，100℃沸水浴加热5分钟，冷却后根据需要分装成小管，建议每管分装10μl，-20℃贮存，每次取一管使用。 注：如长期贮存后使用，使用前最好取分装后的小管99℃预热3分钟后再上样电泳。 用考马斯亮蓝G-250染色后可见5条蛋白带（见下示意图）。
注意事项： 1.建议分离胶浓度7%，浓缩胶浓度4%，制胶时先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。电泳时，80v电压大约跑1小时后，待指示剂沿到达分离胶上沿时，将电压调至120v，直到电泳结束。整个电泳过程大约需3-4个小时。 2.电泳之后可将胶进行染色观察，如果使用配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，可以选择考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液，具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。 相关试剂： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 P1300-500考马斯亮蓝快速染色液
BCA微量蛋白浓度测定试剂盒使用说明
BCA微量蛋白浓度测定试剂盒 货号：PC0050 规格：500微孔(500T)/1000微孔(1000T)/2000微孔（2000T） 保质期：本试剂盒自订购之日起一年内有效。 产品内容： 包装500微孔1000微孔2000微孔保存 BCA试剂100ml2×100ml4×100ml室温 Cu试剂3ml6ml12ml室温 PBS稀释液30ml60ml120ml室温 BSA蛋白标准 0.3ml0.5ml1ml-20℃ (5mg/ml BSA) 产品简介： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。 操作说明： 一.微孔酶标仪法 1.配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工
作液室温24小时内稳定。 2.稀释标准品：先用PBS将BSA标准品稀释至终浓度为0.8mg/ml备用。再依次稀释至80、40、20、10、5、2.5ug/ml.。 3.高浓度蛋白可将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。 4.各孔加入200微升BCA工作液和40ul稀释后的蛋白或标准品溶液，对照孔加入PBS稀释液。37℃放置4小时。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。 二.分光光度计法 如没有酶标仪，在离心管中混匀样品后加入比色皿，用分光光度计比色。 采用分光光度计测定蛋白浓度方法与酶标仪法相似，只需要按照分光光度计比色皿容量要求按照比例配置相应的BCA工作液和标准品溶液。 常规比色皿用量为200ul有样本加入1mlBCA工作液或400ul样本加入2mlBCA工作液。微量比色皿用量为20样本加入100ul BCA工作液。或根据仪器情况自行调整。 附：样本及标准品稀释示意图 样本管号A B C D E PBS稀释液用量180100100100…… 标准品用量20（原液） 100 （从A管吸出） 100 （从B管吸出） 100 （从C管吸出） …… 终浓度（ug/ml）80402010…… 注意事项：
蛋白标准品(Marker)知识汇总
蛋白Marker可分为：一、未预染的Marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Marker即单色预染和多色预染。 在western blot 过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个Western Blot 参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。 总体来说，蛋白分子量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。以下是关于蛋白分子量标准的小叙： 一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量标准 未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker 使用上不如预染Marker(pre-stained)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才―开蛊‖，无法对实验起预示参照作用。完全属于―后知后觉‖型的，当然还是比―不知不觉‖不做对照的要好。 ①宽分子量蛋白标准
WoLF PSORT 蛋白亚细胞定位预测
Nucleic Acids Research,2007,Vol.35,Web Server issue W585–W587 doi:10.1093/nar/gkm259 WoLF PSORT:protein localization predictor Paul Horton1,Keun-Joon Park1,2,Takeshi Obayashi3,Naoya Fujita1,3, Hajime Harada1,C.J.Adams-Collier4and Kenta Nakai3,* 1Computational Biology Research Center,AIST,Tokyo,Japan,2Center for Genome Science,National Institute of Health,Korea Center for Disease Control&Prevention,5Nokbeon-Dong,Eunpyung-Gu, Seoul122-701Korea,3Human Genome Center,Institute of Medical Science,University of Tokyo,Tokyo,Japan and4Collier Technologies,Everett,WA,USA Received January30,2007;Revised March26,2007;Accepted April8,2007 ABSTRACT WoLF PSORT is an extension of the PSORT II program for protein subcellular location prediction. WoLF PSORT converts protein amino acid sequences into numerical localization features; based on sorting signals,amino acid composition and functional motifs such as DNA-binding motifs. After conversion,a simple k-nearest neighbor classifier is used for https://www.wendangku.net/doc/d42670388.html,ing html,the evidence for each prediction is shown in two ways: (i)a list of proteins of known localization with the most similar localization features to the query,and (ii)tables with detailed information about individual localization features.For convenience,sequence alignments of the query to similar proteins and links to UniProt and Gene Ontology are provided. Taken together,this information allows a user to understand the evidence(or lack thereof)behind the predictions made for particular proteins. WoLF PSORT is available at https://www.wendangku.net/doc/d42670388.html, INTRODUCTION Bilipid membranes divide eukaryotic cells into various types of organelles containing characteristic proteins and performing specialized functions.Thus,subcellular localization information gives an important clue to a protein’s function.Although localization signals in mRNA appear to play some role(1),the main determi-nant of a protein’s localization residues in the protein’s amino acid sequence.(We recommend https://www.wendangku.net/doc/d42670388.html,/wiki/ Protein_targeting for a brief overview and Alberts et al. (2)for a textbook description.) Numerous experiments to determine protein localiza-tion have been performed to date.These can broadly be classi?ed as:small-scale experiments—the results of which continue to accumulate in public databases,such as UniProt(3)and Gene Ontology(4);and large-scale experiments using epitope(5)or green?uorescent protein (GFP)(6)tagging,or by separation of organelles by centrifugation combined with protein identi?cation by mass spectrometry(7,8). Although they provide invaluable information,the coverage of experimental data is only high for model organisms,particularly yeast.Moreover,the agreement amongst large-scale experimental data is only75–80% (6–9).Thus,computational prediction of localization from amino acid remains an important topic. Numerous computational methods are available [reviewed in(10,11)].Some(including WoLF PSORT) have recently been benchmarked by Sprenger et al.(12), who found the computational methods to be useful for sites,such as the nucleus,for which many training examples can be easily obtained from UniProt(which is the source of most or all of the training data for most prediction methods—including WoLF PSORT).The di?erent methods they benchmarked were found to have di?erent strengths.Here,we describe the public server for our WoLF PSORT method. PREDICTION METHOD WoLF PSORT is an extension of PSORT II(13,14)and also uses the PSORT(15)localization features for prediction.In addition,WoLF PSORT uses some features from iPSORT(16)and amino acid composition.Those features are used to convert amino acid sequences into numerical vectors,which are then classi?ed with a weighted k-nearest neighbor classi?er.WoLF PSORT uses a wrapper method to select and use only the most relevant features.This reduces the amount of information which needs to be considered(and displayed)for the user to interpret individual predictions and may also make the predictor less prone to over learning.The prediction method has described in more detail elsewhere(17). *To whom correspondence should be addressed.Tel:t81-3-5449-5131;Fax:t81-3-5449-5133;Email:knakai@ims.u-tokyo.ac.jp ?2007The Author(s) This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License(https://www.wendangku.net/doc/d42670388.html,/licenses/ by-nc/2.0/uk/)which permits unrestricted non-commercial use,distribution,and reproduction in any medium,provided the original work is properly cited.
蛋白质的亚细胞定位的预测
蛋白质的亚细胞定位的预测 关于蛋白质的亚细胞定位的预测，In general，预测方法分为3个步骤。首先，为每一类亚细胞locations构建客观而具有代表性的数据集。其次，从数据集中提取特征参数或descriptor。最后也是最关键的一步，通过算法比较查询序列中所包含的特征参数与各类相应的location 的相似度，作出判断，一般会用一组概率的形式来表述。很明显，其中大量运用的是机器学习理论和统计学的方法。对算法有兴趣的朋友可以参考下面这一篇综述，“An overview on predicting the subcellular location of a protein” In Silico Biology 2002 http://www.bioinfo.de/isb/2002/02/0027/main.html 以下是该综述中涉及的部分server，都是比较经典的。 PSORT：http://psort.nibb.ac.jp By amino acid composition information and sorting signal knowledge TargetP：http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ By discriminating the individual targeting signal peptide MitoProt：http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html By discriminating mitochondrial and chloroplast signal peptide Predotar：http://www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar/ By discriminating mitochondrial, chloroplast signal peptide NNPSL：https://www.wendangku.net/doc/d42670388.html,/nnpsl By amino acid composition SobLoc：https://www.wendangku.net/doc/d42670388.html,/SubLoc/ By amino acid composition SubLoc: https://www.wendangku.net/doc/d42670388.html,/SubLoc/ By more sequence information besides the amino acid composition 一篇文献：https://www.wendangku.net/doc/d42670388.html,/papers/2003_loci_3dnet/paper.html “Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information”
亚细胞定位实验protocol
亚细胞定位 Confocus 一、实验材料 玻片，镊子，75%酒精，细胞转染用物品，PBS，4%多聚甲醛，Trixon-X-100，铝箔，摇床，DAPI染色液，荧光封片液，指甲油，载玻片，激光扫描共聚焦显微镜（型号：ZEISS LSM 510 META），光盘 二、实验原理 亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位，如胞核，胞浆内，细胞膜或某一特定细胞器上存在。通常是将目的蛋白与报告基因（如绿色荧光蛋白基因EGFP、红色荧光蛋白基因Dsred等）融合表达，在激光共聚焦显微镜下观察荧光的表达部位从而致使目的蛋白在细胞内的定位。 DAPI，4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有高度的亲和力，与DNA结合后会发出强烈的荧光。 激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。 三、操作程序与结果判定（结合自己的经验将可能遇到的问题 及解决办法也列出） 1、细胞爬片的处理（24孔板） 细胞爬片可以买专门的爬片（一般直径1cm的正方形玻片正好适合24孔板的大小）用镊子夹取后在酒精灯上过火后轻轻放入细胞板内。此后再接入适量消化好的细胞。 爬片处理：将玻片放入小烧杯，再加浓硫酸处理。处理完后，用ddH20洗。再泡到75%酒精里。
低分子量蛋白质Marker(14.4kD-97.4kD)使用说明
低分子量蛋白质Marker（14.4kD-97.4kD)使用说明 货号：PR1400 规格：20T 保存：-20℃可保存至少一年。避免反复冻融，建议分装保存。 产品简介： 低分子量蛋白质Marker包含6种蛋白质混合物的冻干粉，分子量范围为14.4kD-97.4kD，每种蛋白的含量约为20-30μg。经过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳后，用考马斯亮蓝染色可以得到分布均匀密度相近的6条带。可以用来判断SDS-PAGE电泳后蛋白质的分子量。 使用说明： 1.开封后，溶于400μL体积的1×蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂），于沸水浴中加热5分钟，冷却后可根据需要进行小量分装，每管20μL，-20℃贮存，每次取一管使用。 2.如长期贮存后使用，使用前最好取分装后的小管沸水浴预热3-5分钟后再上样电泳，用考马斯亮蓝G-250染色后可见6条蛋白带(见下示意图)。 注意事项： 1.建议分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，制胶时先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。电泳时，80v电压大约跑1小时后，待指示剂沿到达分离胶上沿时，将电压调至120v，直到电泳结
束。整个电泳过程大约需3-4个小时。 2.电泳之后可将胶进行染色观察，如果使用配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液，该试剂具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。 相关试剂： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） P10164×蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂） T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 P1300-500考马斯亮蓝快速染色液
蛋白亚细胞定位方法
1.挑单克隆斑加到30ml LB中，加AMP。37℃摇过夜。 2.分别取15ml菌液加到1L的LB中，加AMP，继续在37℃下摇至OD600=0.5-0.6,严格 控制OD。 3. 加IPTG，使终浓度达到0.2mM , 18℃摇过夜。 4. 在4℃下以7700 × g (e.g. 8000 rpm)离心10min. 5. 弃去上清，放在冰上。 6. 加入30~50ml ice-cold 1× PBS，用移液器悬浮细胞。 7. 用超声波超生。取一部分超生后的产物用SDS-PAGE检测。 8. 向溶液中加入20%的Trion x-100，使终浓度达到1%。Mix gently for 30 min to aid in solubilization of the fusion protein。应该是在冰上。 9. 10 000 rpm 离心for 10 min at 4 °C. 转移上清到一个新的容器中。 1× PBS (ice-cold): Dilute 10× PBS with sterile H2O. Store at 4 °C. 10× PBS is 1.4 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7.3. 1×PBS is 140 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 1.8 mM KH2PO4, pH7.3 1L, 1×PBS配方如下：称取NaCl 8.18g; KCl 0.2g; Na2HPO4.12H2O 3.58g ; KH2PO4 0.245g 溶于800ml水中，用HCl调节PH=7.3，最后加蒸馏水定容至1L,高温高压灭菌。
Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明
Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明 货号：PC0010 规格：2500T 保存：开封使用后请密封保存，本试剂盒自订购之日起九个月内有效。 产品内容： 组成包装（2500微孔)保存 5×G250染色液100ml2-8℃ PBS稀释液30ml2-8℃ 蛋白标准(5mg/ml BSA)1ml-20℃产品简介： 考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm变为595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS的浓度低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween20,60,80低于0.06%。 操作说明： 一．微孔酶标仪法 1.完全溶解蛋白标准品，取10ul，稀释至250ul，使终浓度为0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
2.5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取1ml5×G250染色液，加入4ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。 3.将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20微升。 4.将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。 5.各孔加入200微升稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟。 6.用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。 7.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。 二．分光光度计法 如无酶标仪，染色反应可在离心管中进行，反应液混匀后加入比色皿中，使用分光光度计测定吸光值。 步骤如下： 1.取八支（或者更多）干净的10ml离心管，标记上号。 2.取100ulBSA加入PBS2.4ml稀释至终浓度为0.2mg/ml。 3.5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取10ml5×G250染色液，加入40ml 双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。 4.按下表加入试剂(以每孔5ml计，多余的用来清洗比色皿)
中分子量蛋白Marker
中分子量蛋白Marker I 使 用 说 明 书 包 装 量： 浓 度：每种蛋白约0.1－0.2mg/ml 在1×loading Buffer 储运温度：收到产品后分装冻存，避免反复冻融降解蛋白，-20℃ (长期保存请置于-70℃ )(用于小胶5μl/次 可用20次 用于大胶10μl /次 可用10次) 制品说明：本产品是由6种蛋白质分别纯化后混合而成的蛋白质溶液，分子量范围为14KD －94KD ，经SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用考马斯亮蓝R －250（Coomassie Blue R-250）染色后可得清晰的7条蛋白带。建议使用分离浓度为12%～15%。 适用胶浓度：最优适用于12% (37.5:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶。 该Marker 也可用于8-15%的胶。胶浓度为8-10% 时蛋白Marker 中低分子量的蛋白易于同染料前沿跑在一条线上不易区分，在12-15%的胶上及梯度电泳中，所有的条带都能锐利清晰分开。 推荐上样量： 上样量 胶厚度大小 5μl 0.75mm thick mini 10μl 1.5mm thick mini 0.75mm thick large 20μl 1.5mm thick large 操作步骤： 1. 室温融解Marker 或37- 40°C 温浴几分钟使之融解，混匀均一，不要高温加热。 2. 为避免污染最好分装保存以备使用，取所需体积的Marker 置于一干净离心管中并封好口。 3. 上样并进行 SDS-PAGE 电泳。
4.该Marker适用于考马斯亮蓝, 银染或其他蛋白染色方法。 注意：银染比考马斯亮蓝染色敏感度高10～100 倍，相应的银染需要减少用量。 5.变性蛋白Marker储存于-20°C。 6.在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中不要使用该Marker，因为在该Marker的储存缓冲液中存在SDS。 质量检测： 5μl 的该Marker 用于12% 的凝胶进行SDS-PAGE电泳(mini gel)并用考马斯亮蓝R-250染色,能得到6条亮度相同的锐利条带。 NOT FOR HUMAN OR DRUG USE