测序图分析

北京实验室:北京市经济技术开发区荣昌东街7号隆盛工业园204

邮编:100177 电话:010-******** Email:seqbj@http://m.wendangku.net/doc/d3d86f1a4431b90d6c85c7cb.html

1. 酒精峰和染料峰

测序图分析

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辨别要点:一般情况下这样的峰形出现在前200bp的某部分.大部分情况下是不影响测序

结果的.

解决方案:重新安排反应

2. 由引物降解引起的双峰

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辨别要点:每个峰下都有后一个碱基颜色的小峰,且显然是后面的碱基向前移了一个。这是

很轻微的移码现象,如果降解严重,将无法判读。

解决方案:更换引物测序

3. 由困难结构导致的信号中断

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辨别要点:在某一碱基或一段区域后峰形突然变得杂乱,无可用信号,一般在AG rich region/TG rich region/GC rich region/G or C rich region等后易发生。

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解决方案:我们目前针对此类困难模板使用新的反应体系,成功率大大提高,但并不能保证100%出正常报告。为了更快得到满意结果,如果您的样品序列含有二级结构的,请在订单

备注中注明。

4. POLY A/T/C/G

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辨别要点:长串的连续A/T/C/G碱基,一般在这种结构后峰形会变乱,但也有可以测得过去的

可能。遇到这种情况请反向测序,然后进行拼接,得到全序列。

重复序列的测定是目前荧光测序方法的一个局限。我们目前的原则是对于质粒DNA(闭合双

链)上当存在polyT/A/G/C结构时无论之后的信号质量如何,我们都会将报告发出,在PCR模

板上这个限制的长度为15个碱基。相对A和T,G/C的影响更大一些,无论在何种模板上

只要出现连续10个的G或C,不管之后的信号质量如何,我们都会将报告发出。由于这是

样品的内在原因。这类问题我们应该同正常测序一样,给客户报告,反应按正常收费。由于

这样的重复序列对测序结果的影响是绝对的,所以还请测序客户在选择引物时尽量避开有重

复序列的一端。

5. 重复序列

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辨别要点:明显的长串类似碱基组成的结构重复,一般这种结构会导致信号的中断或者衰减。

解决方案:从反向测序

6. 混合克隆

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辨别要点:明显的峰形是从插入位点或者扩增引物区之后开始可以看到由单一的峰形忽然变

成杂乱的双峰。但对于部分样品,也可能只是序列中一段峰形出现双峰,或者从某一点后出

现双峰,其他部分正常,也是混合克隆的特征之一。比如:

测序图分析

辨别要点:此类双峰主要是由于客户提供的质粒样品的插入片断缺失一段碱基导致,可能重

新挑取克隆会有改善。

解决方案:重新划平板挑取单克隆测序

7. 测序一开始就出现双峰

测序图分析

出现这种情况的原因:

一. 样品本身被污染,这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时,

如果刚好和样品中的几个质粒均能结合,那么就会出现这种情况,而且在同一位置上还可能

有不止两个峰形。

解决方案:划平板挑取单克隆测序

二. 样品不是单一模板,这常常发生在样品为PCR产物的情况中。通常PCR样品含非特

异性扩增,存在两条分子量很接近,采用琼脂糖电泳无法分开的条带,在测序时容易发生这

种情况。

解决方案:优化PCR反应体系或者克隆后测序

三. 样品中存在两个引物结合位点,这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物

恰好设计在重复序列中时,那么在重复序列以外的部分就会出现双峰的情况。

解决方案:选用特异性引物测序

8. 碱基缺失

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在PCR产物中最容易出现这样的情况,这个峰图就是存在两条相差两个碱基的序列。对于

混合克隆,也可能发生。

解决方案:克隆后测序

9. 信号衰减

测序图分析

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辨别要点:开始峰形整齐随后逐渐变乱,背景峰逐渐提高(一般报告组在出报告时会将变乱

不可信的峰形压低后删除不可信序列),与信号中断的区别在于信号衰减是峰形逐渐变乱,

而信号中断是在某一点后突然变乱。造成信号衰减的原因很多也很复杂,常见的原因是样品

质量差,序列结构问题,如果质粒和PCR产物,我们建议客户优化模板后重新提供;对于菌

液,我们将重新培养菌,重新抽提再次测序,减少操作原因。但即使这样,仍然不能保证一

定正常出结果。

解决方案:优化模板或者调整反应体系

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邮编:100177 电话:010-******** Email:seqbj@http://m.wendangku.net/doc/d3d86f1a4431b90d6c85c7cb.html 10. 引物合成是否有问题

见图A及图B

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图A

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图B

这是一批实验中的不同克隆,正常引物序列应该是在GAATTC位点后以CGATGT开头,但图B

中显示的克隆明显在5’端缺少了一个C。

此例说明:在引物区同样存在错配的可能。当然出现这样的情况后关键是如何明确问题的所

在。比较简单的方法是再挑选一个同批次的克隆进行测序。因为如果是PCR错配引起的这种

错误,那么必然是一个小概率事件,其联系出现于两个克隆上的几率就更是微乎其微。而如

果是引物上的问题,那么同样问题联系出现的概率就大很多。所以,新的克隆如果测序后发

现问题依旧,那么引物合成错误的可能更大,反之则是PCR过程出现问题

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