核酸分子杂交
一. 名词解释:
1. 核酸分子杂交
2. DNA复性
3. Southern杂交
4. Northern杂交
5. 斑点印迹
6. 原位杂交
二. 单项选择题:
1. 在加热或紫外线照射下，可导致两条DNA链中间的氢链断裂，而核酸分子中所有的共价键则不受影响的称为（）。
A. DNA变性
B. DNA复性
C. DNA重组
D. DNA杂交
2.DNA变性的本质是（）的断裂。
A. 盐键
B. 氢键
C. 离子键
D. 共价键
3. 一般影响核酸变性的温度可选在（）。
A. 60—70℃
B. 70—80℃
C. 80—90℃
D. 90—100℃
4. 在核酸分子杂交时，一般对应温度作图得到的DNA复性曲线所用的紫外吸收值是（）。
A. A260吸收值
B. A280吸收值
C. A320吸收值
D. A360吸收值
5. 进行核酸分子杂交时，一般适宜的探针浓度是（ B ）。
A. 0.1μg
B.0.1—0.5μg
C.0.5--1μg
D.1.0—1.5μg
6.杂交时如果使用单链核酸探针，随着溶液中探针浓度的增加，杂交效率也会增加，所以探针长度控制在（）。
A. 50—300bp
B. 20—200bp
C.300—400bp
D.200—500
7.进行核酸杂交时，一般适宜的复性温度较Tm值低（）。
A.10℃
B.15℃
C.20℃
D.25℃
8.寡核酸探针杂交反应一般在低于Tm值（）下进行。
A.5℃
B.10℃
C.15℃
D. 25℃
9. 下列哪种试剂能降低核酸杂交的Tm值（）。
A．尿素 B. 甲酰胺 C.甲醛 D. 乙醇
10. 在凝胶中核酸变性时，为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约（）。
A. 1Kb
B. 2 Kb
C. 3 Kb
D. 4 Kb
11. 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为（）。
A. 原位杂交
B. 核酸酶保护实验
C. 斑点印迹
D. 狭缝印迹
12. 核酸保持在细胞或组织切片中经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为（）。
A. 原位杂交
B. 核酸酶保护实验
C. 斑点印迹
D. 狭缝印迹
13. 在将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，称为（）。
A. 杂交
B. 预杂交
C. 杂交前处理
D. Nouthern印迹杂交
14. 进行间期细胞内染色体DNA的原位杂交时，关键是（）。
A. 细胞的培养
B. 加固定液
C. 载波片上的固定
D. 细胞染色体的制备
15. 组织细胞杂交前的预处理的关键是（）。
A. 降解细胞外蛋白
B. 降解细胞内蛋白
C. 降解核酸表面蛋白
D. 降解核酸内DNA
16. 组织细胞杂交前预处理时，降解核酸表面的蛋白质常用的蛋白酶是（）。
A. 蛋白酶C
B. 蛋白酶K
C. 蛋白酶A
D. 蛋白酶I
17. 在进行原位杂交时，RNA探针杂交的时间最好是（）。
A. 2—4h
B. 4—6h
C. 6—8h
D. 过夜
18. 在核酸杂交中，目前应用最为广泛的一种探针是（）。
A. 基因组DNA探针
B. 寡核苷酸探针
C. cDNA探针
D. RNA探针
19. 在Southern印迹杂交中用来标记核酸探针最常用的核素是（）。
A. 32P
B. 3H
C. 35S
D. 125I
20．在下列非核素标记物中，既属于半抗原，同时也属于配体的是（）。
A. 地高辛
B. 生物素
C. 亲合素
D. 罗丹明
21.一些标记物可与某种物质反应产生化学发光现象，通过化学发光可以象核素一样直接使X线胶片上的乳胶颗粒感光。这些标记物称为（）。
A.半抗原
B.配体
C.荧光素
D.化学发光探针
22. Sephadex G—50 柱析法中，随着流动相流出的是（）。
A.小分子物质
B. dA TP
C.大分子探针
D. dGTP
23. 下列DNA分子的组成中，哪种是核酸变性的最主要的因素（）。
A. A T
B. AG
C. GC
D. TC
24. 在探针的纯化时，无水乙醇可以沉淀（）。
A．DNA片段 B. 蛋白质分子
C．RNA片段 D. 小分子物质
25. 待测DNA样品的电泳分离中，作为分子量标准的λDNA是用（）酶消化的。
A. HindⅢ
B. BglI
C. ApaI
D. BamHI
三. 多项选择题:
1. 导致DNA变性的常用方法有（）。
A. 热变性
B. 碱变性
C. 酸变性
D. 化学试剂变性
2. 影响核酸杂交的因素有（）。
A. 核酸分子的浓度和长度
B. 温度
C. 离子浓度
D. 核酸分子的复杂性
3. 核酸分子处于何种情况下，核酸的双链可以完全打开成为单链（）。
A. PH＜3
B. 3＜PH＜5
C. 5＜PH＜10
D. PH＞10
4. 在杂交液中加入甲酰胺，其目的是（）。
A. 在低温下探针更稳定
B. 使杂交液为中性
C. 能更好的保留非共价结合的核酸
D. 减少核酸杂交的副反应
5. 为减少非特异性杂交反应，在杂交前将非特异性杂交位点进行封闭，常用的封闭物有（）。
B. 复性的非特异性RNA
C. 变性的非特异性DNA
D. 高分子化合物
E. 低分子化合物
6. 下列哪些步骤属于Southern印迹杂交（）。
A. 待测核酸样品的制备
B. 待测DNA样品的电泳分离
C. 凝胶中核酸的变性
D. Southern转膜
7. Southern转膜时常用的膜是（）。
A. 化学活化膜
B. 尼龙膜
C. 硝酸纤维素膜
D. 滤纸
8. 常用的Southern转膜方法有哪几种（）。
A. 硝酸纤维素膜法
B. 毛细管虹吸印迹法
C. 电转印法
D. 真空转移法
9. 用于Southern印迹杂交的探针可以是（）。
A. 纯化的DNA片段
B. 纯化的RNA片段
C. 多核苷酸
D. 寡核苷酸片段
10. 原位杂交可以用来检测（）。
A. DNA
B. RNA
C. cDNA
D. RNA和DNA
11. 原位杂交所用的探针可以是（）。
A. mRNA
B. DNA
C. RNA
D. cDNA
12. Northern印迹杂交中转膜时可采用的方法有（）。
A. 毛细管虹吸印迹法
B. 电转印法
C. 真空转移法
D. 凝胶分离法
13. 核酸原位杂交包括（）。
A. 组织细胞的固定
B. 预杂交
C. 杂交
D. 冲洗
14. 下列哪些属于核酸原位杂交的常用固定液（）。
A. 10%甲醛
B. 4%多聚甲醛
C. 乙醇：冰醋酸（3：1）
D. 戊二醛
15. RNA酶保护分析法可用于（）。
A. mRNA定量
B. mRNA定性
C. mRNA末端定位
D. 确定内含子在相应基因中
16. 核酸酶S1能降解（）。
A. DNA单链
B. DNA双链
C. RNA单链
D. DNA/RNA杂交双链
17. 根据检测方法的不同，非核素标记物可分为以下几类（）。
A. 半抗原
B. 配体
C. 荧光素
D. 化学发光探针
18. 下列物质属于半抗原的是（）。
A. 亲和素
B. 罗丹明
C. 生物素
D. 地高幸
19. 核酸分子杂交所用探针采用体外标记法的优点是（）。
A.安全系数高
B.需要活体生物或细胞培养系统
C.探针，核酸分离和纯化及储存很方便
D.体外标记一般比体内标记的比放射活性高
20. 化学法体外标记核酸探针最常用的是（）。
A. 125I
B. 光敏生物素
C. 3H
D. 32P
21. DNA探针的酶促标记法包括（）。
A. 缺口平移法
B. 随机引物法
C. PCR标记法
D. 末端标记法
22. 探针的纯化包括（）。
A．乙醇沉淀法 B. SephadexG-50
C. 甲醇沉淀法
D. 丝柱离心法
23 DNA变性后的理化性质的变化有（）。
A. 粘度降低
B. 密度增加
C. 紫外吸收值增加
D. 熔点减小
24. Southern杂交结果检测包括（）。
A．放射自显影 B. 比色或化学发光检测
C. 酶切图谱分析
D. 凝胶电泳分离
25. Southern杂交在医学中的应用包括（）。
A. 酶切图谱分析
B. 特定基因定性和定量
C. 基因突变分析
D. 限制性片段长度多态性的分析
四. 填空题:
1. 核酸分子杂交中，杂交的双方分别称为与。
2. 核酸分子杂交中已知的核酸序列称为。
3. 适当的电泳缓冲液中，DNA在电场作用下，由负极向正极泳动，分子越大，泳动速度。
4. 当促使变性的因素解除后，两条DNA又通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构，称为。
5. 在DNA的碱基组成中，A T之间是氢键，GC之间是氢键。
6. 鉴别DNA靶分子的杂交称为，鉴别RNA靶分子的杂交称为。
7. 根据检测对象的不同，可将原位杂交分为和。
8. 常用的液相杂交有和。
9．RNA酶保护分析法（RPA）的基本程序包括：、、、、。
10. 液相杂交的核酸酶S1保护分析法可用于、、和。
11. 核酸探针包括：、、和。
12. 在用核酸标记的探针，大多数标记方法需要的是α-32P，末端标记必须使用。
13.核酸的体外标记法分为和。
14.核酸的体外标记法中的酶法最常用的是和标记。
五、简答题
1、DNA变性的常用方法有哪几种？
2、简述DNA的复性过程。
3、一个良好固相支持物应具备哪些特性？
4、试比较硝酸纤维素膜、尼龙膜和化学活化膜的优缺点。
5、核酸原位杂交的理想固定液应具备哪些特点？
6、一种理想标记物应具备哪些特性？
7、随机引物法标记DNA探针有哪些优点？
六、论述题
1、试述核酸分子杂交的原理。
2、试述影响核酸分子杂交的因素。
3、试述Southern印迹杂交的基本步骤。
4、试述Southern印迹的常用方法及原理。
5、试述核酸原位杂交的基本过程。
6、试述探针的种类及其制备。
7、试述切口平移法标记DNA探针的原理。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。 cDNA微点隈杂交（cDNA microarray hybridization） 是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如：尼龙膜或
第八章核酸分子杂交技术习题
第八章核酸分子杂交技术 习题 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
第八章核酸分子杂交技术 一．选择题 【A型题】 1.DNA链的Tm值取决于核酸分子的 A.G-C含量 B.A-T含量 C.A-G含量 D.A-C含量 E.T-G含量 2.研究得最早的核酸分子杂交种类是 A.菌落杂交 B. Southern杂交 C. Northern杂交 D.液相杂交 E.原位杂交 3.Southern杂交通常是指 A．DNA和RNA杂交 B．DNA和DNA杂交C．RNA和RNA杂交 D．蛋白质和蛋白质杂交 E．DNA和蛋白质杂交 4.基因芯片技术的本质是 A.核酸分子杂交技术 B.蛋白质分子杂交技术 C.聚合酶链反应技术 D.基因重组技术 E.酶切技术 5.寡糖苷酸探针的最大的优势是 A.杂化分子稳定 B.可以区分仅仅一碱基辑差别的靶序列 C. 易标记 D.易合成 E.易分解 6.血友病是一种 A.染色体病 B.X链锁遗传病 C.先天性代谢缺陷病 D.先天 畸形 E.常染色体隐性遗传病
7.检测的靶序列是RNA的技术是 A. Southern杂交 B. Western杂交 C. Northern杂交 D. Eastern杂交 E.杂交淋巴瘤 8. 检测的靶序列是DNA的技术是 A. Southern杂交 B. Western杂交 C. Northern杂交 D. Eastern杂交 E.杂交淋巴瘤 9.DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 10.具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 11.一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 12.标记的参与杂交反应的核酸分子，称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 13.点/缝杂交可以用于 A.快速确定是否存在目的基因 B.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息 C.用于基因定位分析
核酸分子杂交技术与应用综述样本
核酸分子杂交技术与应用综述 摘要核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它是基于DNA分子碱基互补配对原理, 用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形式的不同能够分为液相杂交、固相杂交、原位杂交, 而固相杂交又能够分为菌落杂交、点/狭缝杂交、 Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。各类型杂交稻基本原理和步骤是基本相同的, 只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。 关键字核酸分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交应用 本文是对分子杂交技术的原理和类型分类及其应用的一篇综述。旨在了解各种杂交类型的应用方向, 即在生物、医学上的应用。 一、核酸分子杂交原理 DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构, 维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。在一定条件下, 双螺旋之间氢键断裂, 双螺旋解开, 形成无规则线团, DNA分子成为单链, 这一过程称作变性或融解。加热、改变DNA融解的pH 值, 或有机溶剂等理化因素, 均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降, 沉降速度增加, 浮力上升, 紫外光吸收增加。在温度升高引起的DNA变性过程中, DNA的变性会在一个很狭窄的 温度范围内发生, 这一温度范围的重点被称作融解温度T m 。T m 值得大小取决于核酸分子的G-C 含量, 核酸分子的G-C含量越高, 其T m 值越高。因为G-C碱基之间有三个氢键, 而A-T碱基之间只有两个氢键。变性DNA只要消除变性条件, 具有碱基互补的单链又能够重新结合形成双链, 这一过程称作复性。根据这一原理, 将一种核酸单链标记成为探针, 再与另一种核酸单链进行碱基互补配对, 能够形成异源核酸分子的双链结构, 这一过程称作杂交( hybridization) 。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补, 因此不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就能够形成杂交体。 二、核酸分子杂交类型 ( 一) 固相杂交
核酸的分子杂交技术及其应用
核酸的分子杂交技术及其应用 1概述 核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。 在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。它常常用放射性同位素来标记。 虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。 2核酸探针的制备 核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法： 2.1DNA的切口平移 双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。 2.2单链DNA探针的制备 与传统的双链探针相比，单链探针由于不存在互补链，因此可以消除由探针的两条链重退火形成无效杂交体的可能。最常用的是以M13噬菌体载体合成单链DNA探针的方法。其主要原理是用人工合成的寡核苷酸引物(其序列与载体上固定区段的序列相互补。可从生物试剂公司直接购买)与来自重组M13噬菌体的单链DNA退火，然后以此寡核苷酸作为引物在大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段催化下合成互补的放射性标记DNA。 2.3单链RNA探针的制备 首先将感兴趣的DNA序列到带有SP6噬菌体或T7及T3噬菌体的启动子的重组载体质粒中。由于这些重组质粒带有的强启动子能被噬菌体的依赖DNA的RNA聚合酶所识别。因此，当把线状质粒与适当的依赖DNA的RNA聚合酶及4种rNTP(核糖核苷三磷酸)在体外混合并温育时，就可在噬菌体启动子处开始合成RNA。 单链RNA探针除具有单链DNA探针的优点之外，还具有：①合成效果高(模板可反复被转录)；②
第八章 核酸分子杂交技术习题
第八章核酸分子杂交技术 一．选择题 【A型题】 1.DNA链的Tm值取决于核酸分子的 A.G-C含量 B.A-T含量 C.A-G含量 D.A-C含量 E.T-G含量 2.研究得最早的核酸分子杂交种类是 A.菌落杂交 B. Southern杂交 C. Northern杂交 D.液相杂交 E.原位杂交 3.Southern杂交通常是指 A．DNA和RNA杂交B．DNA和DNA杂交C．RNA和RNA杂交D．蛋白质和蛋白质杂交E．DNA和蛋白质杂交 4.基因芯片技术的本质是 A.核酸分子杂交技术 B.蛋白质分子杂交技术 C.聚合酶链反应技术 D.基因重组技术 E.酶切技术 5.寡糖苷酸探针的最大的优势是 A.杂化分子稳定 B.可以区分仅仅一碱基辑差别的靶序列 C.易标记 D.易合成 E.易分解 6.血友病是一种 A.染色体病 B.X链锁遗传病 C.先天性代谢缺陷病 D.先天畸形 E.常染色体隐性遗传病
7.检测的靶序列是RNA的技术是 A. Southern杂交 B. Western杂交 C. Northern杂交 D. Eastern杂交 E.杂交淋巴瘤 8. 检测的靶序列是DNA的技术是 A. Southern杂交 B. Western杂交 C. Northern杂交 D. Eastern杂交 E.杂交淋巴瘤 9.DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 10.具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 11.一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 12.标记的参与杂交反应的核酸分子，称 A.变性 B.复性 C.复杂性 D.杂交 E.探针 13.点/缝杂交可以用于 A.快速确定是否存在目的基因 B.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息 C.用于基因定位分析
核酸分子杂交
核酸分子杂交 概念及特点：核酸分子杂交技术的基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补配对成双链，用特异性的探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子的过程。核酸分子杂交技术主要有以下几种：Southern杂交、Northern杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）、芯片杂交。核酸杂交技术具有其高度特异性、灵敏性、快速等特点。 在环境监测中的应用：核酸分子杂交技可以快速检测出环境微生物中独特的核酸序列。如对活性污泥中的特定微生物的生长速率进行测定，根据放射性强度可以定量分析特定细菌的DNA量。在对被石油污染的土壤分析中，用核酸杂交法得到某种烃降解基因的检出率显著高于不污染样品，结果表明，污染越严重，这种降解基因的含量也越高，可用来评价中石油污染程度。 荧光原位杂交技术（FISH）是核酸原位杂交技术中应用最为广泛的技术之一。该技术结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，无需单独分离出DNA或RNA，通过激发杂交探针的荧光来检测信号从而对未知的核酸序列进行检测，结果可直接在荧光显微镜下观察。GulnurCoskuner认为FISH技术能揭示更多硝化细菌的微生物学方面的信息及它们种群的大小，更有利于改进生物脱氮系统的工艺，避免了传统的、用培养方法计数带来的偏差。彭永臻等列举了FISH在活性污泥细菌检测，高效生物除磷（EBPR）反应器微生物群落的测定、污水处理微生物检测等方面的应用。 一、核酸分子杂交应用于物种之间亲缘关系的鉴定。把取自两种不同生物体细胞的DNA 进行RCR扩增，并同时带上不同的放射性标记。然后将其混合在一起，先高温解链，再低温复性。来自两种不同生物的DNA分子单链中的互补区域就可以互补配对。互补配对的区域越大，说明亲缘关系越近。 二、基因诊断：用带有标记的已知缺陷基因的特异性片段做探针，通过和待测样品DNA 中进行分子杂交，检测被测样品中是否含有缺陷基因。 三、疾病诊断：用带有放射性标记的病毒核酸的特异性片段做探针，检测待测者血液中是否含有该病毒。 四、和上面的疾病诊断相似，可以用核酸分子杂交法检测水被某种病毒感染的程度。 五、在基因工程中，用核酸杂交法检验目的基因是否导入受体细胞和目的基因是否在受体细胞中转录出了相应的mRNA。 除了核酸分子杂交法外，还有抗原-抗体杂交法，实际上是利用抗原和抗体的特异性结合。由于单克隆抗体技术的发展，此法在疾病诊断中具有特异性强、灵敏度高等优点。着两种方法都可以广泛的应用于环境监测中。 1、细胞遗传学分析 ①产前诊断：在新生儿的先天性疾病中，染色体的数目异常要占很大的一部分，其中以染色体X、Y、13、18和21数量的异常最为多见。利用FISH技术的优势还可以用于产前诊断中的羊水细胞核型分析。常规的染色体型分析技术需要对羊水细胞进行培养，时间较长。FISH技术可以在少量的羊水细胞涂片上进行异常染色体的数目分析，不需要羊水细胞的培养，记得地缩短了病人等待的时间。
核酸分子杂交的种类及应用
核酸分子杂交 摘要:核酸分子杂交技术就是基因工程中重要的研究手段,就是目前生物化学、分子生物学、与细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。也就是现阶段定性、定量与定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。本文主要介绍了核酸分子的原理,分类以及它的相关应用。 关键词:核酸分子;分类;应用; 1、核酸杂交技术的原理 核酸分子(DNA、RNA)就是由许多单核苷酸分子通过3,5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。DNA分子双链的形成,DNA的复制,以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。DNA就是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用,则形成单链分子,称为核酸“变性”。两条单链核甘酸若有同源顺序,则在一定条件下,她们的碱基互补配对,从而形成双链分子,称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。核酸分子杂交就是用核酸分子的变性,复性等理化性质而设计的一种常用技术。通常利用一种顺序已知,并被放射性同位素标记的核酸片段瞧作为探针,与未知样品的核酸进行分子杂交,如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上,用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。 核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交与原位杂交[3]。 2、固相分子杂交: 将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,而标记的探针则游离在溶液中,进行杂交反应后,使杂交分子留在支持物上,然后再进行检测与计算。 固相分子杂交又可分为:Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。 2、1 Southern印迹杂交 1975年建立的一种DNA转移方法。该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。首先用酚提法从待检测组织中提取DNA,然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段,接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离,电泳完毕后,将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性,解离为两条单链。再在凝胶上贴上硝酸纤维素膜,使凝胶上的单链DNA区带按原来的位置吸印到膜上。然后直接在膜上进行核酸探针(已被同位素标记)与被测样品之间的杂交,再通过放射自显影对杂交结果进行检测[4]。 2、2 Northern印迹杂交 1976年Alwine建立了该方法。这就是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。其检测过程与Southern转移杂交基本相同,所不同的就是用DNA探针检测经凝胶电泳分开的RNA分子。它主要用于研究基因的转录活性及表达[5]。 2、3 Western印迹杂交 Western印迹就是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后转移至到固相载体上,然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白,分析基因的表达程度。
核酸分子杂交(精)
一. 名词解释: 1. 核酸分子杂交 2. DNA复性 3. Southern杂交 4. Northern杂交 5. 斑点印迹 6. 原位杂交 二. 单项选择题: 1. 在加热或紫外线照射下，可导致两条DNA链中间的氢链断裂，而核酸分子中所有的共价键则不受影响的称为（）。 A. DNA变性 B. DNA复性 C. DNA重组 D. DNA杂交 2.DNA变性的本质是（）的断裂。 A. 盐键 B. 氢键 C. 离子键 D. 共价键 3. 一般影响核酸变性的温度可选在（）。 A. 60—70℃ B. 70—80℃ C. 80—90℃ D. 90—100℃ 4. 在核酸分子杂交时，一般对应温度作图得到的DNA复性曲线所用的紫外吸收值是（）。 A. A260吸收值 B. A280吸收值 C. A320吸收值 D. A360吸收值 5. 进行核酸分子杂交时，一般适宜的探针浓度是（ B ）。 A. 0.1μg B.0.1—0.5μg C.0.5--1μg D.1.0—1.5μg 6.杂交时如果使用单链核酸探针，随着溶液中探针浓度的增加，杂交效率也会增加，所以探针长度控制在（）。 A. 50—300bp B. 20—200bp C.300—400bp D.200—500 7.进行核酸杂交时，一般适宜的复性温度较Tm值低（）。 A.10℃ B.15℃ C.20℃ D.25℃ 8.寡核酸探针杂交反应一般在低于Tm值（）下进行。 A.5℃ B.10℃ C.15℃ D. 25℃ 9. 下列哪种试剂能降低核酸杂交的Tm值（）。 A．尿素 B. 甲酰胺 C.甲醛 D. 乙醇 10. 在凝胶中核酸变性时，为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约（）。 A. 1Kb B. 2 Kb C. 3 Kb D. 4 Kb 11. 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为（）。 A. 原位杂交 B. 核酸酶保护实验 C. 斑点印迹 D. 狭缝印迹 12. 核酸保持在细胞或组织切片中经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为（）。 A. 原位杂交 B. 核酸酶保护实验 C. 斑点印迹 D. 狭缝印迹
第八章 核酸分子杂交技术
第八章核酸分子杂交技术 主要用途：①核酸定性或定量检测；②基因克隆、突变及其表达研究；③疾病的临床诊断。 第一节核酸杂交概述及基本原理 一、核酸杂交概述 ?1961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体； ?60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素(NC)膜上的DNA序列奠定了基础； ?70年代末期到80年代早期，分子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富； ?80年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高； ?90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、 检测效率低等不足。 核酸的结构：一级结构：核苷酸的排列循序，稳定键为磷酸二酯键； 二级结构：双螺旋结构，稳定键为氢键、碱基堆积力、疏水键； 高级结构：染色体 二、核酸变性 核酸变性(nucleic acid denaturation)：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构 的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。 ?化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。 ?化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。 DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。 如加热；极端的pH；有机试剂(甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等) 变性DNA的性质：变性能导致DNA的一些理化性质及生物学性质发生改变 ①溶液黏度降低---DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性 结构，DNA黏度明显下降。 ②溶液旋光性发生改变---变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。 ③紫外吸收增加---DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强，双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸。变性DNA的增色效应 增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 ?DNA分子在250-280nm 波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。 ?增色效应可以作为DNA变性的指标。 ?不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20-30%之间。 解链曲线：通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度(A260)的增加来监测DNA变性的过程。如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型DNA变性曲线呈S型。
核酸分子杂交试题(全,打印)
核酸分子杂交试题 一. 名词解释: 1. 核酸分子杂交 2. DNA复性 3. Southern杂交 4. Northern杂交 5. 斑点印迹 6. 原位杂交 二. 单项选择题: 1. 在加热或紫外线照射下，可导致两条DNA链中间的氢链断裂，而核酸分子中所有的共价键则不受影响的称为（）。 A. DNA变性 B. DNA复性 C. DNA重组 D. DNA杂交 2.DNA变性的本质是（）的断裂。 A. 盐键 B. 氢键 C. 离子键 D. 共价键 3. 一般影响核酸变性的温度可选在（）。 A. 60—70℃ B. 70—80℃ C. 80—90℃ D. 90—100℃ 4. 在核酸分子杂交时，一般对应温度作图得到的DNA复性曲线所用的紫外吸收值是（）。 A. A260吸收值 B. A280吸收值 C. A320吸收值 D. A360吸收值 5. 进行核酸分子杂交时，一般适宜的探针浓度是（ B ）。 A. 0.1μg B.0.1—0.5μg C.0.5--1μg D.1.0—1.5μg 6.杂交时如果使用单链核酸探针，随着溶液中探针浓度的增加，杂交效率也会增加，所以探针长度控制在（）。 A. 50—300bp B. 20—200bp C.300—400bp D.200—500 7.进行核酸杂交时，一般适宜的复性温度较Tm值低（）。 A.10℃ B.15℃ C.20℃ D.25℃ 8.寡核酸探针杂交反应一般在低于Tm值（）下进行。 A.5℃ B.10℃ C.15℃ D. 25℃ 9. 下列哪种试剂能降低核酸杂交的Tm值（ B ）。 A．尿素 B. 甲酰胺 C.甲醛 D. 乙醇 10. 在凝胶中核酸变性时，为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约（）。 A. 1Kb B. 2 Kb C. 3 Kb D. 4 Kb 11. 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为（）。
习题2核酸分子杂交技术
. 第二章核酸杂交技术 （一）名词解释 1．原位杂交 2．核酸分子杂交技术 3．探针 4．反向点杂交 5．缺口平移标记法 6．随机引物标记法 7．末端标记法 8．Southern blot杂交 9．荧光原位杂交 10．菌落杂交 （二）选择题 【A型题】 1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（） A G－C含量 B A－T含量 C A－G含量 D A－C含量 E T－G含量 2．液相杂交是下列哪一种（） A Southem印迹杂交 B Northem印迹杂交 C Dot印迹杂交 D Slot印迹杂交 E RPA实验 3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（） A 菌落杂交 B Southern杂交 C Northern杂交 D 液相杂交 E 原位杂交 4．Southern杂交通常是指（） A DNA和RNA杂交 B DNA和DNA杂交 C RNA和RNA杂交 D 蛋白质和蛋白质杂交 E DNA和蛋白质杂交 5．最容易降解的核酸探针是( ) A cDNA探针 B dsDNA探针 C ssDNA探针 D gDNA探针 E: RNA 6．探针基因芯片技术的本质就是（） A 核酸分子杂交技术 B 蛋白质分子杂交技术
. C 聚合酶链反应技术 D 基因重组技术 E 酶切技术 7．DNA探针的长度通常为( ) A 1000 ～2000个碱基 B 500 ～1000个碱基 C 400 ～500个碱基 D 100 ～400个碱基 E. <100个碱基 8．寡核苷酸探针的最大的优势是（） A 杂化分子稳定 B 可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列 C 易标记 D 易合成 E 易分解 9．在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( ) A 甲醛 B 乙醛 C 氢氧化钠 D 碳酸钠 E 盐酸 10．盐酸硝酸纤维素膜最大的优点是（） A 脆性大 B 本底低 C 共价键结合 D 非共价键结合 E 高结合力 11．最常用的DNA探针标记方法是( ) A 随机引物 B 切口平移 C 3′-末端标记 D 5′-末端标记 E PCR法 12．为了除去探针，重复使用滤膜，以下哪种情况不可以发生（） A 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经干燥过 B 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经湿润过 C 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经温浴过 D 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经漂洗过 E 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经标记过 13．5′一末端的DNA探针标记主要依靠的酶是( ) A T4多聚核苷酸激酶 B 末端转移酶 C AKP
核酸分子杂交的种类及应用
核酸分子杂交 摘要：核酸分子杂交技术是基因工程中重要的研究手段，是目前生物化学、分子生物学、和细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。也是现阶段定性、定量和定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术和方法。本文主要介绍了核酸分子的原理，分类以及它的相关应用。 关键词：核酸分子；分类；应用； 1.核酸杂交技术的原理 核酸分子（DNA、RNA）是由许多单核苷酸分子通过3，5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。DNA分子双链的形成，DNA的复制，以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。DNA是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用，则形成单链分子，称为核酸“变性”。两条单链核甘酸若有同源顺序，则在一定条件下，他们的碱基互补配对，从而形成双链分子，称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。核酸分子杂交是用核酸分子的变性，复性等理化性质而设计的一种常用技术。通常利用一种顺序已知，并被放射性同位素标记的核酸片段看作为探针，与未知样品的核酸进行分子杂交，如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上，用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。 核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交和原位杂交[3]。 2.固相分子杂交： 将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，然后再进行检测和计算。 固相分子杂交又可分为：Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。 2.1 Southern印迹杂交 1975年建立的一种DNA转移方法。该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。首先用酚提法从待检测组织中提取DNA，然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段，接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离，电泳完毕后，将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性，解离为两条单链。再在凝胶上贴上硝酸纤维素膜，使凝胶上的单链DNA区带按原来的位置吸印到膜上。然后直接在膜上进行核酸探针（已被同位素标记）与被测样品之间的杂交，再通过放射自显影对杂交结果进行检测[4]。 2.2 Northern印迹杂交 1976年Alwine建立了该方法。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。其检测过程与Southern转移杂交基本相同，所不同的是用DNA探针检测经凝胶电泳分开的RNA分子。它主要用于研究基因的转录活性及表达[5]。 2.3 Western印迹杂交 Western印迹是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。
核酸分子杂交技术简介及其应用
班级生物硕01 姓名牛浩学号 20172120470 核酸分子杂交技术简介及其应用 摘要：本文简要介绍了核酸分子杂交技术的基本概念及其原理，它的杂交类型，包括斑点杂交、细菌的原位杂交技术、Southern吸印杂交和Northern吸印杂交。探讨了核酸分子杂交技术的研究应用，最后对核酸分子杂交技术做出了相应的研究展望。 关键词：核酸分子杂交技术；概念；原理；杂交类型；研究应用；展望 1 基本概念及原理 核酸分子杂交技术是基因工程中重要的研究手段，是目前生物化学、分子生物学和细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。也是现阶段定性、定量和定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。由于其特异性强，灵敏度高、定位准确等优点，目前已被广泛应用于分子生物学、生理学、遗传学、病毒学等基础学科的研究。 DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度T m。T m值得大小取决于核酸分子的 G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其T m值越高。因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键[1]。变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。
核酸分子杂交的原理和实验方法
核酸分子杂交的原理和实验方法 原理 所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。 免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。 操作程序 (1) 随机引物标记操作程序如下： ①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。 ②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。 ③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。 ④置37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。 ⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。 可根据下表估计标记产量： DNA模板量标记一小时标记二十小时 10ng 45ng 600ng 30ng 130ng 1050ng 100ng 270ng 1500ng 300ng 450ng 2000ng 1000ng 850ng 2300ng 3000ng 1350ng 2650ng (2)核酸探针膜上杂交原理和操作 （一）杂交总原则 脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使氢键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链，DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。 （二）杂交膜的选择 杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸5-10分钟后去除探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。 （三）探针浓度 探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又
核酸分子杂交方法
所谓基因芯片又称为DNA微阵列(DNA micro array)，是按特定的排列方式排列固定有大量基因片段(可以是相同的基因片段，也可以是不同的)的硅片，玻璃片或塑料片。它的工作原理是将样品加在芯片上，通过分子杂交方式对样品进行分析，从而大规模高效地获取相关的生物信息。基因芯片技术作为一项新技术，具有快速、准确、灵敏等特点，又能同时检测大量样品，在食品安全检测领域必将发挥重大的作用。基因芯片可同时对数以千计的DNA片断同时进行处理分析。基因芯片技术的主要特点为：技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低。 核酸分子杂交的方法 由于分子生物学技术的迅猛发展,特别是20世纪70年代末到80年代初,分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功,核酸自动合成仪的诞生,大大丰富了核酸探针的来源,新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。石家庄乐牧贸易有限公司提供单项维生素。 核酸分子杂交按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定于固体基质上,一条参加反应的核酸链游离在溶液中,故也称为膜上印迹杂交。固体基质有硝酸纤维素滤膜,其他如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等。液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中,使之形成杂交复合物,不需固定支持物,反应束后,用羟基磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交链分开。 在固相杂交中,未杂交的游离片段可容易地漂洗除去,膜上留下的杂交物容易检测,能防止靶DNA自我复性等优点,所以比较常用。常用的固相杂交类型有菌落原位杂交、斑点杂交法、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和组织原位杂交,即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。 液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型,反应条件均一,各种反应参数容易确定,反应速度快,通常是固相杂交反应速度的5～10倍,但由于液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高,所以不如固相杂交那样普遍。近几年,由于杂交检测技术的不断改进,商业性基因探针诊断盒的实际应用,推动了液相杂交技术的迅速发展。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。石家庄乐牧贸易有限公司提供单项维生素。 ?蛋白质蝎子的营养是生命活动的基础 ?节肢动物体腔和血液循环系统和呼吸器官和排泄器官 ?蚯蚓饲料分为基础饲料和添加饲料及蚯蚓饲料堆积发酵方法 ?水蛭的天敌和水蛭在炎夏和严冬如何防止死亡 ?水蛭的形态特征：宽体金线蛭、日本医蛭等 ?林蛙的生活习性：水生生活期和陆生生活期 ?龟主要疾病防治:龟肺炎病 ?如何预防乌龟疾病的发生？ ?鳖的真菌性疾病：白斑病、肤霉病 ?亲鳖选择：雌、雄鳖的识别、健壮亲鳖选择、亲鳖年龄选择
习题核酸分子杂交技术
第二章核酸杂交技术 （一）名词解释 1．原位杂交 2．核酸分子杂交技术 3．探针 4．反向点杂交 5．缺口平移标记法 6．随机引物标记法 7．末端标记法 8．Southern blot杂交 9．荧光原位杂交 10．菌落杂交 （二）选择题 【A型题】 1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（） A G－C含量 B A－T含量 C A－G含量 D A－C含量 E T－G含量 2．液相杂交是下列哪一种（） A Southem印迹杂交 B Northem印迹杂交 C Dot印迹杂交 D Slot印迹杂交 E RPA实验 3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（） A 菌落杂交 B Southern杂交 C Northern杂交 D 液相杂交 E 原位杂交 4．Southern杂交通常是指（） A DNA和RNA杂交 B DNA和DNA杂交 C RNA和RNA杂交 D 蛋白质和蛋白质杂交 E DNA和蛋白质杂交 5．最容易降解的核酸探针是( ) A cDNA探针 B dsDNA探针 C ssDNA探针 D gDNA探针 E: RNA 6．探针基因芯片技术的本质就是（） A 核酸分子杂交技术 B 蛋白质分子杂交技术 C 聚合酶链反应技术 D 基因重组技术 E 酶切技术 7．DNA探针的长度通常为( ) A 1000 ～ 2000个碱基 B 500 ～ 1000个碱基 C 400 ～ 500个碱基 D 100 ～ 400个碱基 E. <100个碱基 8．寡核苷酸探针的最大的优势是（） A 杂化分子稳定 B 可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列 C 易标记 D 易合成 E 易分解 9．在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( ) A 甲醛 B 乙醛
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进
核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术 一、核酸分子杂交 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。 待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。 二、核酸分子杂交的分类 液相杂交核算分子杂交 印记杂交 固相杂交 原位杂交 1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。 2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。 常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭 缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。 三、核酸分子杂交的基本原理 1、变性： 在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。 ﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 ﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。 ﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。 增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。 DNA热变性现象 双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。 增色效应和减色效应 当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。