几种分子生物学方法在真菌中的应用
[收稿日期] 2002-01-21;2002-03-13修回
[基金项目] 贵州省自然科学基金资助(95097B -146)
[作者简介] 熊 庆(1977-),男,在读硕士研究生,主要从事虫草的分子分类研究。 *通讯作者,现为贵州省农业科学院院长。
【专论与综述】
[文章编号]1001-3601(2002)03-0080-0069-05
几种分子生物学方法在真菌中的应用
熊庆1,刘作易1,2*
(1.贵州大学生物技术学院真菌资源研究室,贵阳550025; 2.贵州省农业科学院,贵阳550006)
Studies an d Application of Several Molecu lar Biological Techniqu es on Fungi
XIONG Q ing ,LIU Zuo -yi
(https://www.wendangku.net/doc/d84484501.html,boratory of Entomogenous Mycology o f Guizhou University ,Guiy ang 550025;
2.Guizhou Academ y o f Agricultural Sciences ,Guiyang 550006,China )
[关键词]真菌;应用;RF L P;RA PD ;A FL P [中图分类号]Q 7[文献标识码]A 真菌在地球上分布广泛并与人类的生活密切相关,因此长期以来,真菌学家都在为探寻它在自然界中的分类地位及阐明它的系统进化关系、谱系发生历史而努力,使人类能最大限度地利用其为自身服务。但由于真菌形态构造和繁殖方式较原核生物复杂、多样,与高等植物相比形态结构则又简单,因此其分类既不同于原核生物也不与高等植物相似。
1 研究意义
传统的真菌分类学主要是根据真菌的微观形态特征及其生理生化特点建立起来的,它是基于真菌物种的表型特征的比较分析来判断它所处的分类地位以及真菌中不同种之间的相互亲缘关系。真菌的表型特征较为复杂,有许多真菌属于复型真菌,如虫草属真菌,在它们的生活史中具有无性型(anamor ph)的分生孢子阶段和有性型(telemor ph )的子囊孢子阶段;而有的真菌,有性型和无性型个体会出现分离现象,生活史的复杂性和形态上的多样性使得对这些真菌的鉴定和分类非常困难。并且任何物种的表型特征都是基因型与环境相互作用的产物。基因型相同的个体在不同的环境下发育,可能会出现显著的表型差异,这给真菌的分类和谱系分析带来很多困难和不确定性。随着生物技术的进步以及一些相关学科的发展,人们需要对真菌进行更为合理的分类和鉴定,以加深人类对真菌的了解及利于真菌资源的利用和开发。分子生物学技术的兴起,使得传统的真菌分类学建立近乎于自然的分类系统的最终目的被进一步拓展,它将真菌的基因型特征用于分类和系统学研究,从遗传本质上揭示真菌的亲缘关系并对其进行分类鉴定,极大地促进了真菌分类学及相关学科的发展。
2 分子系统学的研究方法
分子生物学技术的兴起给真菌的分类学及系统
学的发展以巨大的推动力,一些已经或即将用于真菌分类研究的分子生物学技术指标日渐显示出重要的分类学意义[1]。在对真菌的分子系统学研究中,以核酸和蛋白质等分子生物学性状用来探索真菌的种、属、科、目、纲、门等各级分类阶元的进化和亲缘关系应用日趋广泛,弥补了传统分类的不足,使人们对真菌的分类及系统发育的认识更接近于客观实际,为真菌的分子分类的研究开辟了前景。现把当前应用于真菌分类研究的一些主要方法介绍如下。2.1 核酸杂交技术
核酸分子杂交技术是研究真菌分类和系统发育及进化的有力工具和较有说服力的手段之一。核酸分子杂交技术可探讨真菌D NA 分子中碱基序列的同源程度,以此来表明同一属内各种间和属间的亲缘关系的远近。在真菌中,用整个基因组进行的核酸分子杂交,除近似种外,其余的序列同源性都较
低[2、3]
。因此,基因组杂交主要用于亲缘关系较近的种或种内不同分离株之间的鉴定[4,5]。同种异株真菌基因组DN A 序列差异较小(在35%以内)[6]。Vang -han 等人将这一项研究应用于对酵母菌的鉴定中,发现啤酒酵母、贝酵母、薛瓦酵母、意大利酵母、葡萄汁酵母的DN A -DN A 重结合表现出90%的碱基序
列是相同的,所以他们认为后4个种应该归并为啤酒酵母[7]。在对属或属以上水平的分类则采用DN A -r RN A 杂交,这是因为rR NA 在进化过程中更为保守。当前核酸分子探针杂交这一技术已广泛用于真菌的分类领域。它是根据互补碱基顺序配对的原理,将分子量较大的无放射性单链DN A ,与分子量较小的放射性单链D NA 或RN A (探针),在最适杂交条件下,使其互补碱基之间形成氢键,然后洗脱未配对的标记DN A 或RN A 片段,通过放射性测定,得到它们之间的杂交百分率。真菌核酸探针分子可分为两类:种特异性探针和多态性探针。种特异性探针的作用主要是鉴定真菌菌种,适用的范围不大。
贵州农业科学 2002,30(3):69～73 Guizho u A g ricultural Sciences
而多态性探针在这几年来则发展迅速,有基因组DN A多态性探针、rDN A多态性探针、线粒体DN A (mtDN A)多态性探针、微卫星重复序列DN A探针等。近年来该技术又与聚合酶链式反应(Poly merase Chain Reaction,P CR)技术结合,成为对真菌不同属种及种以下单元进行鉴定诊断的一项有力工具。
该方法的缺陷是结果不易分析,研究中需要两两比较,相关物种的不同研究的结果不易比较。2.2 限制性片段长度多态性技术(r estrict ion fr ag-ment leng th po ly mor phism,R FL P)
RF L P是80年代中期发展起来的一种DN A多态性分析技术。多态性研究是在种、种内以及种群水平上进行分类研究的有效手段[8]。其基本原理是不同种、种内以及种群的D NA序列在进化过程中发生突变,造成限制性位点的插入、缺失、重排或点突变。因此,当将目标真菌的DN A序列经一定数目和种类的限制性内切酶(RE)进行酶切时,由于不同的目标真菌DN A序列结构有差异,内切酶在其上的识别位点的数目和距离就发生了改变,因而产生相当多的大小不等的DN A片段,在进行凝胶电泳时,它们由于迁移率不同形成不同的带,通过与克隆的DN A探针进行Southern杂交和放射自显影后,即产生和获得反映生物个体特异性的RFL P图谱。
这项技术的应用在真菌研究中较为普及,如Fo rster[10]等利用RF LP技术对疫霉属(P hy top hthor a)真菌的6个种的线粒体DN A进行了多态性分析,发现这项技术不仅可以区别种,甚至可以区别来自不同地理环境和寄主的种以下的分类单元——亚群。通过对线粒体D NA限制性片段多态性分析,Cr of t[11]等人对曲霉属(A sp erg illus)的两个种A.j a p onicus与A.aculeatus的分子特征与表型特片之间的关系作了分析,经过研究,他们将A. j ap onicus与A.aculeatus的菌株分成7个不同的线粒体DN A的酶切片段群,并由此证明线粒体DN A 的RF L P的分析在对黑曲霉的野生型分离株的特征界定上是一个非常有用的分析工具。
由于RF LP分析数据多态信息量大,结果稳定可靠,重复性好,不受环境及菌株发育阶段影响;只要有探针就可检测不同菌种或菌株的同源DN A分子的RF L P,对于真菌种间亲缘关系的研究特别有用;同时限制性内切酶的种类很多,可选择各种不同的限制性内切酶使RF L P充分表现出来,这些特点使RF L P成为一种十分重要的遗传标记。用随机克隆的D NA探针还可以检测到一定水平的R FL P变异,这对于检测真菌种内及种间的变异是十分有用的[9]。
传统的DN A限制性片段长度多态性研究方法对样品纯度要求较高,而且D NA杂交膜和探针的准备以及杂交过程都较为繁杂,加之,它不能检测靶序列中的重复序列区,其多态性检测水平过分依赖于所选用的限制性内切酶种类和数目,由于不同的限制性内切酶识别位点的进化速率不同,因此,对于不同的进化靶序列,如果选样不当就会导致分析结果出现偏差。近年来,将R FL P技术与其它分析技术如P CR技术结合起来使用,部分克服了上述缺点,实现了不需要杂交和放射性标记的R FL P分析,同时由于P CR技术的使用,使人们可以随意对真菌菌株的DN A的不同区段进行研究,这就使得对真菌的多态性分析变得快捷简便。但实际上,RF LP还存在着分析困难(片段太多),准确性不够(在对菌株进行研磨提取DN A时,DN A会发生剪切)等不足之处,因此在应用RF LP进行研究时,应再结合其它方法,力求作到结果准确。
2.3 微卫星DN A指纹图谱分析技术
DN A指纹技术(D NA fing erprinting),是一种在单一实验中可检测出大量DN A位点差异性的分子生物学技术。微卫星DN A指纹图谱分析技术是利用卫星DN A作探针,探测不同生物的卫星区,产生相应的DN A指纹图谱的杂交方法。不同生物、同一生物的不同品种,甚至同一品种的不同个体,其所含小卫星各异,杂交产生的DN A图谱各不相同,就像人的指纹一样,所以,把这种具有个体特征和种属特性的DN A图谱称之为DN A指纹图谱。
在真核生物的基因组中,除了编码蛋白质的单拷贝序列以外,还有中度重复序列以及高度重复序列存在。高度重复序列中又存在有由短的串联重复单位组成的序列称为串联重复序列(V NT R),其中串联重复序列又分为两种类型:小卫星D NA (minisatellite)和微卫星D N A(simp le sequence r ep eat,SSR,micr os atellite)。小卫星DN A是一些重复单位在11～60bp、总长度从几百到几千个碱基组成的串联重复序列,它主要存在于近端粒处,它在不同个体间有串联数目的差异,而微卫星DN A则是一类由几个核苷酸(一般为1～5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列,同一类的微卫星D NA可分布于整个基因组的不同座位上,它们由于重复数不同,而且重复单位的序列也可能不完全相同,从而造成了每个座位的多态性。微卫星DN A的重复在基因组的进化中起着非常重要的作用[12],已日益成为基因组分析和分子进化研究的普遍工具。微卫星位点序列简短,其两侧的序列多是相对保守的单拷贝序列,因此可根据某一单位点微卫星两侧的序列设计一对特异性的引物,通过P CR技术将其从基因组DN A中特异性地扩增出来,再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物,比较扩增产物的长短变化,进行基因组DN A之间的多态性分析。
微卫星DN A在基因组中多态性高,并且等位基因数目多,呈等显性遗传,其指纹图谱有极高的多态性,结果稳定可靠,重复性好,适用于任何真核生物的系统进化研究。但是,微卫星座位突变率高,对变异反应灵敏,所以容易受到趋同变异引起的平行演化(ho moplasy)程度的影响,从而给物种间亲缘关系的评估带来误差[13]。
2.4 随机扩增多态性D NA(Ra ndomly a mplified polymo rphism DN A,R AP D)
随机扩增多态性D NA(R AP D)技术是利用一系列不同的随机排列的10个碱基组成的寡核苷酸单链为引物进行PCR扩增,使基因组DN A的多态性充分展现出来。RA P D分析可在所有的生物的基
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因组中进行,所需样品量少,并且RA P D技术可在事先未知DN A序列的情况下检测基因组中存在的多态性,极大地拓展了对基因DN A变异的研究。这一方法适于真菌各分类单元的分类学研究。因为真菌基因组庞大,许多基因操作技术只能了解其局部情况,而RA PD却能对整个基因组序列做大致地分析,并且RA PD技术可以在一次反应中检测基因组的多个位点,能快速寻找两组或多组D NA样品间的多态性,并以此进行DN A分子水平的标记,与RF L P相比,RA PD技术大大减少了多态性分析的预备性工作,如制备克隆、同位素标记等,从而简化了技术过程及所需要的条件[14]。
该技术在真菌分类中已得到大量应用,Hamelin 等[15]用R AP D鉴定了禾顶囊壳(Gaeumannomy ces gr aminis)的亚种,发现欧洲亚种同北美洲亚种具有相同的遗传图谱,从而证实了北美洲亚种是由欧洲引入北美大陆的。此外,W aw er等[16]应用这项技术对Cop r inus p sy chr omobidus的23株菌株进行分群和鉴定。L eal[17]用R A PD鉴定了20株金龟子绿僵菌,发现一些菌株可表现出明显的地理型,而另一些不同来源的菌株则不表现出地理型差异。李增智等[18]利用RA PD-PCR技术检测了3种白僵菌(球孢白僵菌、布氏白僵菌、粘孢白僵菌)及球孢白僵菌的种内变异,结果表明菌株间的多态性与种间的多态性相比要差很多,而来自同一野生型出发株之间与其分离株之间差异更小。从RA PD应用的大量事例来看,该技术是一项很有价值的分子标记技术。但是它也存在着一些难以克服的缺点,如:RA PD标记为显性标记,其在结果分析中的序列同源假设(长度相等的扩增片段视为同源性片段)可能会高估不同样本间的亲缘关系[19];RA P D还极易受反应条件的影响,不同实验室和不同实验条件下的结果难以重复,并且RA PD的单带有可能是多个分子的混合物等[20]。
由于上述一些应用上的缺点,目前有人认为RA PD技术在应用于种间乃至近缘属之间亲缘关系的研究时有一定的局限性[21],因此这项技术还需要进一步地完善。
2.5 扩增片段长度多态性技术(amplified frag ment leng th polymo rphism,A F L P)
A FL P技术是于1993年发明的一种选择性扩增限制性片段的分析方法,它的出现是对现有分子指纹技术的重大突破,它不仅是R FL P和PCR相结合的一种技术,而且兼具了R FL P和R AP D两种技术的优点。其特点是多态性丰富,共显性表达,不受环境影响,无复等位效应,而且还具有带纹丰富,用样量少,灵敏度高,快速高效等特点。目前,这项技术正逐渐在真菌的分类及系统学研究中得到重视。
A FL P技术的基本原理是对真菌基因组DN A 限制性酶切片段进行选择性扩增,目的DN A经可产生粘性末端的R E(限制性内切酶)酶切,产生的片段被连接上通用接头,连接产物作为PCR扩增的模板,引物是在接头互补顺序和RE识别位点的基础上增加1～3个选择性核苷酸设计而成的。这样,只有那些与引物的选择性碱基严格配对的酶切片段才被扩增出来,通过调整引物3′端选择碱基的数目可获得丰富的多态性。该技术的独到之处在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接头以及可与接头序列配对的专用引物,因此在不需要事先知道D NA 序列信息的前提下,就可对酶切片段进行传统的PCR扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶(P FG E)电泳显示。在实验过程中,为了使酶切片段大小分布均匀,大都采取两个限制性内切酶,一个酶为多切点,另一个酶的切点数较少,因此AF L P反应过程中产生的主要是两个酶共同酶切的片段。此外,设计的引物除了核心碱基序列和限制性内切酶识别序列以外,引物的3′端还延伸出1～10个数量不等的随机核苷酸碱基,通过选用不同数量的这种碱基可以调节A FL P产物的条带特异性和数量,从而提供较多的基因组多态性信息。如选用不同的引物组合能够检出亲缘关系很近的品种的DN A样品间极细微的差别,同时它还可以比较不同个体之间总基因组水平上的差异(Rosenda hl,T aylo r)。运用这项技术,1998年Pat char a[22]等分析了黑胫茎点霉(L ep top haer ia maculans),获得了基因对基因假说的进一步证据。该技术也被用于镰刀菌(Fusar ium gr aminear um)不同来源分离株的鉴定和区别,也得到了极好的结果[23]。
但是,目前A FL P技术是一项专利技术,且分析试剂盒价格昂贵,引物的同位素标记涉及到放射性安全等问题,此外,基因组的不完全酶切会影响实验结果,因此对内切酶的质量要求较高,加之该项技术需要一套完整的设备与之匹配,这些都影响到该项技术的应用与推广。
2.6 电泳核型(EK)分析
DN A分子的分离技术是分子生物学研究中的关键,无论是在对真菌的功能基因进行克隆或是运用分子系统学方法对真菌的系统发育及分类进行研究时,都离不开DN A分子的分离,可以说,DN A分子分离的好坏直接影响到最终目的的实现。目前较为常用的分离技术是琼脂糖凝胶电泳,但其分离的DN A分子的大小有一定的范围,超出这个范围,效果就不好,而脉冲场凝胶电泳技术的出现则改变了以往DN A分离范围较窄、分离效果不好的问题,它的分离能力可达到10M b。所谓电泳核型分析就是应用脉冲电泳方法发展起来的一种实验技术,是指细胞中的染色体在一定电场作用下在固体包埋物中的排列情况,即通过电场的不断改变,使包埋在固体介质中的DN A分子泳动方向做相应的改变,小的DN A分子泳动较快,从而在凝胶上反映出染色体大小、数目和形状的差异。由于各分类水平上不同分类单位的染色体总会存在一些差异,因此其核型必然呈现出一定的多态性[24]。电泳核型分析技术自问世以来,在真菌的染色体数目及基因组测定、基因的杂交定位及基因作图方面已得到了大量的应用[25],并已显示出良好的分类学价值。人们从研究中发现,真菌的核型差异是种间大于种内、属间大于种间等,与其它分类学指标吻合较好[26],并且它的多态性明显、分辨能力强,电泳条件稳定时结果重复性较好。
目前,这项技术得到的核型图谱已广泛应用于酵母和其它真菌的分类研究中。如Carle和O lson[27]等应用这项技术在啤酒酵母、假丝酵母和玉米黑粉
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第3期熊 庆等 几种分子生物学方法在真菌中的应用
菌(Ustilag o may dis)中建立了电泳核型,M agee[28]运用它从白假丝酵母(C.albicans)中分离出11条染色体带,Schw ar tz&Cantor等人[29]应用脉冲电泳成功地分离了酵母的染色体DN A,并以此作为脉冲电泳技术的标准。
真菌的染色体较小,很难观察到完整的染色体数目和形态,脉冲电泳可解决该问题,加之真菌仅是经过脱壁,并未研磨,其D NA保持完整,因此这一特点使脉冲电泳为研究真菌染色体的D NA指纹提供了一种更为直观的方法。
2.7 核酸序列的直接分析
核酸序列资料适用于任何分类水平的研究,对核酸序列分析是通过测定核酸一级结构中核苷酸序列的组成来比较同源分子之间相关性的方法,核苷酸是所有生物物种遗传信息的基本组成单位,同时也是遗传信息的携带者,核苷酸序列的分析能为物种提供最丰富、最有价值及最为准确的信息,利用它不仅可直接地研究物种间的亲缘关系而且还对了解基因及其产物的结构、基因表达以及分子进化等方面具有重要意义[30]。核酸序列分析用于研究生物分类和进化,可克服因杂交、RF L P分析等技术所受到的局限。通过它的运用,可直接观察到诸如碱基变化的转换与颠换,核苷酸的变化趋势等等。在研究中,用来进行序列测定的主要包括DN A和RN A及基因间隔区(I T S)的序列。R N A测序主要研究的是构成核糖体的R N A,包括5Sr RN A, 5.8Sr RN A, 18SrR NA及28Sr RN A。因为r RN A基因(r DN A)存在着广泛的保守区域,可以用作引物的结合位点,同时其又存在有高变区域,因此可以用于不同分类阶元的研究,用于扩增r DN A的不同区域的保守引物已经在真菌系统发育研究的实际应用中获得了成功。So gin[31]利用r DN A序列研究了真菌在真核生物中的地位。Gaudet[32]则利用r DN A序列比较了Fusar ium属中的一些种间的相互关系。最早应用于系统研究的r RN A基因是5SrR NA基因,W alker和Do olittle[33]通过对8种担子菌的研究揭示了序列相似性类群之间的相互关系。Huysmans[34]等获得了伞菌属(A garicus)和木耳属(A ur icular ia)的3个种的5SrRN A序列,并将其与82个已发表的5SrRN A 序列进行聚类分析,结果表明:真菌界是一个复系类群。18Sr RN A和28SrRN A因其序列较长,因此相比之下包含了更多的遗传信息,对它们的研究也相当广泛。G underso n[35]等用18Sr RN A序列对菌物系统进行研究时发现,金藻(Chry sop hy tes)和卵菌(Oomy cetes)的亲缘关系较近,So gin[36]等利用18SrR NA研究了脉孢菌(N eur osp ora)与其它真核生物之间的关系。而在运用28SrR NA序列进行系统发育研究时,人们往往只选用其部分序列作为研究对象。5.8Sr RN A及其两端的IT S序列因为它们的进化速度较快而主要用于研究低级分类单元的关系。如L ee和T ay lo r[37]等对疫霉属(P hy top hthor a)种间关系的研究等。
在真菌基因间隔区,序列分析发展较快。如陈伟群对A lter naria sp的I T S和5.8Sr DN A序列的测序,刘小勇通过对根霉属3个组内菌株IT S的测序[38],刘作易对虫草属真菌的部分有性型和无性型菌株的5.8SrRN A、IT S1和IT S2、28Sr RN A的测序等。
线粒体DN A是真核生物核外的一种DN A,在真菌分子进化研究中同样受到了人们的重视,因为在真菌中线粒体DN A较易抽提,并且其变异丰富,能为真菌的系统发育及系统演化的研究提供大量的信息,由于线粒体DN A在遗传时所采取的是母性遗传方式,因此mt DN A几乎没有重组发生,这些特点对线粒体DN A在分子系统进化研究中特别有用。在实际研究中发现,线粒体DN A是以高拷贝遗传的,并且其进化速度比核DN A要快,在线粒体DN A进化中,转换(tr ansitio n)发生的频率远远高于颠换(tr ansver sion)频率。正是这个原因,在近缘种间大量的碱基差异是转换的结果。因此在低水平分类上,如同属的种间及种内关系,转换对进化的影响是非常重要的。在远缘种间,由于碱基转换的迅速饱和,因此转换对远缘种间的关系影响较弱,相反颠换由于它们较慢的积累速度而在很长时间内达不到饱和,所以颠换对高水平的分类系统,如属、亚科及科间,是非常重要的。但是高水平分类单元间关系的研究需限制在线粒体DN A的编码区[39]。目前,线粒体DN A序列的多态性在对真菌的系统发育及分类研究中应用较多,而对其直接序列比较的应用则较少。
直接测定D NA序列这一技术花费较大,并且目前实验中所研究测定的只是总基因组中的小部分序列,很难代表物种的整个性状(遗传信息),同时DN A样品制备技术和D NA序列图象的获得及数据分析方法都不十分理想,序列数据本身存在的多重替换问题、协同进化问题和序列进化速率的变异等问题以及数据分析中的序列校准方法的不足都使它的应用受到一定的限制。
自从分子生物学技术应用到真菌的分类研究中以来,已经解决了一些分类上的重大问题。对真菌的分子性状的了解有助于我们加深对形态学性状进化的认识,同时表型特征也可以用来验证某一分子性状对真菌的分类价值。但由于分子生物学技术本身所存在的一些不足,因此在实际研究中必须结合传统分类学上的技术及观点以确保得到客观准确的分类鉴定结果。随着分子生物学知识的积累以及技术的发展,人们将找到更具代表性的分子标记来对真菌进行区分和鉴定,这将极大的影响真菌的分类、系统、进化和发育方面的研究。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:高红卫)
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第3期熊 庆等 几种分子生物学方法在真菌中的应用
临床检验技师微生物真菌检验讲义
第二十八章真菌检验 本章内容 真菌的基本特性 真菌的基本微生物检验方法 病原性真菌 一、真菌的基本特性 真菌是真核细胞型微生物，属于真菌界。 具有典型细胞核，有完整细胞器，不含叶绿素；寄生或腐生方式生存，由单细胞或多细胞组成；细胞壁含几丁质和（或）纤维素；能进行有性生殖和（或）无性生殖。 分类 绝大多数对人类有益，如食用真菌及能产生抗生素的真菌等。能引起人类和动物疾病的真菌仅150余种。 分为黏菌、真菌两个门。其中与医学有关的真菌主要属于接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门，鞭毛菌门中仅腐霉属在医学上有重要性。绝大部分致病性真菌属于半知菌亚门。 结构基本结构为菌丝和孢子。 菌丝：真菌在适宜环境中，由孢子生出芽管逐渐延长或呈丝状，称为菌丝。菌丝继续生长并向两侧分支，交织成团，称为丝状体。 营养菌丝：伸入到培养基内的菌丝。 气中菌丝：露出培养基表面的（部分气中菌丝可产生有性或无性孢子的称为生殖菌丝）。
孢子 有性孢子：同一个菌体或不同菌体上的两个细胞融合形成。 无性孢子：菌丝直接生成，并不发生细胞融合。致病性真菌多为无性孢子。 真菌孢子与细菌芽孢区别 真菌与细菌区别 培养与繁殖 气体环境：需要较高的湿度和氧气。 温度酸碱：22～28℃，某些深部病原性真菌在37℃生长良好，pH 5.0～6.0。 培养特点：最常用沙保弱培养基，生长缓慢。 多数真菌是以出芽、形成菌丝、产生孢子以及菌丝分枝与断裂等方式进行繁殖。 抵抗力 对热的抵抗力不强，一般60℃1h即被杀死。 对干燥、日光、紫外线及多数化学药品的耐受性较强；对1%～3%苯酚、2.5%碘酒、0.1%的升汞及10%甲醛比较敏感； 对常用抗生素均不敏感，灰黄霉素、制霉菌素、两性霉素等对某些真菌有抑制作用。 致病性
酵母的分子生物学鉴定
生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ ?技术与方法? ２００８年第５期 收稿日期：２００８－０３－１４ 基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目基金（２００３ＡＡ２１４０６１，２００６ＡＡ０２０２０３） 作者简介：唐玲（１９８３－），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎｇ１０１４９９＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：闫云君（１９６９－），男，教授，博士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：（０２７）８７７９２２１４ 酵母种类繁多，不仅作为一种重要的工业微生物被广泛应用于各个领域，近年来，人们还利用酵母发酵来生产抗生素，维生素和酶等高附加值的产品，但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质，从而给人们带来巨大的经济损失，有的酵母还是人体和动物的致病菌（如，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）。近两个世纪以来，酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化特性。目前，已发展起来各种用于酵母快速检测的商业化的试剂盒，可实现部分酵母（多是针对导致疾病的部分致病酵母）的鉴定，但是该类试剂盒对酵母的检测不仅费时，而且鉴定结果准确性不高。由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面差异极不显著，在这样的背景下，以化学为基础的分类法建立起来，通过细胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来 对酵母进行分类鉴定。现在，随着分子生物学的发展，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，染色体组型分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ），染色体ＤＮＡ的限制性片段长度的多 态性分析（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａ ｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ），线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）及核糖体ＤＮＡ序列分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ），基因芯片 （ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）等分子生物学的方法广泛地应用于酵母的鉴定中。分子生物学的方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种，而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加，近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛。 １核糖体ＤＮＡ鉴定法 核糖体ＤＮＡ普遍存在于生物中，真核生物的 核糖体ＲＮＡ中包括２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ和５Ｓ４种不同 酵母的分子生物学鉴定 唐玲 刘平黄瑛杨江科闫云君 （华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４） 摘 要： 酵母种类繁多，与人类的关系极其密切，但目前由于研究方法的不同，对于酵母的分类还存在着不同的分 类体系。而准确快速的对酵母进行鉴定，既可以有效防止食品腐化变质，又可以增加经济效益，同时也为酵母的分类鉴定奠定一定的理论基础。对常用的核糖体ＤＮＡ鉴定法、ＤＮＡ指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时ＰＣＲ和基因芯片等分子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。 关键词： 核糖体ＤＮＡ ＤＮＡ指纹图谱脉冲场凝胶电泳实时ＰＣＲ基因芯片 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＹｅａｓｔ ＴａｎｇＬｉｎｇＬｉｕＰｉｎｇＨｕａｎｇＹｉｎｇＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅＹａｎＹｕｎｊｕｎ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｙｅａｓｔｓｈａｖｅｗｉｄｅｒａｎｇｅａｎｄａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓ．Ｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｓｏｍｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆ ｙｅａｓｔｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｆｉｎｄａｎａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｙｅａｓｔｓ，ｔｈｕｓｂｅｉｎｇａｂｌｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔｆｏｏｄｃｏｒｒｕｐｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｅｃｏｎｏｍｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｌｓｏ，ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｐｒｏｖｉｄｅｄ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅｓｃｒｉｂｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｙｅａｓｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｇｅｎｅｃｈｉｐｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＰｕｌｓｅｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ
第十章 分子生物学在临床上的应用
第十章分子生物学在临床上的应用 一、什么是分子诊断 就是应用分子生物学技术对临床标本进行检验获得信息服务于临床疾病的诊断、治疗以及预后判断。 二、试述分子诊断的对象、原理和途径 1、分子诊断的检测对象： 遗传性疾病和传染性疾病 2、分子诊断的原理： 基因的结构及其表达功能是否正常？ 3、分子诊断的途径： 基因突变检测：遗传性疾病的诊断 基因连锁分析：易感或抑制基因的研究 mRNA检测：表达功能是否正常 三、简述分子诊断的常用技术及其临床应用 1、聚合酶链反应（PCR）：对遗传性疾病和感染性疾病进行诊断及治疗监控。 2、DNA测序（DNA sequencing)：是了解基因结构（序列）的金标准。 3、荧光原位杂交技术（FISH）：用于肿瘤诊断，染色体变异的检测。 4、DNA印迹技术（ DNA printing）：检测癌基因的存在，抑癌基因的杂合性丢失。 5、单核苷酸多态性（SNP）： ⑴第三代遗传标记 ⑵与疾病易感性和药物敏感性关系密切 6、连接酶链反应（LCR）：检测单碱基突变遗传病。 7、基因芯片技术（gene chip）：用于优生优育、疾病诊断、基因配型、法医学等 四、核酸标本的如何收集和保存 真空采血管抽空腹静脉血3ml。 RNA检测的全血标本必须在2h内分离血清，DNA检测的全血标本必须在4h
内分离血清，-20℃贮存； EDTA抗凝血标本也可以。 五、如何理解免疫诊断与分子诊断的不一致 因为PCR检测的是病毒核酸水平，而血清学指标是病毒蛋白，两者不在一个水平上，也就是说二者测定的不是同一物体，理论上允许有差异。如大三阳患者可能出现PCR阴性，如何对待抗病毒治疗，必须综合分析，动态观察结果，不能只依靠一个指标来诊断。
真菌检测方法
分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37℃恒温箱中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。经48小时培养长成白色菌落。72小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。 通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。 培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯霉素50mg,蒸馏水1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH6.5)上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等,更有必要同时采用M40Y或DG18。 由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素,危害较小,而有的菌株即使污染数量不多,但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此,国外有些研究者设计出各类选择性培养基,可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落,非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。 2接种方式 接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大
菌种鉴定
?（1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 ?（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 ?（3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、 BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。 ?（4）API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 ?（5）功能性分析及功能基因
临床分子生物学检验试题
临床分子生物学检验试题 一填空题 1. 核酸的最大紫外吸收波长在，蛋白质的最大吸收波长在。 2. 双链DNA 中的碱基对有，。 3. 根据分子和结构不同，RNA 可以分为，，，。 4. 核酸变性过程中,紫外光吸收达到最大值50%时温度称为,其主要与核酸 的最终含量有关. 5. DNA 水解后主要产物是, , 。 6. 核酸（DNA 和RNA ）分子除含 有，，，四种元素外，还含有大量的元素。 7. PCR 技术是当今分子生物学使用最多的技术之一，它一般都有，，三 个基本反应步骤构成。 8. 核酸水解后首先得到核苷酸，核苷酸可以继续水解得到和。 9. 通用遗传密码中代表终止密码的三种密码 是UAA 、和。 10. P CR 方法扩增DNA 片段是，在反应中除了用该DNA 片段作为模板外，尚需加入、 和。 11. 在DNA 分子中还有大量的磷（P），P 的含量大约为。 二．判断题 1. 核酸变性时,碱基对之间的氢键断开,堆积力也受到破坏,共价键断裂. （） 2. 核酸杂交原理就是根据核酸分子间互补.（） 3. 在中性或碱性溶液中,核酸主要带正电 荷.（） 4. 核酸分子质量很大,因此核酸溶液具有很大粘性.（） 5. 分子杂交可以发生在任何只有互补核苷酸顺序两条单股核酸单链之间,如DNA/DNA 、DNA/RNA 、RNA/RNA 等.（） 6. 核酸水解后首先得到核苷酸，核苷酸可以继续水解得到核苷和磷酸（） 7. 在高分子溶液中一般球形分子比线形分子的具有较大的粘度。（） 8?核酸的最大吸收波长在280nm，而蛋白质的最大吸收波长在260nm。（） 9?酚一氯仿提取法是我们在提取DNA时所用的经典方法，现在仍然被许多实验室所采用。（）10. 组成RNA的四种碱基是腺嘌呤（A ）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）。（） 11. PCR技术是以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增技术。（） 12. PCR技术是现在常用的一种扩增技术，它的基本步骤的顺序是退火、变性、延伸。 （） 13. 免疫印漬技术及Southern Blotting是一种印漬技术和抗原抗体反应结合的技术（） 14. 在临床基因扩增检验诊断实验室工作的实验操作人员必须经过业务培训并取得上岗证书（） 15. 无论是DNA还是RNA，在多核苷酸链 内既有酸性的磷酸基又有碱性的含氮杂环碱，因此核酸是两性电解质。（） 16. 在PCR 实验中，退火是指在极端的PH 和受热条件下，核酸分子中的氢键断裂， DNA 双螺旋解开的一个过程。（） 17. 临床基因扩增诊断实验室的设置必须遵 循一定的原则，而这些基本原则制定的主要依据就是使建立的基因扩增诊断实验室结果的准确性能够得到保证，能忠实的反映被检的临床样本的真实情况。（ ） 二选择题 1. 核酸在波长为260nm 光吸收强度大小排列正确的是（） A. G>A>T>C B.A>T>G>C C.C>G>T>A D.G>C>A>T 2．鉴别RNA 靶分子的杂交是（） A Southern Blot B Northern Blot C Western Blot D 斑点杂交 3. 在做RNA 检测时，我们对全血抗凝最好用下列哪种抗凝剂（） A. 肝素 B. EDTA-K2 C. EDTA-Na2 D. 草酸钾
分子生物学地研究及发展
分子生物学的应用及发展 摘要：本文在文献检索的基础上，对分子生物学的发展简史，基本原理，研究领域等作了简单介绍，阐述了分子生物学在人们日常生活中的应用并结合药学专业着重讨论了其在药学及中药开发发面的应用，并进一步对分子生物学未来的研究技术、方向和前景做了展望。 一前言 生物以能够复制自己而区别于非生物。生命现象最基本的特征是进行“自我更新”。进行“自我更新”体现了一种最高级和最复杂的运动状态。这种运动就是生物机体从环境中摄取物质和能量，以更新本身的物质组成，而山现生长、繁殖，在这样的过程中保证了将自身的特征传给历代；同时也不断地向环境输送一些物质和释放能量。在生物机体的组成物质中，防水分外，有各种无机盐类和各种有机化合物。其中生物大分子——核酸和蛋白质在进行自我更新运动中，以其功能的重要性占第一位。为探索生命现象的本质问题，产生了分子生物学这一学科[1]。 分子生物学(molecular biology)是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域[2]。 分子生物学的最终目标是远大的，从产生基本细胞行为类型的各种分子的角度，来理解这五类行为类型：生长、分裂、分化、运动和相互作用。即分子生物学力图完整地描述细胞大分子的结构、功能和相互联系，从而理解细胞为什么要采取这种方式[3]。 分子生物学作为一门新兴的边缘学科。它的迅速发展及其在整个生命科学领域的广泛渗透和应用，促使人们对生物学等生命科学的认识从细胞水平进入分子水平。在农业、畜牧、林业、微生物学等领域发展十分迅速，如转基因动植物等。在医学领域，为医学诊断、治疗及新的疫苗、新药物研制等开辟了新的途径，使医学科学中原有的学科发生分化组合，医学分子生物学等新的学科分支不断产生，使医学科学发生了深刻的变革，不认识到这一点就很难跟上科学发展的步伐。 分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 二分子生物学发展简史 分子生物学的发展大致可分为三个阶段[4-7]：
什么是微生物检验
什么是食品微生物检验 吴崇食质12级1班学号：20122629 微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50 亿个细菌。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广
微生物检验(完整版)
微生物检验（完整版） 名解 微生物：是一群个体微小结构简单肉眼不能看见的微小生物的总称 种：亲缘关系较近的微生物群体在进化发育阶段上有一定的共同形态和生理特征 微生物学：生物学的一个分支是研究微生物在一定条件下的形态结构生理生化遗传变异特性及微生物的进化分类生态等生命活动规律以及微生物之间与人类动植物自然界互相关系的一门科学 抗生素：是由某些微生物在代谢过程中产生的能抑制或杀灭某些其他微生物和肿瘤细胞的微量生物活性物质 细菌素：是某些细菌菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质 条件致病菌：正常菌群在宿主体内具有相对稳定性一般不致病 消毒：指杀死物体上的病原微生物但不一定能杀死细菌芽孢的方法 灭菌：指杀灭物体上所有的微生物的方法 防腐：指防止或抑制微生物生长繁殖的方法 无菌：指没有货的微生物的存在 质粒：是细菌染色体外的遗传物质也是环状闭合的双联DNA分子比染色体小存在于细胞质中可自主复制 突变：是指细菌遗传物质的机构发生突然而稳定的改变所致的变异现象可遗传给后代 基因转移：外源性物质由供体菌转入受体细胞内的过程 基因重组：供体菌的基因进入受体菌细胞并在其中自行复制与表达或矛受体菌DNA整合在一起的过程 病毒：是一类个体微小结构简单只含一种核酸只能在活的易感细胞内以复制方式增殖的
非细胞型微生物 复制周期：病毒的增殖被人为分成吸附穿入脱壳生物合成装配成熟与释放七个步骤的完整过程 缺陷病毒：是指因病毒基因组不完整或因基因某一点改变而不能进行正常增殖的病毒 顿挫感染：病毒进入宿主细胞若细胞缺乏病毒复制所需的酶能量和必要成分等则病毒无法合成自身成分不能够装配和释放子代病毒的现象 干扰现象：两种病毒感染同一种细胞时可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象 人工自动免疫：是将疫苗等免疫原接种于人体刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答使机体获得特异性免疫力 人工被动免疫：是指注射含某种病毒特异性中和抗体的免疫血清等一系列细胞因子是机体立即获得特异性免疫 干扰素：是由病毒或干扰素诱生剂作用于中性粒细胞成纤维细胞或免疫细胞产生的一种糖蛋白 致病性：一定种类的病原微生物在一定的条件下能在特殊的宿主体内引起特定疾病的能力半数致死量：在规定时间内通过一定途径能使一定体重或年龄的某种动物半数死亡或感染需要的最小病原体数量或毒素量 急性感染：发作突然病程较短一般是数天或数周 局部感染：病原体侵入机体后局限就在一定部位生长繁殖引起病变的一种感染类型 毒血症：致病菌侵入宿主体后只在机体局部生长繁殖病菌不进入血液循环但其产生的外毒素入血引起特殊的毒性症状 败血症：致病菌侵入血流后在其中大量繁殖并产生毒性产物引起全身性毒性症状 内毒素血症：革兰阴性菌侵入血流并在其中大量繁殖崩解后释放出大量毒素也可有病灶
真菌学实验指导
本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8
实验内生真菌的分离及鉴定 实验学时：18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻
【优质】微生物检验试题
【优质】微生物检验试题 A型题 1、下列属非细胞型微生物的是 A 细菌 B 放线菌 C 真菌 D 病毒 E 立克次体 2、没有细胞壁的原核细胞型微生物是 A 细菌 B 放线菌 C 支原体 D 衣原体 E 立克次体 3、菌体呈矛头状且呈双排列的细菌是 A 脑膜炎奈瑟菌 B 淋病奈瑟菌 C 卡他布兰汉菌 D 微球菌 E 肺炎链球菌 4、维持细菌固有形态依靠细菌的 A 细胞壁 B 细胞膜 C 细胞质 D 荚膜 E 芽孢 5、青霉素能抑制 A 磷壁酸的形成 B 蛋白质的合成 C 肽聚糖的合成 D 核质的复制 E 脂质的的合成 6、一般认为细菌的运动器官是 A 芽孢 B 荚膜 C 鞭毛 D 菌毛 E 纤毛 7、细菌染色应用最广泛的染料是 A 中性染料 B 碱性染料 C 酸性染料 D 瑞特燃料 E 姬姆萨燃料 8、革兰染色法的染色步骤是 A 结晶紫或龙胆紫初染、碘液媒染、酒精脱色、复红或沙黄复染 B结晶紫或龙胆紫初染、酒精脱色、碘液媒染、复红或沙黄复染 C结晶紫或龙胆紫初染、酒精脱色、复红或沙黄复染 D 美蓝初染、碘液媒染、酒精脱色、复红或沙黄复染 E 复红初染、酒精脱、美蓝复染 9、用革兰染色，革兰阴性菌染成
A紫色 B 蓝色 C 红色 D 黄色 E 灰色 10、关于鉴别培养基下列那一项是正确的 A 含有细菌需要的最基本营养成分，可供大多数细菌生长 B 含有丰富的营养成分，可供营养要求较高的细菌生长 C 可选择所欲分离的细菌，而抑制其它细菌生长 D 供细菌生化反应实验，借以鉴定细菌之用 E 加有还原性物质，降低培养基的氧化还原电势 11、在临床细菌学检验中，含菌量较多的标本，如粪便，接种方法适宜用 A 平板倾注培养法 B 平板连续划线法 C 平板分段划线法 D 斜面接种法 E 半固体穿刺接种法 12、某菌为革兰阴性菌，在KIA上:分解葡萄糖和乳糖，产气，不产生HS;在MIU上:2动力阳性，吲哚阳性，脲酶阴性，在IMViC 上，，――;氧化酶阴性，触酶阳性，硝酸盐还原试验阳性。该菌是 A 大肠埃希菌 B 肺炎克雷伯菌 C 宋内志贺菌 D 小肠结肠炎耶尔森菌 E 阴沟肠杆菌 13、由单一核酸(DNA或RNA)和蛋白质外壳组成的微生物是 A 支原体 B 衣原体 C 立克次体 D 螺旋体 E 病毒 14、与细菌生化反应鉴别有关的代谢产物是A毒素 B热原质 C抗生素 D 糖代谢产物 E 细菌素 15、下述细菌结构中抵抗力最强的是 A 细胞壁 B 荚膜 C鞭毛 D 芽孢 E核糖体 16、下述哪一项是荚膜的作用, A抵抗吞噬细胞的吞噬 B 细菌的运动器官 C可传递细菌的遗传物质 D可吸附粘膜上皮细胞 E 维持细菌的形态 17、革兰阴性球菌，肾形、成双排列的细菌可能是
微生物总数检测方法(真菌)
微生物总数检测方法（真菌） 一、检测用培养基配方与培养条件 1.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基） 配制：以北京路桥PDA培养基为例，按说明上配制需称取培养基4克，加水100毫升。 2. 培养条件：25℃-30℃；时间：72-96小时。 二、检测与计数方法 1. 梯度稀释 称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂3—5滴，分散剂可以是吐温，OP—80，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后，上旋转式摇床200 r/min充分振荡60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。 2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管，每一个稀释度瓶种应放有适量的玻璃珠，以保证菌液分布均匀）。 3. 加样及培养 取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。 4. 菌落识别 根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。 5. 菌落计数 以出现20—70个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。 有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数： nm = x kv1/(m0v2) ×10-8或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8（1） 式中：
分子生物学检验完整版
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？ 原癌基因是指人类或其他动物细胞(以及致癌病毒)固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变 3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。 临床特征：生长发育障碍，智力低。呆滞面容，又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。 核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX(XY),+21 2.5%患者为嵌合型：46，XX(XY)/47，XX(XY),+21 5%患者为易位型：46，XX(XY),-14，+t(14q21q) 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势 1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。 2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。 分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析等。 1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析 AP—PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用 DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究 7、F VIII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P197，P203，P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了） 答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。
真菌检验
1、什么是真菌？ 真菌为真核细胞型微生物，属于真菌界。具有典型的细胞核，不具有叶绿素，以腐生和寄生方式摄取营养，细胞壁含几丁质和纤维素，有完善的细胞器，能进行有性生殖和（ 或）无性繁殖。真菌在自然界分布极为广泛，约有20余万种，大多对人无害，仅有约150种对人和动物致病。 2、真菌的基本结构是什么？ 真菌的基本结构为菌丝和孢子，菌丝为微细的管状结构，具有细胞壁，细胞膜，细胞浆和细胞核，分枝或不分枝，分隔或不分隔，有粗有细，着色或不着色。一般致病真菌的菌丝较细而且分隔。孢子是真菌的繁殖器官，也是抵抗不良环境的结构，类似于高等植物的种子，是真菌分类坚定的最主要依据。 3、引起人和动物感染的真菌分为哪两类？ 引起人和动物感染的真菌分为病原性真菌和条件致病菌两大类。病原性真菌本身具致病性，而条件致病菌一般不具致病性，只有在一定条件下，即机体免疫力降低时才致病。 4、引起真菌病的常见诱因有哪些？ 长期使用广谱抗生素，皮质激素和免疫抑制剂，代谢障碍，血液病，尿毒症，慢性消耗性疾病，外伤，大手术，器官移植，静脉高营养，导插管，放化疗及爱滋病等都是重要的诱因。 5、真菌生长的特点？ 真菌在生长过程中有从中心向四周等距离生长形成圆形菌落的倾向。也正因为这一特点使体股癣的皮肤损害表现为环行或多环行。 6、实验室检查真菌包括什么？ 实验室检查主要包括真菌直接检查和真菌培养。 7 、真菌直接检查的意义？ （1）直接检查阳性有诊断意义，一般可确定有真菌感染，但阴性不能排除诊断。 （2）根据直接检查所见的真菌镜下形态可确定少数病原菌的种，如新型隐球菌，花斑癣菌等。有些可确定属，如念珠菌属等。 （3）直接检查所见的真菌形态，代表该菌在组织内的形态即组织象。（4）真菌镜下形态有时可提示该菌的活动性，如念珠菌出现真菌丝和假菌丝，皮肤癣菌的菌丝肥大粗长多分枝，胞浆浓都表示该菌处于活跃状态。 8 、真菌培养的目的是什么？
利用ITS序列鉴定真菌
北方民族大学实验论文 题目：利用ITS序列鉴定真菌 学院：生物科学与工程学院 专业：生物技术 班级： 082 姓名：李晓飞李妍吾木尔古丽 张瑞莉陈波艾克拜尔 指导老师：刘建利 完成日期：2011年5月18日——2011年6月5日
利用ITS序列鉴定真菌 李晓飞李妍吾木尔古丽张瑞莉艾克拜尔陈波 （北方民族大学生物科学与工程学院银川750021） 摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株（Candida sp）。 关键词：ITS序列酵母菌PCR 菌种鉴定 1 材料与方法 1.1试验材料与试剂 实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。 YEPD液体培养基[2]配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分装100/250ml，121℃灭菌15min。 裂解液[3]：1L裂解液中需加Tris1.2114g，EDTA8.767g，SDS5g，用1M的NaOH调至8.0，121℃灭菌30min备用。 醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。 氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。 70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。 10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。 1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。1.2主要仪器与设备 表一实验中使用的主要仪器 仪器名称型号产地 立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂 数显恒温水浴锅HH-4 国华电器有限公司 电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂 制冰机AF200PSC50R ΜSA 生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany 电子精密天平HR-200 上海精科天平 酸度计DELTA302 上海 电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂 紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂
分子生物学在医学检验中的临床应用及前景word精品
分子生物学在医学检验中的临床应用及前景 班级：2013 级科硕 6 班专业：临床检验诊断 学姓名：姜世涛 学号：2013203030024 评分： 导师签名： 分子生物学是一门正在蓬勃发展的学科，新技术和应用条件的不断出现，为检验医学的发展提供了崭新的时代并提供新的机遇和挑战。分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的学科，分子生物学技术即建立在核酸生化基础上的一类研究手段，现已广泛应用于医学检验中，同时也逐渐渗入数理科学、结构基因组学、功能基因组学和环境基因组学，研究内容也从DNA 鉴定、扩展到核酸及表达产物分析，技术不断进步为微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、兔疫系统疾病诊断提供重要依据和创新思路。在结构基因组学、功能基因组学和环境基因组学蓬勃发展形势下，分子诊断学技术将会取得突破性进展。一．利用分子生物学技术检测样品中核酸水平 PCR[1]技术是目前应用较广泛和成熟的临床检测方法，在法医学、常见传染病、性病、寄生虫和优生优育等领域有很高的应用价值，尤其对肝炎病毒的早期诊断。 1．核酸分子杂交技术和基因芯片技术核酸分子杂交技术也称为基因探针技术，利
用核酸的变性、复性和碱基互补配对的原理，用已知的探针序列检测样本中是否含有与之配对的核苷酸序列的技术，是印迹杂交、基因芯片等技术的基础。目前基因芯片技术可广泛应用在肿瘤基因表达谱差异研究、基因突变、基因测序、基因多态性分析、微生物筛选鉴定、遗传病产前诊断等方面。另外，现已获得一些微生物的全基因序列，包括百余种病毒，多种细菌（流感嗜血杆菌、产甲烷球菌及实验室常用的大肠杆菌等）和一些酵母等。因此，将一种或多种病原微生物的全部或部分特异的保守序列集成在一块基因芯片上，可快速、简便地检测出病原体，判断侵入机体引起感染性疾病的病原微生物(病毒、细菌或寄生虫等)，从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。 2．单核苷酸多态性分析(SNP) 技术 在人群中，个体基因的核苷酸序列存在差异性，称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于人的基因组中。如果在某个家庭中，某一致病基因与特定的多态性片段紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种” 遗传标记” 来判断家庭成员或胎儿是否携带有致病基因。目前认为基因多态性是个体的”身份证”，因此，基因多态性分析技术已经广泛应用于群体遗传学研究、疾病连锁分析和关联分析、疾病遗传机制研究、肿瘤易感性研究、个性化用药等诸多方面。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism ，SNP) 分析技术为临床检测提供了依据。SNP是一种最常见的遗传变异，在人类DNA多态性中，SNP约占90%。SNP是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基。SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同在于：它不再以”长度”的差异作为检测手段，而是直接以序列的差异作为标记。由于SNP 是二态的，易于自动化批量检测，易于计算机分析结果，因此SNP检测已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研
微生物检验试题及答案
细菌的形态与结构 一、单选题 1. 细菌单位是 A. dm B. cm C. mm D.um E. nm 答案：D 2. 对下列细菌大小表述错误的是 A.葡萄球菌体直径约1um B.大肠埃希菌长约2~3um C. 阴沟肠杆菌宽约0.3~0.5um D.霍乱弧菌体长2~3um E.布鲁菌长2~3um 答案：E 3. 下列细菌菌体形态呈链状排列的是 A.卡他布兰汉菌 B.屎肠球菌 C.腐生葡萄球菌 D. 肺炎克雷伯菌 E.淋病奈瑟菌 答案：B 4. 下列细菌菌体形态呈螺旋形排列的是 A.表皮葡萄球菌 B.产酸克雷伯菌 C.克氏耶尔森菌 D.鼠咬热螺菌 E.鲍氏志贺菌 答案：D 5. 下列不属于细菌基本结构的是 A.细胞壁 B.芽胞 C.细胞膜 D.核质 E.细胞质 答案：B 6. 不属于革兰阴性细菌细胞壁成分的是 A脂蛋白 B.聚糖骨架 C.四肽侧链D.五肽交联桥 E.脂多糖答案：D 7. 革兰阳性细菌细胞壁具有很强抗原性的成分是 A.外膜 B.肽聚糖 C.磷壁酸 D.聚糖骨架 E.五肽交联桥 答案：C 8. 下列菌有细胞壁外膜层的是 A.粪肠球菌 B.溶血葡萄球菌 C.新型隐球菌 D.产酸克雷伯菌 E?克柔假丝酵母菌 答案：D 9. 下列不属于细菌细胞质基本成分的是 A.水 B.聚糖骨架 C.无机盐、糖 D.蛋白质、脂类 E.核酸 答案：B 10. 控制细菌某些特定遗传性状的是 A.核质 B.胞质颗粒 C.质粒 D.核糖体 E.蛋白质 答案：C 11. 细菌细胞质中决定菌体嗜碱性的物质是 A.核糖核酸 B.质粒 C.蛋白质 D.双链闭环DNA E.脂类 答案：A 12. 细菌的主要遗传物质是 A.核糖核酸 B.脂类 C.质粒 D.核质 E.蛋白质