microRNA(miRNA)茎环法引物设计及过程原理说明

microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。

首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。

我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。

颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。

第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。

下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解

has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU

将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT

miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授)

has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT

has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC

颈环引物序列：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC -3’

查看形成的发夹结构（方法前面有讲）

看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子：

在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ACACAAAC ACCAT TGTCACACTCCA

查看cDNA结构：

我们知道了cDNA的合成过程和序列，同时学习了miRNA的反转录过程。

下面进入重头戏，教大家如何进行miRNA引物设计。首先如果你的前面实验是芯片的就在miRbase上再查看核对一遍，如果是测序实验的需要将miRNA的名字3p或5p及之前的部分复制到miRAN上查找完整序列。将得到的miRNA完整序列复制到一个excel表中，然后使用查找替换将U改为T（一定要记住改换，要不然primer5.0是不认U的）。

为了后面引物设计方便，需要以miRNA序列构建引物，所以需要将miRNA的cDNA的反向互补序列找出。使用primer5.0。

打开File下拉菜单；New；DNA Sequence。

由于正规设计过程中不会先把cDNA序列找出来，所以直接操作过程为先将miRNA序列（U改T）输入，再输入颈环结构序列的反向互补序列。

复制miRNA序列（U改T）；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择正向序列。

复制颈环结构序列；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择反向互补序列输入Reverse Complemented。

到这一歩cDNA的反向互补序列已经输入完毕，下一歩是在primer5.0上进行引物设计。

1.在序列前面输入9个N（这个是个人习惯，也有人是6个或以

上的A，也有人是不输入就直接设计引物的），因为miRNA序列太短，很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA，所以在

设计正向引物时，一般需要加入3-6个碱基，最多时加入8个碱基，以满足正向引物的设计；

2.点击Function框下的Primer，开始设计上下游引物；

3.有经典颈环结构自然也就少不了常用的下游引物，一般使用C

AGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。同时还可以适当的在颈环序列中前后移动碱基设计下游引物；

4.自动跳出的显示框中默认选择的是下游引物，正好符合先将

常用下游引物输入的操作。下游引物相当比较固定，先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。

5.点击框内的Edit Primers；选择所有引物序列；使用组合键

“Ctrl+V”输入下游引物，输入方式为反向输入Reversed；

点击OK；

点击Analyze分析引物基本信息；点击Prime寻找引物在序列里结合部位；点击OK确定下游引物；

6.点击上下游转换键（图示），开始设计上游引物；点击Edit

Primers；

7.去除前面的9个N；点击Analyze；点击prime；查看前面不

添加序列时的上游引物状况如何。

在这里的主要问题是Tm值太低，第二个问题是长度稍短。

8.绝大多数情况下在前边添加的序列已GC为主，且在加GC序

列时如果序列中间不以AT隔开则TM值上升比值高，同理加AT序列。不要出现GCGC、ATAT、GCCG、或连续4个不同的核苷酸，这些失误会造成引物评分的降低。个人喜欢加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。

9.例如加入ACGGGC（5’端加入，别在3’端）；点击Analyze；

点击prime；查看引物的长度和TM值差不多了就行。当然不是全行了，还要查看引物的自身颈环结构，自身引物配对，重要指标为dG（当然还有其他，哈哈）。下游引物不用看了，

因为是经典嘛，呵呵。点击OK。

10.再查看一下引物对之间的匹对情况，加以对上游引物的修

改，或者更换下游引物。有必要点击比对框下的All查看所以的匹对情况，呵呵，希望你懂的。

11.想做好实验的同学可以在DNAstar的PrimerSelect中进

一步查看引物对的状况，因为这两款软件让人感觉还是有很大不同的。例如PrimerSelect中引物的Tm值会比primer5.

0中底5.5度左右（自己可以试一下）；同时PrimerSelect中对5’端中的匹对情况比较放松（可以用经典下游引物CAGTG CAGGGTCCGAGGTAT看一下）；primer5.0中有的dimer在更变或增减个被核苷酸时会不显示，需要PrimerSelect进一步查看完整的dimer。

12.最后说一下，这个文本只是对最基本的miRNA引物设计进

行说明，很多限制没有向大家说明，如果想做实验的可以联系生物公司让他们帮忙设计一下。或者找比较靠谱的师兄教一下。

13.

引物设计的原理与方法

引物设计的原理与方法 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020

PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列

引物设计基本方法

Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：

引物的原理

引物的原理 引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA 取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点： （1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等） （2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） （3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， 引物长度和专一性 ?常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 ?引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 3’-序列

引物设计原则

1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

引物设计的原理和程序

1 引物的设计以及初步筛选 引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。 ①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False pr iming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。 ②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。 ③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。 ④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol[31。 ⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin)，AG 高于4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。 ⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。 ⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。 ⑧5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物[2]。只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。Primer Premier 5和Oligo 6可以在https://www.wendangku.net/doc/d07156969.html,/soft/下载，primer3的主页位置在h ttp://https://www.wendangku.net/doc/d07156969.html,。 2 引物的二次筛选 引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。本步应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在Genebank 中进行回检。也就是把每条引物在比对工具(https://www.wendangku.net/doc/d07156969.html,/blast/) 的bl astnr中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6 bp的同源。二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如https://www.wendangku.net/doc/d07156969.html,/GENESCAN.html的GENESCA N工具或者GeneParser软，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。

microRNA反转和定量引物设计原理、实验方法

microRNA的引物设计 以ssc-miR-222-3p为例设计引物，其成熟体序列为：AGCTACATCTGGCTACTGGGTCT 反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环， 固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3， 在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是ssc-miR-222-3p从后面数八个碱基的反向互补序列，就是CTGGGTCT的反向互补：AGACCCAG ，最后得到的反向引物的序列为 5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGACCCAG -3， 正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG 在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：AGCTACATCTGGCTACT 5，-ACACTCCAGCTGGG AGCTACATCTGGCTACT -3， URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT 使用方法： 1逆转的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每个10微升 2PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP

2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物） 推荐退火温度：60℃ hsa-miR-124 扩增曲线示意图hsa-miR-124 融解曲线示意图 3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物) 推荐退火温度：60℃ hsa-miR-125b 扩增曲线示意图hsa-miR-125b 融解曲线示意图

引物设计步骤与要点

引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。

LAMP技术原理和引物设计

LAMP原理及引物设计与实例 ．LAMP引物的设计 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同. B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 2．扩增原理 60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 https://www.wendangku.net/doc/d07156969.html,MP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产

microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明

microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。 首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGAC作介绍。打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。

颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。 第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。 下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解 has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU 将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT

miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授) has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC 颈环引物序列： 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACGACACAAAC -3’ 查看形成的发夹结构（方法前面有讲） 看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子： 在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA

引物设计的原理与方法

PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

PCR引物设计原理及原则

PCR引物设计原理及原则 PCR引物设计原理 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。 ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量

引物设计的原理与方法

引物设计的原理与方法 The latest revision on November 22, 2020

PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列

PCR引物设计基本思路

PCR引物设计基本思路 1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区, 即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询 RBS 149..153 /gene="eryF" CDS 158..1372 /gene="eryF" 1 ggatcccgat cgtgtcggag g aa gaggcc a agtcgcgccg ccc cgaccag ctgctggtgc 61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg 121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgt atg acgaccgttc ccgatctcga 181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc 241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc 301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt 361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac 421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga 481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct 541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct 601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg 661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc 721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg 781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc 841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag 901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg 961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc 1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca 1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga 1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat 1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct 1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg 1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacgga t ga gcacctgg 1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg 1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg 1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc 1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc 1621 gccctg ttcg ggcacagcat g ggcgcg ttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa 1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg 1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc 1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg 1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc 1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc

引物设计的标准操作规程

引物设计的标准操作规程（编号：004） 1、软件使用 1.1 推荐软件：Primer Premier 5.0 1.2 优点：操作简单、显示各种参数改变和二聚体、异二聚体、发夹结构等。 1.3 本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar；DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)。 1.4 网上同类软件：Primer3、JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。http://210.7 2.11.60网站已引进并调试好这两种软件。 2、推荐操作 引物搜索：Primer Premier 5.0、引物评价：Oligo 6.22 3、引物设计的原则 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：3.1 引物的长度一般为18-25bp，引物长度过长会导致延伸温度过高，从而影响DNA聚合酶的效率，上下游引物长度差别最好不要大于3bp。 3.2 引物最好在模板DNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。可在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 3.3 引物3′端不能选择A，最好选择T。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 3.4 引物的GC含量一般为40-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值以接近72℃为宜，上下游引物Tm值同样不应相差过大。 3.5 引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 14

LAMP技术原理和引物设计

LAMP原理及引物设计与实例 .LAMP引物的设计 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域,基于靶基因3' 端的 F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer):上游内部引物,由F2区和F1C区域组成,F2区与靶基因3’端的F2c区域互补,F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。 F3引物:上游外部引物(Forward Outer Primer),由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物:下游内部引物(Backward Inner Primer ),由B1C和B2区域组 成,B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补,B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同. B3引物:下游外部引物(Backward Outer Primer ),由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。 2.扩增原理 60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度,DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此, DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合(如图B所示),在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链(如图C所示)。FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。自我碱基配对形成环状结构(如图C所