杀菌率试验规程

Q/KM—ZJ——2008

液体洗涤剂杀菌试验规程

（内部使用）

2008年月日内部执行

质量管理中心实验室

引用标准

1、GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准

2、QB/T2738-2005 日化产品抗菌抑菌效果的评价方法

3、QB/T2850-2007 抗菌抑菌型洗涤剂

4、 2002年版《消毒技术规范》 (中华人民共和国卫生部)

5、2001年版《药品微生物学检验手册》（科技出版社）

杀菌率试验规程

1、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度

试验菌种：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），大肠杆菌（8099或ATCC 25922），白色念珠菌。

试验温度：20℃±1℃。

作用时间：最短不得小于30s。常规作用时间为2min、5min、10min、20min。

试液浓度：中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。

菌悬液用量：正式杀菌试验用菌悬液的浓度、取量应与中和剂鉴定中1组、2组所用菌悬液的浓度、取量相同。

2、细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序：

2.1菌悬液的制备

⑴取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物（放在4℃左右冰箱中保藏。每隔2-3个月移种一次，继续保藏。）。

⑵取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用 5.0ml吸管吸取

3.0ml-5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80次（力度适中，勿溅出），以使细菌悬液均匀。或从新鲜菌种斜面沾取少量菌苔，接种在适合试验菌生长的培养基中，37℃培养18h～24h（或适宜时间）。作为原菌液。（源于《药品微生物学检验手册》211页）

⑶细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱备用。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。应当天使用不得过夜。

回收菌数为1×104～9×104 cfu/ml 用PBS液配置GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准》

回收菌数为1×108—5×108cfu/ml用TSB营养肉汤配置—2002 《消毒技术规范》

2.2、菌片的制备程序：《消毒技术规范》

⑴取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。

⑵取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用 5.0ml吸管吸取

3.0ml-5.0ml TSB营养肉汤加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一

无菌试管中，在手掌上振敲80次，以使细菌悬液均匀，含菌量1×108—5×108cfu/ml。

⑶用无菌镊子夹住已灭菌10mm*10mm滤纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平板内，37℃温箱中干燥20min-30min，（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。每个菌片回收菌落，按活菌培养计数所得结果，应为5×105—5×106cfu/片。）

⑷细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在4℃冰箱内。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。（应当天使用不得过夜。）

3、操作程序

3.1、悬液定量法杀菌试验操作程序

⑴、样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释液）试验样液。

⑵、将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。

⑶、配制菌悬液，浓度为1×104～9×104cfu/ml—GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》或1×108—5×108cfu/ml—2002 《消毒技术规范》

⑷、取杀菌试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置20±1℃ 5min，用无菌吸管吸取步骤1中的试验样液4.0ml注入其中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。-见《消毒技术规范》或吸取试验用菌悬液0.1ml，加入到含5ml样液的试管中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。-见QB/T 2738-2005

⑸、作用2min、5min、10min、20min，即刻用无菌吸管吸取0.5ml移入鉴定合格的4.5ml中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用10min后，取样液、10倍系列稀释液0.5ml（见GB15979-2002）或分别吸取1.0 ml （-见《消毒技术规范》）（见图四），置于2个灭菌平皿，用凉至40～45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2℃培养48h（细菌）或（酵母菌）25℃±2℃培养72h，作活菌菌落计数。

⑹、同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。

⑺、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。

⑻、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。

⑼、试验重复3次，求其平均值。根据各组活菌浓度（cfu/ml），计算杀菌率，见计算公式1。或根据各组活菌浓度换算为对数值（N），计算杀灭对数值，见计算公式2。

3.2 载体法杀菌试验操作程序

⑴、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。

⑵、吸取样液5.0ml放入灭菌平皿，另吸取PBS 5.0ml注入平皿中，作为阳性对照皿。每皿用无菌镊子

夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。

⑶、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含5.0ml中和剂的试管中（中和剂的浓度

与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。(见图三)

⑷、中和10min后，取样液或10倍系列稀释液1.0ml（（见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至40～

45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml，转动平皿10-20下，使其充分均匀，凝固后，于35℃±2℃培养48h（细菌）或72h（酵母菌），作活菌菌落计数。

⑸、试验重复3次，求其平均值。

⑹、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。

A、PBC液（0.03mol/L磷酸盐缓冲液）、

B、无菌标准硬水1ml置于灭菌平皿内、

C、空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml培养。

⑺、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。

4、计算公式

1、杀菌率X1＝（A － B ）/ A ×100%

式中：X1—杀菌率（%）；

A--对照样品平均菌落数；

B--被试样品平均菌落数。

2、杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度的对数值（Nx）

备注：计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。

5、评价标准

杀菌率≥90%，产品有杀菌作用。

悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值≥5.00，可判定为消毒合格。

6、操作要点：（消毒技术规范2002版）

1、对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂

溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）；

3、在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物

接触过久。

审核：编制：

中和剂悬液定量鉴定试验操作程序

引用标准：QB/T2738-2005 日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在1×104—9×104cfu/ml）GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在1×104—9×104cfu/ml）

2002 消毒技术规范（试验菌悬液在1×107—5×107cfu/ml）

一、定义和术语

中和剂—在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。

中和产物—中和剂加杀菌剂（样品）=9：1，作用10min配置而成。

二、中和剂鉴定试验原理

中和剂鉴定试验原理

三、中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法

四、1鉴定试验操作程序

四、2 鉴定试验操作程序

四、3 鉴定试验操作程序

七、消毒剂的常用中和剂的配置

1、用于氯型杀菌剂（有效氯0.1-0.5%）：硫代硫酸钠

2、用于非氧化型杀菌剂：

a：磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂10.0g、甘氨酸10.0g、吐温-80 30.0g、蒸馏水1000ml

b：磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂3.0g、吐温-80 20.0g、蒸馏水1000ml

3、用于氧型杀菌剂：吐温-80 20.0g、硫代硫酸钠10.0g、PBS1000ml、

4、阳离子胍类消毒剂：卵磷脂3.0%、吐温-80 3.0%的PBS溶液

5、季胺盐类消毒剂（0.1-0.5%）：吐温-80 +卵磷脂（1.0-2.0%）

6、酚类（DP-300）消毒剂（3.0-5.0%）：吐温-80 （0.5-3.0%）

7、复方消毒剂：吐温-80 +卵磷脂+硫代硫酸钠

8、过氧乙酸（0.1-0.5%）：硫代硫酸钠（0.1-1.0%））

9、过氧化氢（1.0-3.0%）：硫代硫酸钠（0.5-1.0%））

八、附悬液定量杀菌试验示意图、载体法试验杀菌率示意图

审核：编制：质量管理中心谷爱军

细菌悬液+有机干扰物质= 1：1

图一、

置20±1℃ 5min后

1ml 1ml

图二、阳性对照管

注入样液4ml 注入稀释液

吸取0.5ml混合液加入4.5ml经灭菌的中和剂中，充分混匀作用10min，培养。

10min

中和剂

A

10-0 10-1 10-2 10-2 10-1 10-0

悬液定量杀菌试验示意图

《消毒技术规范》

细菌悬液

图一、

取10ul滴在10mm×10mm无菌滤纸上，干燥、制成菌片

（回收菌数为1×104～9×104 cfu/片-GB/T15979）

（回收菌数为5×105—5×106cfu/片—消毒技术规范）

吸取样品稀释液PBS 5ml作为阳性对照管

放入一菌片放入一菌片

作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片，投入各含5.0ml中和剂的对应管中。