一种基于PCR技术混合样本高效定性筛查转基因阳性样本的方法

中国农业科学 2012,45(2):399-404

Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.02.024

一种基于PCR技术混合样本高效定性筛查

转基因阳性样本的方法

刘文文1，郝转芳1，翁建峰1，李新海1，宋新元1,2，张世煌1 ，谢传晓1

（1中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，北京 100081；2吉林省农业科学院生物技术中心，长春 130033）

摘要：【目的】基于PCR技术与DNA样本混合策略建立一种高效定性筛查大量待检样本中转基因阳性样本的方法。【方法】以480个样本为研究案例，对待检样本DNA模板随机编号后构建虚拟三维混合池，置于5×96孔板

中，将各板、各行和各列分别混合，构建所有板各行的X维行池（A，B，C，……G，H）和所有板各列的Y维混合

池（1，2，3，……11，12），各板所有样本混合的Z维混合池（I，II，III，IV，V）。利用三维交叉唯一性原理

与PCR检测的灵敏性与特异性，高效定性筛查样本中的阳性个体。将浓度为500 ng·μL-1的阳性对照分别用ddH2O

和同浓度阴性DNA模板进行96倍（96×）稀释，检测该方法的灵敏性与特异性。5×96孔板480个样本中，双盲

法随机掺入13个Bt176转化事件标准样本（Cry1Ab阳性与Bt176特异引物阳性），通过对25个混合池检测，得

到候选阳性样本，并进行二次检测，筛查出真正的阳性样本。【结果】96×混合样本未影响检测的灵敏性与特异性。

通过该种混合池得到可能的33个候选样本，再对33个候选样本进行二次检测，成功检测出所有与设置相符的盲

样，即掺入的13个阳性样本。【结论】该方法适用于从大量的样本中用PCR方法定性筛查少量阳性样本的检测，

工作量比普通单样本逐一检测的方法降低了80%左右。

关键词：转基因阳性个体；筛查；混合；PCR；高效

An Efficient Method of Qualitative Screening Positive Transgenic Samples Based on PCR Technique and Pooling Strategy

LIU Wen-wen1, HAO Zhuan-fang1, WENG Jian-feng1, LI Xin-hai1, SONG Xin-yuan1, 2,

ZHANG Shi-huang1, XIE Chuan-xiao1

（1 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resource and Genetic

Improvement, Beijing 100081; 2Biotechnology Research Centre, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033）

Abstract:【Objective】 The objective of this study is to establish an efficient method of qualitative screening a few of

transgenic-positive individuals from a large number of samples based on PCR technique and DNA pooling strategy.【Method】 In a

case study, 480 samples were randomly numbered and then a virtual 3 dimensional pooling bulks of template DNA were constructed.

Each of 480 samples was put into 5×96-well plates well by well. The row pools, X dimension pools, were the samples from same

row number of all plates and therefore 8 (A, B, C, …… G, H) pools were made. The line pools, Y dimension pools, were the samples

from same line number of all plates and therefore 12 (1, 2, 3, ……11, 12) pools were made. The plate pools, Z dimension pools, were

the samples from the same plate and therefore 5 (I, II, III, IV, V) pools were made. The rationals of the design was used in order to

archive high efficiency because the cross among 3 dimensions is unique along with high sensitivity and specificity be provided with

PCR technique. The 500 ng·μL-1 positive samples were 96× diluted by using ddH2O or negative DNA, respectively. At the same time,

13 double blind samples of Bt176 events, Bt176 and Cry1Ab positive samples, were mixed in 480 samples. By screening the 25 pools,

the candidate samples were detected and then screened them again. 【Result】The results showed that the sensitivity and specificity

收稿日期：2011-01-21；接受日期：2011-10-16

基金项目：国家转基因重大专项（2009ZX08010-008B）

联系方式：刘文文，Tel：010-********；E-mail: mlw0927@https://www.wendangku.net/doc/d67122854.html,。通信作者谢传晓，Tel: 010-********；E-mail: cxxie@https://www.wendangku.net/doc/d67122854.html,

400 中国农业科学45卷

of the detection were not affected. What’s more, this way exactly screened out 13 positive samples after screening of 25 pools and they were the positive 13 samples. 【Conclusion】This method can be used for screening a few numbers of positive individuals from a large number of accessions. The work load will be reduced around 80% compared with conventional sample by sample method.

Key words: transgenic-positive individuals; screening; pooling; PCR; high efficiency

0 引言

【研究意义】截止到2010年，全球转基因作物种植面积累积已超过10亿hm2[1]。随着转基因技术的发展，国内外大量的转基因植物及其产品进入商业化阶段，安全问题引起了世界各国的高度重视。因此，开发一种高效、快捷的从大量样本中定性筛查阳性样本的方法，对转基因产品监管与转基因研发本身都具有重要意义。【前人研究进展】目前，通常使用常规的PCR方法对植物样本进行转基因成分的定性检测与筛查。当需要从大量样本中筛查阳性样本时，筛查阳性样本步骤繁琐、耗时费力，而当阳性样本机率低，只有几个甚至不存在时，这种方法的缺点尤其突出。此外，转基因技术研发本身也需要从大量的样本中筛查出少数阳性样本。以农杆菌介导玉米幼胚遗传转化方法[2]为例，虽然Ishida等[3]报道将转化效率提高到5%—30%，但通常转化率仍低于10%[4]。当采用无选择标记遗传转化方法时，阳性率更是低于1%，筛选的工作量会更加繁重。【本研究切入点】利用PCR方法定性筛查转基因成分是最常用的方法[5]，本研究借鉴前人筛选基因文库等方法的经验[6-11]，通过构建理想、高效、灵敏的三维混合池的方法提高检测效率，并对混合样本个数、混合池构建方法、相关检测的灵敏性与特异性进行试验和分析。【拟解决的关键问题】证明基于PCR技术混合池策略高效筛查方法的可行性，为农业执法部门对市场上大量样本进行的定性筛查及转基因研究中目标基因转化体的筛选提供新方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

1.1.1 供试材料 “农业部2010种子执法年”分别来自全国18个省份种子市场抽查的461份玉米品种样本和本单位需要检测的19份玉米品种，共计480份样本，检测表明这些样本均为Bt176与Cry1Ab检测阴性样本。

此480个样本中，双盲法替换了13个Bt176（Cry1Ab）的阳性样本。

1.1.2 引物 检测转基因玉米外源基因的引物[12]信息见表。

表 引物信息

Table Information of primers

目标基因Target gene

引物序列

Primer pair

扩增长度

Amplicon size (bp)

退火温度

T m (℃) 5′-GGACAACAACCCAAACATCAAC-3′

Cry1Ab

5′-GCACGAACTCGCTGAGCAG-3′

152 58 5′-AAGCACGGTCAACTTCCGTAC-3′

Bt176特异体基因

Bt176 special event gene 5′-TCGACTTTATAGGAAGGGAGAGG-3′

570 58

1.1.3 试剂 Uracil-N-Glycosylase[13]（Fermentas）、rT aq DNA聚合酶（TAKARA）、dNTPs（TIANGEN）、琼脂糖、EB、异丙醇、70%的乙醇、分子量Marker：D2000（TANGEN）、10×PCR缓冲液、1×TAE缓冲液、6×上样缓冲液、TIANGEN快捷型植物基因组DNA提取系统、液氮等。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒及发芽 将待检测的玉米种子采用Gould等[2]的方法灭菌，之后将灭菌的种子置于铺有两层滤纸的培养皿中，塑料薄膜封口，将培养皿放入培养箱中，28℃暗培养约72 h。

1.2.2 制备模板DNA 取 1.2.1中的样品，使用TIANGEN公司生产快捷型植物基因组DNA提取系统提取样本的DNA模板，用50 μL的ddH2O溶解。

1.2.3 DNA的完整度及浓度检测 提取的总DNA用1%的琼脂糖凝胶检测，以检验DNA质量。各DNA 模板使用Thermo NANO DROP2000型分光光度计进行浓度检测。将480份DNA样本用琼脂糖凝胶电泳

2期刘文文等：一种基于PCR技术混合样本高效定性筛查转基因阳性样本的方法 401

和Thermo NANO DROP2000型分光光度计进行浓度

检测能有效防止DNA样本之间的不均一性，而在PCR

反应体系中加入UNG酶能防治PCR后污染，有效减

少假阳性的出现。

1.2.4 DNA样本的稀释 根据均一性原则，将DNA

样本各取20 μL，根据以下公式，来确定加入的双蒸

水的体积（μL），将样本稀释到500 ng·μL-1。

V ddH

2O =

500

20

×

C-20

式中，C为1.2.3中测得的样本的浓度（ng·μL-1）；500为样本最终定容的浓度（ng·μL-1）；20为取样的体积（μL）；V ddH

2O

为需要加入的双蒸水的体积（μL）。

1.2.5 PCR反应灵敏度检测 将已知的阳性样本Bt176的DNA稀释至500 ng·μL-1，然后将其分别用ddH2O、阴性DNA模板进行16、26、36、46、56、

66、76、86、96倍的稀释，进行PCR扩增，20 μL的PCR反应体系中含10×PCR缓冲液2 μL，2.0 mmol·L-1的dNTP 2 μL，1 U·μL-1 UNG酶0.16 μL，5 U·μL-1 T aq 酶0.15 μL，20 pmol·μL-1 Bt176特异体正、反向引物各1 μL，模板DNA 2 μL，不足20 μL 时用ddH2O补齐。循环条件：94℃预变性5 min；后35个循环为94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s；72℃后延伸10 min。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像观察。

1.2.6 三维混合池的构建与单个样本的定性筛查 以随机编号的480个样本、5个96孔PCR板为例，分别构建三维（X、Y、Z）混合池。X维混合池的构建：取所有板各行的每个单样各5 μL混合建立行池，A—H列共8个行池；Y维混合池的构建：取所有板各列的每个单样各5 μL混合建立列池，1—12列共12个行池；Z维混合池的构建：取每板所有单样各5 μL混合建立各板池，每个板池含单块96孔PCR 板样本个数，即96个样本，本例为板I到板V共5个板池（图1）。其中，480个样本中双盲法随机掺入了13个Bt176标准样本（Cry1Ab阳性与Bt176特异引物阳性），以验证本方法的效率、灵敏性与区分性等。

利用PCR的灵敏性，首先对Z维板池、X维行池和Y维列池分别进行检测，最后对阳性混合池可能的排列组合的样本（称之为候选阳性样本）进行阳性筛查。例如，板II池、A、G行池与5、7列池均检测到Cry1Ab阳性，根据排列组合的原理，编号为IIA 5、IIA 7、IIG 5、IIG 7的样本可能为Cry1Ab阳性样本，然后对这4个候选样本再次进行PCR扩增和检测以确定其中真正的阳性样本。

1.2.7 三维混合池PCR扩增和检测 以阳性样本Bt176作为PCR反应的阳性对照，以水代替模板DNA 作为空白对照，以掖478的DNA模板作为阴性对照对混合池进行扩增。20 μL的PCR反应体系中含10×PCR缓冲液2 μL，2.0 mmol·L-1 dNTP 2 μL，1 U·μL-1 UNG酶0.16 μL，5 U·μL-1 T aq酶0.15 μL，20 pmol·μL-1 Cry1Ab正、反向引物各1 μL，DNA 2 μL，不足20 μL 时用ddH2O补齐。循环条件：94℃预变性5 min；后35个循环为94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s；72℃后延伸10 min。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像观察。

1.2.8 阳性样本的确认检测 对候选样本进行二次PCR扩增，并筛选出真正的阳性样本。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像观察。

2 结果

2.1 混合池对PCR检测灵敏度的影响

该方法中由于采用了混合样本策略，最高稀释度为各板混合池，即稀释96×。为了保证试验的准确性，需要对PCR反应体系的灵敏性进行检验。分别将ddH2O和阴性DNA模板作为稀释溶液，对Bt176阳性DNA样本进行96×稀释，并用引物（2）进行扩增，产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。将浓度为500 ng·μL-1的阳性样本进行96×稀释时，PCR反应仍具有很高的灵敏性，表明试验中将96份浓度为500 ng·μL-1样本进行混合